一种多肽ptpr在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用
阅读说明：本技术 一种多肽ptpr在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用 (Application of polypeptide PTPR in preparation of tumor immunotherapy medicine ) 是由 林爱福 石成瑜 于 2021-09-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种多肽PTPR在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用,在TMUB1调控PD-L1稳定性功能区段的氨基酸序列的基础上,利用竞争性抑制的原理设计的新型多肽。该多肽可增强细胞内的PD-L1泛素化并促进PD-L1的降解和清除；本发明通过抑制TMUB1对PD-L1的稳定性调控,抑制肿瘤细胞对抗体产生抗药性,避免导致用药时间延长、疗效降低等问题,诱导PD-L1蛋白质通过蛋白酶体降解,以减少肿瘤细胞表面和内部的PD-L1丰度,从根本上抑制PD-L1促进肿瘤免疫逃逸的功能。(The invention discloses an application of polypeptide PTPR in preparing a tumor immunotherapy medicament, which is a novel polypeptide designed by utilizing the principle of competitive inhibition on the basis of regulating and controlling an amino acid sequence of a PD-L1 stability functional segment by TMUB 1. The polypeptide can enhance the ubiquitination of PD-L1 in cells and promote the degradation and elimination of PD-L1; the invention inhibits the tumor cells from generating drug resistance to the antibody by inhibiting the stability regulation of TMUB1 on PD-L1, avoids the problems of prolonged administration time, reduced curative effect and the like, induces the PD-L1 protein to be degraded by proteasome so as to reduce the abundance of PD-L1 on the surface and in the tumor cells and fundamentally inhibits the function of the PD-L1 for promoting the escape of tumor immunity.)
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及用于增强机体抗肿瘤免疫以实现肿瘤治疗的PTPR多肽药物。
背景技术
癌症的治疗方法，除了传统的手术切除，放、化疗外，还包括药物的靶向治疗以及免疫疗法。尽管近些年来，基于免疫抑制剂等相关分子结合人体自身的免疫系统来达到治疗癌症的抗肿瘤免疫疗法在多种癌症中取得了较好的效果，但是肿瘤细胞自身通过高表达抗肿瘤免疫响应的抑制分子，如PDL1，IDO以及TGFβ等与T细胞表面多种免疫抑制分子受体(如PD1、TIM3、LAG3等)的结合，导致了由于T细胞耗竭造成的肿瘤免疫微环境抑制和癌细胞的增殖扩散。这是抗癌症免疫疗法中的瓶颈。因此当前癌症的抗免疫疗法的关键在于找到新的高效且专一阻断肿瘤免疫响应的抑制分子的抑制剂或抗体。从而帮助恢复免疫细胞对肿瘤细胞的识别，降低肿瘤细胞的免疫逃逸过程。
PD1(Programmed Death-1)是CD28家族的一种I型跨膜蛋白，表达在人类的T细胞、B细胞、巨噬细胞表面，向激活的T细胞提供抑制信号；PD-L1(Programmed Death 1ligand1)是PD1的配体，是B7家族的细胞表面I型跨膜蛋白。其作为一种重要的免疫抑制分子，PD-L1广泛表达于肿瘤微环境中的肿瘤细胞、树突细胞、巨噬细胞、纤维母细胞以及T细胞表达。肿瘤组织中高表达PD-L1与免疫细胞表面的PD1结合，使得肿瘤免疫反应失活，降低了免疫治疗的效应。PD-L1相关的抑制剂可以作为免疫检查点阻断疗法的协同用药靶点，提高免疫微环境中的T细胞的活性，增强抗肿瘤免疫反应。
TMUB1(Transmembrane and Ubiquitin-Like Domain Containing 1)是一种跨膜和泛素样结构域蛋白，首次在2015年被报道，其基因位于人类第七号染色体上，编码245 个氨基酸。TMUB1蛋白包含一个类似泛素(UBL)的结构域和三个跨膜域，可穿梭于细胞核和细胞质之间，并且参与到中心体的组装形成以及内质网相关蛋白降解过程中。本发明发现，TMUB1可以与促进PD-L1泛素化的蛋白竞争性结合，从而在蛋白水平稳定PD-L1持续抑制肿瘤免疫应答反应。基于上述理论，本发明开发了一个靶向 TMUB1的多肽分子，该分子可竞争性结合PD-L1，削弱PD-L1稳定性，使免疫细胞被正常激活，特异性识别肿瘤细胞并将其杀死。
发明内容
本发明目的是提供一种TMUB1蛋白的竞争性多肽PTPR在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用，在TMUB1可以与促进PD-L1泛素化的蛋白竞争性结合的基础上，旨在通过多肽PTPR和TMUB1竞争性与PD-L1结合，减少肿瘤细胞内免疫检查点蛋白分子PD-L1积累，增强机体抗肿瘤免疫。
本发明采用的技术方案是：
本发明基于TMUB1与PD-L1互作结构域基础上，提供一种TMUB1蛋白的竞争性多肽PTPR在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用，所述多肽PTPR包括下列一种或几种：
(a)、氨基酸序列为SEQ ID NO.1：GFTATPPAPDSPQEP所示的多肽；
(b)、与(a)中所示的氨基酸序列具有90％以上同一性的多肽；
(c)、包含(a)中所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代、缺失、插入中一种或多种的氨基酸序列的多肽；
(d)、包含如(a)中所示氨基酸序列经乙酰化、磷酸化、糖基化、琥珀酰化、泛素化修饰中一种或多种的氨基酸序列的多肽。
所述TMUB1蛋白具有Gene ID：83590，或为其同源序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明所述多肽PTPR为化学修饰的多肽PTPR，用于增强该多肽稳定性与实现细胞内示踪，包括但不限于：环化、N-甲基化、磷酸化、豆蔻酰化、棕榈酰化、糖基化、异戊二烯化、聚乙二醇修饰、荧光标记、生物素化等。优选FITC荧光标记。
所述肿瘤选自：肺癌(如非小细胞肺癌)、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌、肾癌、肠癌、头部颈部癌、皮肤癌、膀胱癌、胰腺癌。
所述药物为PD-L1抑制剂，所述药物的制剂形式包括：溶液剂、乳剂、悬浮剂或注射液。
所述药物可与本领域中已知用于预防和/或治疗对象中肿瘤免疫耐受的药物或疗法联用。所述联用包括：同时、依序、分开或单独给予本发明的物质或产品以及其他已知药物或疗法
针对于本发明的发明内容，本领域相关的技术人员可对前述的技术方案和技术特征进行任意组合而不脱离本发明的发明构思和保护范围。
较之于现有技术，本发明的优点在于：
(1)本发明是在TMUB1调控PD-L1稳定性功能区段的氨基酸序列的基础上，利用竞争性抑制的原理设计的新型多肽。该多肽可增强细胞内的PD-L1泛素化并促进 PD-L1的降解和清除；
(2)本发明通过抑制TMUB1对PD-L1的稳定性调控，抑制肿瘤细胞对抗体产生抗药性，避免导致用药时间延长、疗效降低等问题，诱导PD-L1蛋白质通过蛋白酶体降解，以减少肿瘤细胞表面和内部的PD-L1丰度，从根本上抑制PD-L1促进肿瘤免疫逃逸的功能。
附图说明
图1是实施例1靶向敲低TMUB1后，在2种乳腺癌细胞中TMUB1的mRNA表达水平。
图2是实施例1靶向敲低2种乳腺癌细胞内TMUB1后PD-L1、TMUB1、VCL 蛋白含量的凝胶图。
图3是实施例2中TMUB1调控PD-L1功能区段的氨基酸序列示意图(A)与凝胶图(B、C)；A中WT是指Wild Type TMUB1蛋白，△MU1是指截除MU1区段的TMUB1蛋白，△UBL是指截除UBL区段的TMUB1蛋白，△MU2是指截除MU2 区段的TMUB1蛋白，△TM1是指截除TM1区段的TMUB1蛋白；TM1是指TMUB1 氨基酸序列中第11到第31位，MU1是指TMUB1氨基酸序列中第32到第102位， UBL是指TMUB1氨基酸序列中第103位到第176位，TM2是指TMUB1氨基酸序列中第195到215位，TM3是指TMUB1氨基酸序列中第222到241位；MU2指TMUB1 氨基酸序列中第177到194位、第216到第221位、第242位到第246位；B中质粒载体是指无插入片段的PCDNA3.1质粒载体，TMUB1-Flag是指C端带有Flag标签的TMUB1全长蛋白，截除MU1-Flag是指TMUB1截除MU1区域，截除UBL-Flag 是指TMUB1截除BUL区域，截除MU2-Flag是指TMUB1截除MU2区域，截除 TM2-Flag是指TMUB1截除TM2区域；C中质粒载体是指无插入片段的PCDNA3.1 质粒载体，TMUB1-Flag是指C端带有Flag标签的TMUB1全长蛋白，截除32-45、 46-59、60-73、74-87、88-102是指分别截除MU1区域相应位置的TMUB1截短蛋白表达质粒。
图4是实施例2中的PTPR-FITC的氨基酸序列示意图。
图5是实施例2中的PTPR-FITC进入肿瘤细胞的共聚焦荧光显微图。
图6是实施例2中PTPR-FITC与MDA-MB-231人乳腺癌细胞孵育后的凝胶图。
图7是实施例3中PTPR-FITC与T细胞共培养后的照片(A)及肿瘤细胞存活率柱形图(B)。
图8是实施例4中小鼠体内PTPR-FITC对乳腺肿瘤体积增长影响统计图。
图9是实施例4中PTPR体内试验，各处理组肿瘤细胞中PD-L1蛋白水平(A)，肿瘤浸润淋巴细胞中CD8阳性细胞在CD3阳性细胞占比(B)与肿瘤浸润淋巴细胞中GzmB阳性细胞在CD3、CD8双阳性细胞占比(C)柱形图。
图10是实施例4中PTPR体内试验延长荷瘤小鼠生存期统计图。
图11是实施例5中PTPR毒性评估试验中观察终点小鼠状态示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构步骤及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
实施例1、PTPR肽细胞水平功能验证
1、TMUB1小分子RNA抑制剂
根据TMUB1基因核苷酸序列(Gene ID：83590，http://sidirect2.rnai.jp/，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示)，按照碱基互补配对原则及能量最低原则，获得两条胆固醇修饰的小分子RNA核苷酸序列，分别为TMUB1 序列1和TMUB1序列2，即为TMUB1小分子RNA抑制剂。
TMUB1基因序列(SEQ ID NO.2)：atga ccctgattgaaggggtgggt gatgaggtgaccgtcctttt ctcggtgctt gcctgccttc tggtgctggcccttgcctgg gtctcaacgc acaccgctgagggcggggac ccactgcccc agccgtcagggaccccaacg ccatcccagc ccagcgcagc catggcagctaccgacagca tgagaggggaggccccaggg gcagagaccc ccagcctgag acacagaggt caagctgcacagccagagcccagcacgggg ttcacagcaa caccgccagc cccggactcc ccgcaggagcccctcgtgctacggctgaaa ttcctcaatg attcagagca ggtggccagg gcctggccccacgacaccattggctccttg aaaaggaccc agtttcccgg ccgggaacag caggtgcgactcatctaccaagggcagctg ctaggcgacg acacccagac cctgggcagc cttcacctccctcccaactgcgttctccac tgccacgtgt ccacgagagt cggtccccca aatcccccctgcccgccggggtccgagccc ggcccctccg ggctggaaat cggcagcctg ctgctgcccctgctgctcctgctgttgctg ctgctctggt actgccagat ccagtaccgg cccttctttcccctgaccgccactctgggc ctggccggct tcaccctgct cctcagtctc ctggcctttgccatgtaccgcccgtag。
TMUB1氨基酸序列(SEQ ID NO.3)：
MTLIEGVGDEVTVLFSVLACLLVLALAWVSTHTAEGGDPLPQPSGTPTPSQPS AAMAATDSMRGEAPGAETPSLRHRGQAAQPEPSTGFTATPPAPDSPQEPLVLRLKFL NDSEQVARAWPHDTIGSLKRTQFPGREQQVRLIYQGQLLGDDTQTLGSLHLPPNCV LHCHVSTRVGPPNPPCPPGSEPGPSGLEIGSLLLPLLLLLLLLLWYCQIQYRPFFPLTA TLGLAGFTLLLSLLAFAMYRP。
TMUB1序列1(SEQ ID NO.4)：5’-GGCUGAAAUUCCUCAAUGA-3’、
TMUB1序列2(SEQ ID NO.5)：5’-CUACGGCUGAAAUUCCUCA-3’。
无义靶向序列：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3'。
2、肿瘤细胞
人乳腺癌细胞系MDA-MB-231与MDA-MB-468均购于美国标准细胞培养中心(ATCC)，使用含10％FBS(Bovogen)的DMEM/F12培养基(Gibco)，37℃，5％CO2培养箱培养，MycoAlert试剂盒(Lonza)检测细胞无支原体污染，无交叉污染。
3、构建TMUB1特异性敲低的细胞株
使用上述制备的TMUB1小分子RNA抑制剂，按照 Lipofectamine2000(ThermoScientific)试剂使用说明书进行质粒转染，具体为：按照ViraPowerTMLentiviralExpression System(Thermo Scientific)的方法分别将上述TMUB1序列1、TMUB1序列2和无义靶向序列转染人乳腺癌细胞系MDA-MB-231，分别构建两株TMUB1特异性敲低的细胞株，分别记为靶向敲低#1和靶向敲低#2，以及一株带有无义靶向序列的细胞株，记为无义靶向敲低对照。
同样条件下，将人乳腺癌细胞系MDA-MB-231替换为人乳腺癌细胞系 MDA-MB-468。
4、QPCR检测
利用QPCR检测细胞中的TMUB1 mRNA表达情况，图1显示上述TMUB1小分子RNA抑制剂靶向效果好，有效降低了细胞中的mRNA表达。
5、western blot检测
通过western blot检测PD-L1蛋白和TMUB1蛋白以及内参蛋白VCL在对照以及靶向敲低1#和靶向敲低2#细胞中的水平。
图2结果显示，在MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞系中靶向敲低TMUB1， PD-L1蛋白水平与对照相比，显著减少。该实施例说明敲低TMUB1可以在细胞水平上显著抑制PD-L1蛋白稳定性。
实施例2、TMUB1竞争性多肽PTPR的设计及其进入细胞的情况以及对PD-L1 表达的影响。
1、利用竞争性抑制的原理设计TMUB1竞争性多肽PTPR
(1)构建携带Flag标签的TMUB1截短蛋白
TMUB1蛋白(Wild Type)氨基酸序列组成(图3中A)：第11到第31位为TM1，第32-102位为MU1，第103到176位为UBL，第177到194位、第216到第221位、第242位到第246位为MU2，第195到215位为TM2，第222到241位为TM3。
鉴于TMUB1蛋白(Wild Type)对PD-L1稳定性的重要调控作用以及氨基酸序列特点，我们将TMUB1蛋白(Wild Type)中的部分氨基酸序列截去，具体如下：
将TMUB1中翻译MU1、UBL、MU2、TM1的核苷酸序列分别截去，分别得到 TMUB1核苷酸截短序列△MU1、△UBL、△MU2、△TM1，并将各个TMUB1截短核苷酸序列的C端加上Flag标签，构建携带Flag标签的TMUB1截短蛋白PCDNA3.1 载体表达质粒。
同时将TMUB1的C端加上Flag标签转入PCDNA3.1质粒载体，构建 TMUB1-Flag。以PCDNA3.1质粒载体为对照。
(2)TMUB1截短蛋白功能区段筛选
将步骤(1)各个携带Flag标签的TMUB1截短蛋白表达质粒与带HA标签的PD-L1 蛋白PCDNA3.1载体表达质粒以1：1的浓度混合转染入HEK 293T细胞中，孵育36 小时后，使用Anti-Flag磁珠进行免疫共沉淀，检测不同TMUB1截短蛋白对PD-L1 的结合与情况，以确定TMUB1调控PD-L1稳定性的功能区段(图3中B)，如图3 中B所示，截去MU1区段的TMUB1截短蛋白失去了对PD-L1的结合与调控功能。
(3)TMUB1的MU1区域截短筛选
使用步骤(1)(2)中的方法，对TMUB1的MU1区域进行截短，生成了带有C端Flag标签的△32-45、△46-59、△60-73、△74-87、△88-102的TMUB1截短蛋白表达质粒，将上述TMUB1截短蛋白表达质粒与PD-L1-HA表达质粒以1：1的浓度混合转染入HEK 293T细胞中，孵育36小时后，使用Anti-Flag磁珠进行免疫共沉淀后，由图3中C所示，截短88-102位氨基酸(序列为 GlyPheThrAlaThrProProAlaProAspSerProGlnGluPro，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)的TMUB1截短蛋白无法与PD-L1结合并调控PD-L1浓度，表明88-102即为TMUB1 调控PD-L1的结合与功能区段。
因此，TMUB1第88-102位短肽即为多肽PTPR，作为与PD-L1竞争性结合的“诱饵”，并用荧光基团FITC进行修饰，以进行细胞内示踪，命名为多肽FITC-PTPR(图 4)。上述设计利用竞争性抑制的原理，减弱细胞内TMUB1与PD-L1的结合，降低内源性PD-L1的表达。
2.2证明多肽FITC-PTPR可进入肿瘤细胞内减弱细胞内PD-L1丰度
取一株人乳腺癌细胞系MDA-MB-231以2*10^5的量接种到加有1ml含体积浓度10％FBS(Bovogen)的DMEM/F12培养基的24孔板中，待细胞贴壁后，将体外合成的 FITC-PTPR溶液(溶剂磷酸盐缓冲盐溶液，PBS)以10μM浓度加入其中，37℃孵育 12小时后，使用蛋白酶K消除未能进入细胞的PTPR肽后，制成荧光玻片。利用共聚焦荧光显微镜，检测多肽FITC-PTPR进入细胞的情况。由图5所示，PTPR可直接进入细胞内。
取三株相同人乳腺癌细胞系MDA-MB-231分别以5*10^6的量接种至加有10mL 含体积浓度10％FBS(Bovogen)的DMEM/F12培养基的10cm培养皿中，待细胞贴壁后做以下处理：一株不作任何处理(图6第1列)，一株加入1μL的二甲基亚砜作为对照(图6第2列)，一株加入终浓度10μM多肽FITC-PTPR的FBS溶液(图6第 3列)，分别37℃孵育12小时后，利用PD-L1特异性抗体，在凝胶电泳免疫印迹中检测PD-L1蛋白质的表达情况。如图6所示，多肽FITC-PTPR的加入明显地降低了人乳腺癌细胞PD-L1的表达，而作为溶剂对照的二甲基亚砜不具备此功能，这表明多肽FITC-PTPR多肽通过竞争抑制PD-L1，从而降低PD-L1的蛋白质表达水平。
实施例3、利用FITC-PTPR减弱肿瘤细胞免疫逃逸以增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤
鉴于FITC-PTPR表现出的在细胞水平上对PD-L1稳定性的抑制作用，因此FITC-PTPR应当对肿瘤免疫逃逸有显著抑制作用。
人外周血单核细胞PBMC购于美国标准细胞培养中心(ATCC)，使用含10％ FBS(Bovogen)的RMPI-1640培养基(Gibco)，37℃，5％CO2培养箱培养，MycoAlert 试剂盒(Lonza)检测细胞无支原体污染，无交叉污染。
按照人类CD3/CD28/CD2 T细胞激活剂(STEMCELL Technologies)使用说明书激活PBMC为细胞毒性T细胞。将人乳腺癌细胞系MDA-MB-231以2*10^5的量接种至加有3ml含体积浓度10％的FBS(Bovogen)DMEM/F12培养基的6孔板中，37℃， 5％CO2培养箱培养12h，分为4组，组1和组2不作处理，组3和组4分别加入3*10^6 量的细胞毒性T细胞，各自继续培养24小时。组1和组3分别加入终浓度10μM的 FITC-PTPR的PBS溶液，继续孵育12小时，利用结晶紫染色检测肿瘤细胞存活情况。由图7所示，对照组中FITC-PTPR处理并不影响肿瘤细胞的存活(组1与组3对比)，而PBMC共培养组(组3和组4)中的肿瘤细胞存活数明显少于对照组(组1组2与组3组4对比)，且FITC-PTPR处理组的肿瘤细胞存活数更少(组3与组4对比)，说明FITC-PTPR通过削弱PD-L1表达量，减弱肿瘤细胞的免疫逃逸，增强了T细胞对肿瘤细胞的杀伤。
实施例4、FITC-PTPR小鼠肿瘤模型功能的验证
4.1小鼠肿瘤模型的建立
购买12只Balb/c小鼠，采用4T1小鼠乳腺癌细胞系，对Balb/c小鼠皮下注射4T1 小鼠乳腺癌细胞3x106个，在注射完乳腺癌细胞4T1后第三天，皮下出现触摸可见的肿瘤，建立小鼠肿瘤模型，用以验证上述FITC-PTPR对乳腺癌的治疗作用。
利用游标卡尺测量每只小鼠所产生肿瘤的长径(mm)和短径(mm)，并利用公式计算出肿瘤体积，肿瘤体积(mm3)＝0.5x长径(mm)x短径(mm)2，待肿瘤大小约为50mm3进行用药处理。
4.2分组以及用药方法
将肿瘤大小约为50mm3的小鼠随机分为2组，每组6只，然后分别进行标记拍照，记录用药前的肿瘤大小，以及用药后的肿瘤大小。每组小鼠按照表1的用药方式及用药量分别进行处理，其中编号1的小鼠用生理盐水进行药物处理，编号2的小鼠用FITC-PTPR溶于生理盐水后进行药物处理，每天给药一次。
表1
编号
用药方式
用药量
1
瘤内注射
0.9％生理盐水，每次100μl，用药10次
2
瘤内注射
10mg/ml FITC-PTPR药液，每次100μl，用药10次
4.3观察
每组小鼠用药处理3天后进行拍照，比较每只小鼠在用药处理后的肿瘤大小。荷瘤18天后，处死编号为1、2组中的小鼠，检测肿瘤浸润淋巴细胞中CD3+CD8+Gzmb+ 阳性的T细胞状态与肿瘤PD-L1表达。编号为3、4组中的小鼠饲养至荷瘤后42天或死亡，记录各组中每只小鼠的死亡时间。
4.4实验结果
图8、9分别展示了1与2编号小鼠PTPR多肽药液处理后的实验结果图，由图8 可知，PTPR肽的使用显著延缓了肿瘤的生长；由图9可知，PTPR的使用减少了肿瘤细胞的PD-L1表达，增加了小鼠肿瘤浸润淋巴细胞中CD3+CD8+GzmB+细胞数量，表明PTPR肽的使用增强了机体的抗肿瘤免疫。图10展示了3与4编号小鼠PTPR 多肽药液处理后的生存情况，由图10可知，PTPR肽的使用显著增长了荷瘤小鼠的生存期。
实施例5、PTPR肽体内毒性的评估
5.1分组以及用药方法
购买12只周龄为4周的Balb/c小鼠，随机分为4组，每组3只，每组小鼠按照表2的用药方式及用药量分别进行处理，其中编号为1的小鼠用生理盐水处理，编号为2的小鼠以100mg/kg剂量注射FITC-PTPR生理盐水进行处理，编号为3的小鼠以 200mg/kg剂量注射FITC-PTPR生理盐水进行处理，编号为4的小鼠以500mg/kg剂量注射FITC-PTPR生理盐水进行处理。
表2 PTPR体内毒性评估给药方式及用药量
编号
用药方式
用药量
1
腹腔注射
0.9％生理盐水，第一天与第七天给药
2
腹腔注射
以100mg/kg为剂量进行给药，第一天与第七天给药
3
腹腔注射
以200mg/kg为剂量进行给药，第一天与第七天给药
4
腹腔注射
以500mg/kg为剂量进行给药，第一天与第七天给药
5.2观察
以第一次给药后为观察起点，第一次给药后14天为观察终点，拍照记录小鼠的活动与外表状态，记录小鼠的生存情况。
5.3实验结果
图11展示了观察终点时，各组代表性小鼠的外表状态与生存情况。由图11可知，所有小鼠在高剂量PTPR处理下均能存活，且外表、活动正常，说明PTPR并无显著的毒性。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种多肽PTPR在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
Gly Phe Thr Ala Thr Pro Pro Ala Pro Asp Ser Pro Gln Glu Pro
1 5 10 15
<210> 2
<211> 741
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
atgaccctga ttgaaggggt gggtgatgag gtgaccgtcc ttttctcggt gcttgcctgc 60
cttctggtgc tggcccttgc ctgggtctca acgcacaccg ctgagggcgg ggacccactg 120
ccccagccgt cagggacccc aacgccatcc cagcccagcg cagccatggc agctaccgac 180
agcatgagag gggaggcccc aggggcagag acccccagcc tgagacacag aggtcaagct 240
gcacagccag agcccagcac ggggttcaca gcaacaccgc cagccccgga ctccccgcag 300
gagcccctcg tgctacggct gaaattcctc aatgattcag agcaggtggc cagggcctgg 360
ccccacgaca ccattggctc cttgaaaagg acccagtttc ccggccggga acagcaggtg 420
cgactcatct accaagggca gctgctaggc gacgacaccc agaccctggg cagccttcac 480
ctccctccca actgcgttct ccactgccac gtgtccacga gagtcggtcc cccaaatccc 540
ccctgcccgc cggggtccga gcccggcccc tccgggctgg aaatcggcag cctgctgctg 600
cccctgctgc tcctgctgtt gctgctgctc tggtactgcc agatccagta ccggcccttc 660
tttcccctga ccgccactct gggcctggcc ggcttcaccc tgctcctcag tctcctggcc 720
tttgccatgt accgcccgta g 741
<210> 3
<211> 246
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
Met Thr Leu Ile Glu Gly Val Gly Asp Glu Val Thr Val Leu Phe Ser
1 5 10 15
Val Leu Ala Cys Leu Leu Val Leu Ala Leu Ala Trp Val Ser Thr His
20 25 30
Thr Ala Glu Gly Gly Asp Pro Leu Pro Gln Pro Ser Gly Thr Pro Thr
35 40 45
Pro Ser Gln Pro Ser Ala Ala Met Ala Ala Thr Asp Ser Met Arg Gly
50 55 60
Glu Ala Pro Gly Ala Glu Thr Pro Ser Leu Arg His Arg Gly Gln Ala
65 70 75 80
Ala Gln Pro Glu Pro Ser Thr Gly Phe Thr Ala Thr Pro Pro Ala Pro
85 90 95
Asp Ser Pro Gln Glu Pro Leu Val Leu Arg Leu Lys Phe Leu Asn Asp
100 105 110
Ser Glu Gln Val Ala Arg Ala Trp Pro His Asp Thr Ile Gly Ser Leu
115 120 125
Lys Arg Thr Gln Phe Pro Gly Arg Glu Gln Gln Val Arg Leu Ile Tyr
130 135 140
Gln Gly Gln Leu Leu Gly Asp Asp Thr Gln Thr Leu Gly Ser Leu His
145 150 155 160
Leu Pro Pro Asn Cys Val Leu His Cys His Val Ser Thr Arg Val Gly
165 170 175
Pro Pro Asn Pro Pro Cys Pro Pro Gly Ser Glu Pro Gly Pro Ser Gly
180 185 190
Leu Glu Ile Gly Ser Leu Leu Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu
195 200 205
Leu Leu Trp Tyr Cys Gln Ile Gln Tyr Arg Pro Phe Phe Pro Leu Thr
210 215 220
Ala Thr Leu Gly Leu Ala Gly Phe Thr Leu Leu Leu Ser Leu Leu Ala
225 230 235 240
Phe Ala Met Tyr Arg Pro
245
<210> 4
<211> 19
<212> RNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 4
ggcugaaauu ccucaauga 19
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 5
cuacggcuga aauuccuca 19
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 6
uucuccgaac gugucacgu 19
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