一种用于阿尔茨海默症的纳米自噬诱导剂及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 一种用于阿尔茨海默症的纳米自噬诱导剂及其制备方法与应用 (Nano autophagy inducer for Alzheimer's disease and preparation method and application thereof ) 是由 王子华 胡志远 杨志敏 于 2021-08-27 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物医学技术领域,本发明提供一种用于阿尔茨海默症的纳米自噬诱导剂及其制备方法与应用。本发明提供的纳米自噬诱导剂的活性成分为NAD+和Beclin-1自噬多肽,本发明所提供的纳米自噬诱导剂既能减少活性氧导致的神经炎症,同时又能调节线粒体自噬并通过自噬降解Aβ,降低Aβ的神经毒性。本发明通过减少活性氧导致的神经炎症与自噬降解Aβ,来协同治疗阿尔茨海默症,为神经退行性疾病的治疗提供一种新的思路。(The invention relates to the technical field of biomedicine, and provides a nano autophagy inducer for Alzheimer's disease and a preparation method and application thereof. The active ingredients of the nano autophagy inducer provided by the invention are NAD + and Beclin-1 autophagy polypeptide, and the nano autophagy inducer provided by the invention not only can reduce neuroinflammation caused by active oxygen, but also can regulate mitochondrion autophagy, degrade A beta through autophagy and reduce neurotoxicity of the A beta. The invention synergistically treats the Alzheimer disease by reducing neuroinflammation caused by active oxygen and degrading Abeta through autophagy, and provides a new idea for treating neurodegenerative diseases.)
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种用于阿尔茨海默症的纳米自噬诱导剂及其制备方法与应用，尤其涉及一种线粒体自噬激活的多肽聚合物纳米材料的制备和在防治阿尔茨海默症中的应用。
背景技术
神经退行性疾病成为当今社会和医疗机构必须要面对的重大问题。神经退行性疾病的治疗是各国普遍关注和亟待解决的医学难题，但迄今为止临床上无切实有效的治疗方法。
阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是最常见的与年龄相关的神经退行性疾病之一，其临床表现包括进行性记忆障碍、认知功能障碍和语言障碍。AD作为一种老年人的常见病、多发病和高负担疾病，已经成为全球科学家们最关注的领域之一。阿尔茨海默氏病的发病机制尚不清楚，但AD的主要神经病理学特征包括细胞外淀粉样蛋白-β(amyloid-β，Aβ)导致的神经炎性斑(老年斑)、细胞内tau蛋白过度磷酸化导致的神经元纤维缠结以及神经元和神经突触的缺失，导致临床观察到的患者记忆和认知能力的丧失。
帕金森病(Parkinson’s disease，PD)在年龄60岁以上的人群中患病率为1％，主要表现为震颤等运动功能障碍，这是由多巴胺能神经元的退化引起的。主要病理标志物是α-突触核蛋白(a-synuclin)的异常聚集体Lewy小体。
研究表明，大部分神经退行性疾病的发生都伴随着错误折叠蛋白形成的聚集体在神经细胞中的异常积累，从而对神经元产生毒性作用。大量研究认为神经炎症反应、线粒体功能障碍以及氧化应激损伤是造成神经退行性疾病的主要病理机制，也得到研究者的广泛关注和认同。
自噬是一种高度保守的分解代谢过程，它将细胞质内容物传递给溶酶体以降解，不仅能够清除受损的蛋白质和线粒体，而且使细胞能量循环再利用。线粒体自噬(mitophagy)是指特异清除受损或多余线粒体的过程，是一种重要的线粒体质量控制机制。大多数神经退行性疾病与神经元中聚集性毒性蛋白在胞浆中的沉积和线粒体功能障碍有关，而自噬是去除这些蛋白质和维持线粒体稳态的强有力的过程。
线粒体功能障碍在阿尔茨海默病进程早期出现，加速Aβ的产生和Tau蛋白磷酸化，而Aβ和磷酸化的Tau蛋白反过来作用于线粒体，进一步加剧线粒体损伤，线粒体功能障碍将导致能源物质产生减少，活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)大量释放，形成一个“恶性循环”，造成神经元的损伤。因此，细胞自噬可能成为一个新的有效靶点，通过控制和调节线粒体自噬过程，或许可以延缓疾病进程，用于神经退行性疾病的药物研发。
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)可通过维持线粒体生物发生和线粒体自噬之间的平衡影响神经元的健康和存活，在AD发生发展过程中发挥重要作用。目前，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸及其前体作为改善阿尔茨海默病等年龄相关退行性疾病的药物已成为研究的热点。Beclin-1通过对自噬的调节，在肿瘤等疾病的发生、发展中发挥重要作用。但一些细胞中存在Beclin-1基因的缺失性突变，Beclin-1蛋白表达量下降，自噬功能降低。
由于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或Beclin-1是有机小分子，成药性差，经过口服途径给药，生物利用度低、脑内富集量少、体内循环时间短，种种问题限制了其在AD、PD等病理模型上的探索研究以及未来临床转化的应用。靶向线粒体将成为治疗该类疾病的崭新策略与重要手段。虽然基于这一理念的很多药物尚处于临床前探索研究阶段，线粒体靶向性神经保护剂的研究不仅将对相关领域新药设计与研发有积极作用；并且开发新的安全有效的线粒体自噬诱导剂将成为治疗阿尔兹海默症最为直接有效的手段之一。
发明内容
本发明的目的在于克服目前传统的抗AD药物的一些不良反应和解决现有自噬诱导剂靶点不明确的问题。为了解决上述技术问题，本发明提供了一种线粒体自噬诱导剂，并提供了所述自噬诱导剂在制备治疗炎症和神经退行性疾病药物中的应用。
现有的线粒体自噬诱导剂主要原理为破坏线粒体的功能，使细胞被迫发生线粒体自噬。虽然可以诱导线粒体自噬，但由于具有较大的毒性，并不能在临床应用中发挥作用。
本发明发现，NAD+能够诱导线粒体自噬，以减少或消除受损的线粒体，促进神经退行性疾病患者中的神经保护，为神经退行性疾病的治疗提供一种新的途径。
本发明提供一种将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和Beclin-1结合的策略。具体地，本发明提供的技术方案如下。
第一方面，本发明提供一种纳米自噬诱导剂，所述纳米自噬诱导剂包括以下组分：摩尔比为(2-3)：1的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和Beclin-1自噬多肽。
NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)有利于线粒体功能恢复，延缓AD进程。增加核NAD+的合成和激活SIRT1可以防止神经元轴突变性。同样，NAD+对SIRT1的激活显着降低了Aβ蛋白的水平。多肽beclin-1，源自自噬蛋白beclin 1的一个区域，该多肽是一种有效的自噬诱导剂，可用于肿瘤和阿尔兹海默症的治疗研究中。
本发明提供的纳米自噬诱导剂，含有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和Beclin-1自噬多肽，纳米载体为聚乳酸-羟基乙酸-聚乙二醇共聚物。
聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactide-co-glycolic acid),PLGA]纳米载体是由乳酸(lactic acid，LA)和羟基乙酸(glycolic acid，GA)这两种单体按照不同比例缩聚而成高分子聚合物载体。
进一步地，本发明提供的纳米自噬诱导剂，包括：聚乳酸-羟基乙酸-聚乙二醇共聚物、连接在聚乙二醇上的可通过血脑屏障的Angiopep2多肽和激活细胞自噬的多肽序列；具体地，本发明所用Beclin-1自噬多肽为CGTNVFNATFHIWHSGQFGT。
表面修饰Angiopep2多肽的纳米自噬诱导剂可协助高效的透过血脑屏障，增加药物在脑补的有效浓度提高治疗效果。Ang2它可通过BBB上表达的低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)受体介导内吞进入脑组织，若在制备[email protected]时，不使用Ang2多肽，[email protected]只能少量穿过BBB到达脑部，药效有限起不到治疗效果。
连接了Angiopep2多肽的聚乳酸-羟基乙酸-聚乙二醇共聚物的结构式为：
本发明提供的纳米自噬诱导剂的合成示意图见图1。
在本发明提供的纳米自噬诱导剂中，所述纳米自噬诱导剂中聚合物主链化合物基团的供体的平均分子量为5000-10000。
本发明提供的纳米自噬诱导剂能够清除ROS，减轻神经炎症，同时进入细胞之后能够激活线粒体自噬，降解Aβ，降低神经毒性，从而实现协同治疗阿尔茨海默症。
根据本领域技术人员的理解，本发明还请求保护，上述纳米自噬诱导剂在以下的应用：
(1)清除神经元中活性氧；
(2)减少脑组织中β-淀粉样蛋白斑块；
(3)增加大脑中小胶质细胞激活量；
(4)增加大脑中星形胶质细胞活化量；
(5)增加脑部神经细胞。
以及上述纳米自噬诱导剂在制备治疗或改善神经退行性疾病的药物中的应用。所述神经退行性疾病包括：阿尔兹海默症、帕金森氏病、肌萎缩性侧索硬化症和亨廷顿氏病中的任意一种。
第二方面，本发明提供一种药物组合物，以上述纳米自噬诱导剂为活性成分，配以药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药物组合物。
本发明提供的药物组合物，可以添加药学上可接受的辅料为赋形剂、稀释剂、载体、调味剂、粘合剂或填充剂中的任意一种或至少两种的组合。
本发明提供的含有NAD+和Beclin-1自噬多肽的纳米药物能促进自噬体形成。本发明提供的药物组合物通过减少淀粉样蛋白Aβ42的产生，可以缓解具有淀粉样蛋白β和/或神经原纤维缠结的病理特征的阿尔兹海默综合症。
第三方面，本发明提供上述纳米自噬诱导剂或上述的药物组合物的制备方法，包括：
以摩尔比1:2称取Angiopep2多肽或Beclin-1多肽和PLGA-TK-PEG2000-MAL，分别溶于水溶液中混合，室温下温和搅拌；
将PLGA-TK-PEG2000-Ang2和PLGA-TK-PEG2000-Beclin-1的反应物，使用分子量为10000Da透析袋截留纯化；
将PLGA-TK-PEG2000-Ang2与PLGA-TK-PEG2000-Beclin-1的聚合物溶于有机溶剂中，得到有机相；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸溶于去离子水中作为水相；
在磁力搅拌下，有机相滴缓慢滴加到水相中，反应4-12h后，离心并用双蒸馏水洗涤，去除未负载的药物，100K超滤管离心纯化，获得粒径为50-100nm的纳米颗粒。
将NAD+和Beclin-1自噬多肽进行配伍，并控制两者的用量比例，能有效提高NAD+与Beclin-1自噬多肽阻断自噬骨架蛋白Beclin1与自噬抑制因子Bcl-2之间的相互结合的效果，从而降低错误折叠的蛋白质的量，减少蛋白质在神经元内聚集，对自噬功能障碍的疾病有良好的药效，特别是对阿尔兹海默症有良好的药效，具有广泛的应用前景。
依据本领域技术人员的理解，给药的实际量或剂量以及给药时程将取决于被治疗的疾病的性质和严重性、被治疗的受试者的年龄和一般状况以及给药方式等。
在本发明提供的制备方法中，有机溶剂为二甲基亚砜、二氯甲烷或乙腈中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述有机溶剂为二氯甲烷。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
本发明在Angiopep2多肽的协助下，制备得到的纳米自噬剂可以高效的透过血脑屏障(BBB)，NAD+与Beclin-1的联合使用能够明显改善AD小鼠认知记忆能力，并通过诱导脑组织细胞自噬水平升高，降低ROS水平，起到保护神经细胞的作用。
同时本发明提供的纳米自噬剂减少了药物用量，进而降低了药物毒副作用。该发明基于纳米药物载体调控自噬对AD进行干预,实现了脑部疾病药物递送的高效、低毒的联合给药，高病灶富集，可控释药和可视化递送，为AD靶向治疗提供前瞻性方案，具有广泛的应用前景。
本发明提供的纳米自噬诱导剂表现出积极的生物相容性、保护药物不被破坏、延长有效药物维持时间、降低药物的毒副作用等优点并可进一步功能化，以实现安全、有效和组织靶向的传递。
在本发明提供的纳米自噬诱导剂中，NAD+和Beclin-1多肽能够诱导线粒体自噬，以减少或消除受损的线粒体，促进神经退行性疾病患者中的神经保护，为神经退行性疾病的治疗提供一种新的途径。
附图说明
图1是本发明纳米自噬诱导剂的合成示意图。
图2是本发明实施例1中制备得到的[email protected]纳米自噬剂的TEM和DLS表征图。
图3是本发明实施例2中[email protected]纳米自噬剂对SH-SY5Y细胞的靶向性成像图。
图4是本发明实施例3中[email protected]纳米药物对SH-SY5Y细胞中ROS水平的清除能力成像图。
图5是本发明实施例4中构建mCherry-GFP-LC3自噬示踪体系检测自噬流的结果图。
图6是本发明实施例5中采用JC-1染色评估线粒体膜电位状态结果图。
图7是本发明实施例6中[email protected]治疗后APP/PS1鼠的神经行为学检测结果图。
图8是本发明实施例7中[email protected]治疗后APP/PS1鼠脑海马区中自噬相关蛋白的表达电泳图。
图9是本发明[email protected]治疗后APP/PS1鼠脑组织中的Aβ，IBA-1，NeuN和GFAP免疫荧光分析图。
图10是本发明实施例10中[email protected]治疗后APP/PS1鼠脑部海马组织转路组测序差异基因表达谱热图。
图11是本发明实施例10中[email protected]治疗后APP/PS1鼠脑部海马组织转路组测序差异表达基因KEGG通路富集图。
图12是本发明对比例1中制备的纳米颗粒表征图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
在本发明的实施例中，NAD+购自MCE公司，PLGA-TK-PEG2000-MAL购自西安瑞禧生物科技有限公司，Ang2多肽和Beclin-1多肽购自上海淘普，DCFH-DA购自上海翌圣生物科技有限公司，小动物活体成像系统(珀金埃尔默PerkinElmer)，120KV透射电子显微镜(日本日立公司)，纳米粒度分析仪(英国马尔文公司)。
本发明实施例中，所用APP/PS1小鼠是双转基因小鼠，表达嵌合的小鼠/人淀粉样蛋白前体蛋白(Mo/HuAPP695swe)和突变的人早老蛋白1(PS1-dE9)。
实施例[email protected]纳米自噬诱导剂的制备和表征
本实施例提供[email protected]纳米自噬诱导剂的制备和表征。
本实施例的具体步骤如下：
1、功能两亲性分子PLGA-TK-PEG2000-Ang2/Beclin-1的合成：以摩尔比1:2称取Ang2和Beclin-1多肽和PLGA-TK-PEG2000-MAL，分别溶于水溶液中混合，室温下温和搅拌48h。将PLGA-TK-PEG2000-Ang2和PLGA-TK-PEG2000-Beclin-1的反应产物使用10000Da透析袋截留透析并纯化，冷冻干燥得干粉样品。
Ang2和Beclin-1修饰在PLGA的一端作为载体的一部分，使用修饰后的PLGA包裹NAD+。
2、NAD+负载PLGA多功能纳米颗粒，简称[email protected]，通过纳米乳共沉淀法制备。将各50mg的PLGA-TK-PEG2000-Ang2与PLGA-TK-PEG2000-Beclin-1聚合物溶于10mL的二氯甲烷和50mg的NAD+溶于去离子水中作为水相，在磁力搅拌下，有机相滴缓慢滴加到水相中。搅拌4-12h后挥发完有机溶剂，在24000rpm,4℃下离心20min，用双蒸馏水洗涤以去除未负载的药物，100K超虑管离心纯化获得形成的纳米颗粒[email protected]备用。NAD+通过parkin通路激活自噬，Beclin-1多肽通过Beclin-1通路激活细胞自噬，本发明以NAD激活线粒体自噬为主，Beclin-1激活细胞自噬为辅。
3、取[email protected](1mg/mL)置于样品池中通过动态光散射(Dynamic Light Scattering,DLS)测试粒径大小。实验数据通过软件Zetasizer Software处理。[email protected]的形貌通过透射电镜表征。取1μL样品滴于普通碳膜支持铜网上，2分钟后滤纸吸走多余的样品，之后滴加1μL的1％醋酸铀负染5分钟后滤纸吸走多余的液体，干燥后在120kV电压下用透射电镜观察纳米颗粒形貌。由图2可以看出动态光散射(DLS)和透射电子显微镜观察[email protected]的形态为均匀的纳米胶束颗粒，约80nm与DLS结果相对应，该尺寸的纳米颗粒具有高效的组织和细胞渗透能力。
实施例[email protected]纳米颗粒体外细胞摄取实验
本实施例使用实施例1制备得到的[email protected]纳米颗粒进行体外细胞摄取实验，具体步骤如下：
SH-SY5Y细胞生长至90％汇合度后用胰酶消化，离心后在细胞计数板上计数得到其密度，经过计算后以3000个细胞/孔将细胞分至6孔板中过夜贴壁。Cy5.5是一种近红外染料，加入到实施例1中制备的[email protected]纳米颗粒，药物浓度1μM处理4h后，PBS清洗后用激光共聚焦扫描显微镜于特定波长下观测细胞摄取情况。如图3所示，Cy5.5从荧光信号可见，制备的[email protected]纳米自噬剂可被SH-SY5Y细胞大量摄取，说明实施例1制备的[email protected]纳米自噬剂具有良好的靶向能力。
实施例3抗Aβ神经毒性和ROS清除能力
本实施例针对实施例1得到的[email protected]纳米自噬剂的抗Aβ神经毒性和ROS清除能力进行试验，具体步骤如下：
准备好SH-SY5Y细胞悬浮液，向6孔板每孔加入5000个细胞，每孔200μL。培养12h，取出培养基，实验组每孔加入纳米自噬剂浓度为20μg/mL、Aβ42浓度20μM的不含血清的培养基，对照组每孔加入Aβ42浓度20μM的不含血清的培养基，空白组加入体积为200μL的不含血清的培养基，培养24h。然后取出培养基，用PBS润洗3遍，加入含有10μMDCFH-DA探针的培养基放入培养箱孵育30min，之后用PBS洗细胞三次，共聚焦显微镜下成像。
ROS过氧化物的堆积是AD重要的病变原因，2,7-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)探针可与ROS发生反应，表现出较强的荧光用来指示ROS含量。如图4所示，Aβ[email protected]组为培养基中，纳米自噬剂浓度为20μg/mL、Aβ42浓度20μM；Aβ[email protected]组为培养基中，[email protected]浓度为20μg/mL、Aβ42浓度20μM；[email protected]为只含有NAD+不含Beclin-1多肽的纳米颗粒。
Aβ42+NAD+组为培养基中，NAD+浓度为20μg/mL、Aβ42浓度20μM；Aβ42+PBS组为培养基中，PBS为20μg/mL、Aβ42浓度20μM。
图4结果表明：与对照组比较，Aβ42处理SH-SY5Y细胞内ROS水平明显升高，[email protected]纳米颗粒处理组SH-SY5Y细胞内的荧光强度最低，体外实验结果表明实施例1得到的纳米自噬剂具有效清除ROS的能力和降低其对神经元的损伤，可减少AD中的ROS引起的相关症状。
实施例4mCherry-GFP-LC3-II自噬标记激活分析
慢病毒感染过表达mCherry-GFP-LC3-II的SH-SY5Y细胞48小时。加入[email protected]纳米自噬剂(实施例1制备得到)，浓度为20μg/mL，培养24h。用PBS润洗3遍，通过激光共聚焦显微镜分析自噬诱导情况。通过荧光斑点数判定自噬情况，量化每个细胞的CFP-LC3斑点数。一般情况下，当自噬被激活时，LC3-II被募集到自噬小体膜上，从而形成GFP-LC3的绿点。图5中PBS组为对照组；NAD+组为加入浓度20μg/mL的NAD+，培养24h的结果；[email protected]组为加入浓度20μg/mL的[email protected]，培养24h的结果。
结果如图5显示，[email protected]可以诱导大多数mCherry(红色信号)与自噬体共定位(GFP-LC3，绿色信号)，表明纳米自噬剂可以高效的激活自噬，形成更多的自噬体。
实施例5细胞线粒体膜电位观察
线粒体损伤或功能异常的特征之一是线粒体膜电位(Mitochondrial membranepotential,MMP)的丧失，进而触发细胞色素的释放引起细胞凋亡。本发明选择了线粒体膜特异性染料JC-1(5,5’,6,6’-Tetrachloro-1,1’,3,3’-t etraethyl-imidacarbocyanineiodide)实时监测Aβ42处理SH-SY5Y细胞期间线粒体形态变化。JC-1染料在其聚集体和单体状态之间经历可逆的荧光变化。其在正常线粒体高MMP水平时聚集并发射红色荧光。当线粒体受损去极化时，JC-1在低MMP水平分解成单体并转变为绿色荧光。Aβ42先处理SH-SY5Y细胞24h后加入纳米自噬剂浓度为20μg/mL，培养24h。再加入含JC-1(10μg/mL)的培养基孵育30分钟，用PBS洗3遍，通过激光共聚焦显微镜观察细胞线粒体膜电位情况。
图6中，Aβ[email protected]组为纳米自噬剂浓度20μg/mL；Aβ[email protected]为[email protected]浓度为20μg/mL、[email protected]为含有NAD+不含Beclin-1多肽的纳米颗粒。Aβ42+NAD+组NAD+浓度为20μg/mL；Aβ42+PBS组为空白对照组。
结果如图6所示，Aβ42处理SH-SY5Y细胞24小时之后，红色荧光降低，绿色荧光显著增加，表明线粒体膜被严重破坏失去电位。但加入[email protected]纳米自噬剂孵育后，可明显增加红色荧光强度，说明大部分JC-1染料处于聚集状态，表明线粒体膜完整。说明[email protected]纳米自噬剂能够激活细胞自噬清除Aβ42，减少对细胞的毒性。
实施例6Western Blot分析自噬相关蛋白
本实施例的小鼠共5组，每组5只。将正常小鼠作为野生型对照组；小鼠模型为9月龄APP/PS1小鼠，分为4组，3组APP/PS1小鼠分别使用NAD+、[email protected]、[email protected]处理，另一组APP/PS1小鼠作为APP/PS1小鼠空白对照组。
本实施例采用Western Blot分析自噬相关蛋白，具体实验方法：
处理组的三组小鼠，从9月龄时开始尾静脉注射给药5mg/kg，隔天给药，持续1个月，之后进行水迷宫实验，记录小鼠穿过原先平台位置的次数和运动轨迹。
由图7可知，APP/PS1小鼠穿过原平台的次数显著低于对照小鼠，说明其空间记忆保持能力受损。用[email protected]纳米自噬剂(实施例1制备得到的)治疗后的APP/PS1小鼠的穿过次数明显多于对照小鼠。(P＜0.01,差异显著)说明[email protected]纳米自噬剂可以明显提高APP/PS1小鼠的空间记忆保持能力。通过对APP/PS1小鼠模型中的效果来看，[email protected]纳米自噬剂对阿尔兹海默症有显著的改善效果。
实施例7Western Blot分析自噬相关蛋白
本实施例所用实验小鼠与实施例6中所用实验小鼠配置相同，将实验鼠海马组织在RIPA裂解液中裂解。RIPA裂解液1mL，12 000r/min，4℃离心30min，取上清液，BCA法测定蛋白浓度。通过SDS-PAGE分离样品，然后转移至PVDF膜。用脱脂牛奶封闭后，将膜与所示的第一抗体和第二抗体孵育。使用化学发光试剂检测了免疫反应带，β-actin用作内参对照。研究表明LC3II和p62可以辅助提示自噬流通畅与否，LC3-Ⅱ表达增加通常被认为是自噬泡形成增加、自噬活性增加的证据。p62是特异性经自噬途径降解的一种蛋白，Beclin1是调控自噬的关键因子。如图8所示[email protected]处理组Beclin-1上调，与对照组相比LC3II/LC3-I比值升高，说明[email protected]纳米自噬剂激活了自噬，即表明[email protected]纳米自噬剂具有促进自噬的作用。
实施例8免疫荧光切片染色分析
本实施例所用实验小鼠与实施例6中所用实验小鼠配置相同，实验小鼠共5组，每组5只。将正常小鼠作为野生型对照组；小鼠模型为9月龄APP/PS1小鼠，分为4组，3组APP/PS1小鼠分别使用NAD+、[email protected]、[email protected]处理，另一组APP/PS1小鼠作为APP/PS1小鼠空白对照组。
本实施例采用免疫荧光切片染色分析NAD+、[email protected]、[email protected]处理后小鼠的脑部神经，具体步骤如下：
小鼠灌注固定后取脑、脱水、OCT包埋，冰冻切片机切片(20-25um厚)，贴片、-80℃保存；染色具体操作如下：
(1)切片从-80℃取出后室温平衡30min；
(2)PBS清洗5min×3；
(3)0.2％Triton X-100处理切片10min(目的是增加细胞膜通透性)后PBS清洗3次，每次5min；
(4)血清室温封闭30min；
(5)一抗混合液4℃孵育过夜；
(6)第二天室温PBS清洗5min×3；
(7)二抗混合液室温孵育30min；
(8)PBS清洗5min×3；
(9)DAPI复染核；
(10)抗淬灭封片剂封片，荧光显微镜拍照。
免疫染色实验如图9的A所示，正常小鼠组脑部没有Aβ斑块，注射PBS缓冲液的AD鼠脑部有大量Aβ斑块，但用[email protected]纳米自噬剂治疗之后AD小鼠的脑部里面Aβ斑块明显减少，表明本发明的[email protected]纳米自噬剂能有效减少斑块形成并治疗阿尔茨海默症。
实施例9小胶质细胞激活的标记物IBA-1和星形胶质细胞活化的标志物GFAP
本实施例的小鼠共5组，每组5只。将正常小鼠作为野生型对照组；小鼠模型为9月龄APP/PS1小鼠，分为4组，3组APP/PS1小鼠分别使用NAD+、[email protected]、[email protected]处理，另一组APP/PS1小鼠作为APP/PS1小鼠空白对照组。处理组的三组小鼠，从9月龄时开始尾静脉注射给药5mg/kg，隔天给药，持续1个月
小胶质细胞激活的标记物IBA-1和星形胶质细胞活化的标志物GFAP，通常用于反映神经炎症反应。
图9的C和D结果显示[email protected]处理后，APP/PS1小鼠大脑中IBA-1和GFAP的表达与正常小鼠相似，说明通过[email protected]的协同作用可以减少脑内的氧化应激水平，减少小胶质细胞和星形胶质细胞的过度活化导致的炎症水平。相反PBS组，NAD裸药组和[email protected]组这三组中IBA-1和GFAP水平明显上调高于正常组小鼠，说明小胶质细胞和星形胶质细胞有一定程度活化加重的AD症状。
此外，如图9的B通过NeuN染色发现[email protected]处理后小鼠的脑部神经细胞数量增加，可以弥补Aβ引起的神经元减少，补偿相关的神经功能。
实施例10海马组织RNAseq转录组测序分析
将AD鼠海马组织取材提取RNA，经过文库构建与质检、上机测序和测序数据分析。RNAseq的重要内容是基因表达差异的显著性分析；KEGG是一个数据库资源，用于从分子水平的信息，特别是基因组测序产生的大规模分子数据集和其他高通量数据库中了解生物系统的高级功能和效用，如细胞，生物体和生态系统等。本实施例使用clusterProfiler(3.4.4)软件分析KEGG通路中差异表达基因的统计富集。
通过RNAseq结果(图10和图11)分析发现[email protected]处理后自噬相关通路基因大量上调。首先利用KEGG数据库提取了小鼠中关于自噬(autophagy)、线粒体自噬(mitophagy)、mTOR信号途径、神经再生通路(Pathways of neurodegeneration)、阿尔兹海默症(Alzheimer′sdisease)、帕金森疾病(parkinson)、泛素化介导蛋白降解通路(Ubiquitinationmediates proteolysis)、氧化磷酸化通路(oxidative phosphorylation)的相关基因，说明这些基因的高表达可能是保护因子。在动物模型上可以改善动物的记忆和保护神经元的活性，其机制可能是通过激活大脑神经元细胞的线粒体自噬活性和降低氧化应激水平，协同促进Aβ降解，实现AD症状的有效缓解。同时该体系减少了药物用量，进而降低了药物毒副作用。
对比例1
本对比例与实施例1相同，区别在于，本对比例中采用摩尔比为1：(2-3)的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和Beclin-1自噬多肽；本对比例制备得到的纳米颗粒如图12所示。由于比例的改变，使得颗粒较大，不利于穿过BBB。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 福建医科大学
<120> 一种用于阿尔茨海默症的纳米自噬诱导剂及其制备方法与应用
<130> KHP211119661.8
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Cys Gly Thr Asn Val Phe Asn Ala Thr Phe His Ile Trp His Ser Gly
1 5 10 15
Gln Phe Gly Thr
20
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