具体实施方式

以下实施例中涉及的实验动物、试剂、培养基和缓冲液的来源：

皮质抑素(Cortistatin,分子量：1720.03)(吉尔生化有限公司)。

SD雄性大鼠，(山东大学动物中心)

PBS缓冲液，(碧云天生物试剂公司)

Col2抗体，MMP13抗体，ADAMTS-5抗体(Thermo Fisher，Pierce)

RIPA细胞蛋白质提取裂解液(Thermo Fisher，Pierce)

蛋白酶抑制剂(北京索莱宝科技有限公司)

BCA蛋白定量试剂盒(上海炎熙生物科技有限公司)

Complete EDTA-Free(罗氏生物医药)

二甲苯(国药集团化学试剂有限公司)

中性树胶(上海泰坦科技股份有限公司)

浓盐酸(国药集团化学试剂有限公司)

伊红(上海泰坦科技股份有限公司)

苏木素(上海泰坦科技股份有限公司)

甲醇(国药集团化学试剂有限公司)

柠檬酸盐缓冲液(0.01M，PH＝6.0)(生工生物工程上海股份有限公司)

10％NGS(生工生物工程上海股份有限公司)

过氧化氢(H2O2)(国药集团化学试剂有限公司)

BSA(生工生物工程上海股份有限公司)

无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)

细胞计数仪购自美国Thermo Fisher公司

显微镜购自上海蔡康光学仪器有限公司

离心机购自济南欧莱博医疗器械有限公司

电子天平购自济南欧莱博医疗器械有限公司

酶联免疫检测仪(酶标仪)购自北京美华仪科技有限公司

制冰机购自济南欧莱博医疗器械有限公司

超纯水系统购自济南欧莱博医疗器械有限公司

涡旋混合器购自济南欧莱博医疗器械有限公司

1.股骨头坏死大鼠模型构建

在8周龄野生型SD雄性大鼠中建立糖皮质激素诱导股骨头坏死模型(共21只)。空白组的SD大鼠(7只)不做任何处理。剩余14只大鼠进行甲强龙(40毫克/千克体重)腹膜内注射，第一周每天注射一次甲强龙，后每周3次甲强龙注射连续5周。阳性对照无治疗，实验组行CST多肽(250微克/千克体重)腹膜内注射治疗，从第一周开始每周3次。实验结束后，将所有组的小鼠用过量的10％水合氯醛(山东大学齐鲁医院)安乐死，收集股骨头标本，对其外观进行拍照比较坏死严重程度，并用于X线及CT检测，分析骨质改变的程度。

图1-4为本部分实验的结果，图1为诱导治疗后的股骨头外观，图2为X线图像，图3为CT三维重建图像，图4为基于CT的BV/TV百分比分析，均显示大鼠的股骨头坏死在CST多肽治疗下有明显缓解。

2.组织切片制备

将来自所有组的大鼠股骨头组织固定在10％福尔马林中，至少在室温下固定72小时。50％乙醇(60分钟)、70％乙醇(60分钟)、85％乙醇(60分钟)、95％乙醇(60分钟)、100％乙醇(30分钟)、100％乙醇(30分钟)依次进行组织脱水；经过乙醇和二甲苯(60分钟)、二甲苯(60分钟)依次处理；然后用二甲苯和石蜡(60分钟)，石蜡(80分钟)透明；将组织放入盒中，用石蜡填充，然后将其放在石蜡包埋机的冷台上。将嵌入的组织石蜡块置于切片机上并切片，组织厚度约4μm；将含有组织的石蜡片轻轻涂抹在42℃的水中。完全展平后，用干净的玻璃片轻轻拨起切片；将切片放在载玻片上，编号，并在68℃的烤箱中烘烤至少6小时。

3.苏木精/伊红染色

切片常规脂溶性溶剂脱蜡至水(二甲苯两次，15分钟/每次；100％酒精5分钟；95％酒精5分钟；75％酒精5分钟；50％酒精5分钟)，然后使用苏木精染色液染色5分钟，用清水冲洗干净后，继续使用伊红染色液染色5分钟，清水冲洗干净后脱水(50％酒精5分钟；75％酒精5分钟；95％酒精5分钟；100％酒精5分钟；二甲苯两次，15分钟/每次)，后等切片晾干后使用中性树胶封片，放在光学显微镜下观察，并使用Image J进行组织学评分分析。

图5-6为本部分实验的结果图，图5为HE组织学染色，图6为基于HE染色的空白陷窝百分比计数，表明CST多肽的治疗减轻了大鼠股骨头坏死模型中股骨头组织的骨破坏程度。

4.免疫组织化学染色

组织切片脱蜡并水合。即连续二甲苯8分钟、二甲苯8分钟、二甲苯8分钟、无水乙醇8分钟、无水乙醇8分钟、95％乙醇8分钟、80％乙醇8分钟和75％乙醇8分钟。在70％乙醇8分钟后，将切片用水冲洗4次，每次5分钟；接下来，将脱蜡和水合的切片置于3％过氧化氢溶液中并在37℃下反应20分钟以阻断内源性过氧化物酶。每次用双蒸水洗涤4次，每次5分钟，修复抗原。将柠檬酸盐缓冲液置于金属加热器中并煮沸。煮沸15分钟，关闭电源并保持15分钟。自然冷却至室温；然后每次洗涤PBS 5次，每次5分钟，擦拭周围组织，加入5％山羊血清，阻断非特异性抗原，在室温下反应1小时，然后将CD31抗体逐滴添加至组织切片，并在4℃下在湿盒中孵育过夜；第二天，取出切片，在37℃培养箱中孵育1小时，用PBS冲洗5次，每15分钟，加入增强的辣根过氧化物酶偶联二抗，室温孵育2小时。用PBS清洗多余的二抗(5次，每次5分钟)；滴加新鲜制备的DAB着色溶液，在光学显微镜下观察，并呈现棕黄色，并用PBS洗涤以停止显色；接下来，进行苏木精复染。将有色切片置修饰的苏木精染色中并染色5分钟。在光学显微镜下观察染色。然后用0.2％盐酸分离切片，并用流水冲洗切片。最后，切片通过70％酒精10分钟、75％酒精8分钟、80％酒精8分钟、90％酒精8分钟、无水乙醇8分钟、无水乙醇8分钟、二甲苯8分钟和二甲苯8分钟依次浸洗。脱水2分钟后，擦拭组织周围的组织并擦拭，滴加中性凝胶，将盖玻片置于光学显微镜下观察。

图7为本部分实验的结果图，通过血管内皮特异性的CD31免疫组化染色，表明CST多肽的使用减轻了激素所致股骨头坏死模型中大鼠骨质中血供的破坏。

5.MC3T3-E1细胞培养

MC3T3-E1细胞为成骨细胞稳定细胞系，在DMEM/F-12培养基(Hyclone，Thermo CO)中加入10％的牛血清(FBS，gibco，USA)、1％100u/ml青霉素和100mg/ml链霉素(Hyclone，USA)，于ph7.2同步培养MC3T3-E1细胞(95％空气，5％co2,37°c)。培养基每3天更换一次，细胞达到80-90％汇合时传代。第二代或第三代细胞用于指定的实验。

6.Western Blot

体外培养及刺激后的各组MC3T3-E1细胞，置于冰上，经过处理后用冰水洗涤。收集后加入裂解缓冲液(p0013c，beyotime biotechnology)中提取蛋白质，将培养的髓核细胞然后加入RIPA裂解缓冲液(p0013c，beyotime biotechnology)，收集了每个样品的总蛋白质。在负载缓冲液中的蛋白质在100℃下加热10min(thermofisher)。采用10％SDS-PAGE凝胶(beyontime biotechnology)进行蛋白质电泳(每道30g)，电泳后将蛋白质电泳转移到硝化纤维素膜上。用吐温20(10mm tris-hcl，ph8.0；150mm nacl；0.5％tween 20)在5％脱脂干奶中阻隔2h，与特异性初级抗体(Bax，Bcl-2，β-Tubulin)在37℃下孵育1h，加入PBS洗涤3次后在4℃下过夜，加入辣根过氧化物酶二级抗体(稀释1:2000)，室温孵育1h。将膜用钝性镊子取出，用PBS冲洗至少三次。每膜加1ml工作液(p0018s，Beiotime Biotechnology)并检测(Amersham生命科学，艾林顿，伊利诺伊州，美国)。使用Image J软件进行条带灰度值统计学分析。

图8为本实验结果图，通过使用Western blot，观察地塞米松刺激所导致的凋亡标记物水平异常，而CST多肽则减轻了成骨细胞在地塞米松刺激下的凋亡过程。

7.统计学分析

所有数据均以至少三次独立实验的平均数士标准差表示。对于两组数据的统计学分析采用配对t检验多于两组数据的统计学分析采用单因素方差分析。

通过上述实验，证实CST多肽能够直接拮抗糖皮质激素介导的成骨细胞功能紊乱及过度凋亡，并且对于甲强龙诱导的股骨头坏死动物模型有确切疗效，同时有效促使股骨头内环境稳态。另外，CST多肽便于成骨细胞吸收利用,填补目前国内股骨头坏死防治药物的空白。

此外，细胞实验显示，CST多肽可以减轻糖皮质激素刺激所造成的成骨细胞代谢紊乱及凋亡过程，在股骨头坏死过程中发挥保护作用。

更为重要的是，CST多肽提纯工艺简单，制备方法纯熟，可明显降低成本，从而降低患者经济负担。

以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。