一种类泛素蛋白蛋白酶的生产方法
阅读说明：本技术 一种类泛素蛋白蛋白酶的生产方法 (Production method of ubiquitin-like protein protease ) 是由 倪斌 蔡玥 常婧洋 黄小星 于 2021-08-17 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种类泛素蛋白蛋白酶的生产方法,涉及基因工程技术领域。本发明的SUMO蛋白酶的生产方法,包括：1)构建SUMO蛋白酶表达载体；2)将所述SUMO蛋白酶表达载体转化至宿主菌,筛选获得基因工程菌；3)对所述基因工程菌进行培养,从培养液中提取SUMO蛋白酶。本发明的SUMO蛋白酶表达载体的表达量高,SUMO蛋白酶的提取方法简便,适合工业化大规模生产；特别是,本发明方法生产的SUMO蛋白酶的活性高,在用于切割去除融合标签以获得目的蛋白等方面具有良好的应用前景。(The invention provides a method for producing ubiquitin-like protein protease, relating to the technical field of genetic engineering. The method for producing SUMO protease of the present invention comprises: 1) constructing an SUMO protease expression vector; 2) transforming the SUMO protease expression vector to host bacteria, and screening to obtain genetically engineered bacteria; 3) culturing the genetic engineering bacteria, and extracting SUMO protease from the culture solution. The expression quantity of the SUMO protease expression vector is high, and the extraction method of the SUMO protease is simple and convenient and is suitable for industrial large-scale production; particularly, the SUMO protease produced by the method has high activity, and has good application prospect in the aspects of cutting and removing the fusion tag to obtain the target protein and the like.)
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种SUMO蛋白酶的生产方法。
背景技术
SUMO蛋白酶是一种具有较高活性的半胱氨酸蛋白酶，来源于酵母编码的MIP1基因，能够特异性识别UBL蛋白的三级结构SUMO(Small Ubiquitin-Like Modifier)，并依赖正确的蛋白质构象；即，在仅有完整序列而没有正确结构时，SUMO蛋白酶是不能对目标蛋白进行切割的。SUMO蛋白酶是目前切割特异性最好的蛋白酶，可在较广泛的作用温度和PH范围(pH7-9)内发挥作用。
由于靶蛋白可以通过与类泛素蛋白(sumo)进行融合表达，以提高靶蛋白的可溶性；因此，高活性的SUMO蛋白酶可用于切割去除融合标签获得目的蛋白。目前，市场上SUMO蛋白酶的生物活性普遍较低，此外常规的的SUMO蛋白酶生产方法通常步骤繁琐，且成本较高。因此，提高SUMO蛋白酶的表达量及活性，同时减少生产成本，是非常有必要的。
公开号为CN 108774634 A的中国专利申请公开了一种重组SUMO蛋白酶在大肠杆菌中的生产方法，包括以下步骤：S1、PET-21b-SUMO蛋白酶表达质粒的构建；S2、SUMO蛋白酶的诱导表达与鉴定；S3、SUMO蛋白酶的纯化与鉴定。该方法应用大肠杆菌表达系统，通过设计表达载体，实现了重组SUMO蛋白酶在大肠杆菌中的表达。然而，该方法SUMO蛋白酶的表达量及活性提高程度有限，无法适应工业化大规模生产。
鉴于此，特提出了本发明。
发明内容
本发明提供一种SUMO蛋白酶的生产方法，利用该方法生产SUMO蛋白酶时，SUMO蛋白酶的表达量以及活性显著提高。
本发明提供一种SUMO蛋白酶的生产方法，按照下述步骤进行：
1)构建SUMO蛋白酶表达载体；
2)将所述SUMO蛋白酶表达载体转化至宿主菌，筛选获得基因工程菌；
3)对所述基因工程菌进行培养，从培养液中提取SUMO蛋白酶。
步骤1)中，所述SUMO蛋白酶表达载体为pET30a-stag-Bsulpstar。
步骤2)中，所述宿主菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
进一步地，步骤2)包括：
将质粒pET30a-stag-Bsulpstar与感受态细胞混匀，随后进行冰浴、水浴热击、冰浴，再于培养基中进行复苏培养；
将复苏培养后的培养液涂布于含有卡那青霉素和氯霉素的固体培养基中进行培养，培养后挑取单克隆并筛选阳性转化子，获得基因工程菌。
已经于2021年4月30日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.22263，建议的分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。
进一步地，所述固体培养基中卡那青霉素的浓度为45-55μg/mL，氯霉素的浓度为30-40μg/mL。
在本发明的步骤3)中，采用发酵培养基进行培养，其中每升发酵培养基中含有蛋白胨18-22g，酵母提取物8-12g，Na2HPO4·7H2O 6-7g，KH2PO4 3-4g，NH4Cl 2-3g，Na2SO4 0.5-1.0g，MgSO4 0.4-0.6g，甘油4-6mL，葡萄糖0.4-0.6g，乳糖1.8-2.2g，FeCl3 0.001-0.005g。
进一步地，步骤3)中，所述培养的条件如下：接种量为0.5-1.5％，培养温度为28-32℃，搅拌速度200-240rpm，培养时间为18-22h。
在本发明的步骤3)中，从培养液中提取SUMO蛋白酶包括：
从培养液中收集菌体，将菌体悬于裂解缓冲液中，于冰浴中超声裂解细胞；其中，超声裂解细胞的条件如下：功率为25％，超声2-3秒后停3-5秒作为一个循环，共进行340-360个循环；
对裂解液进行离心，采用微孔滤膜对离心上清液进行过滤，得到粗酶液。
进一步地，本发明的SUMO蛋白酶的生产方法，还包括对所述粗酶液进行提纯。
具体地，所述提纯包括：
采用镍柱对所述粗酶液进行柱层析；
对所述柱层析的流出液进行透析。
本发明的实施，至少具有以下优势：
1、本发明的SUMO蛋白酶表达载体pET30a-stag-Bsulpstar，通过优化启动子和信号肽，可以在枯草芽孢杆菌中大量产生具有高活性的SUMO蛋白酶，从而大大降低了SUMO蛋白酶的生产成本。
2、本发明采用枯草芽孢杆菌表达系统进行表达，具有培养条件易于控制、繁殖速度快、分泌量高、SUMO蛋白酶提取工艺操作相对简单等优点，特别适用于大规模的生产。
3、本发明的方法生产成本低、并且易于操作，其分泌得到的SUMO蛋白酶浓度高、生物活性强，整个工艺过程无毒害物质产生，在用于切割去除融合标签以获得目的蛋白等方面具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明枯草芽孢杆菌的菌落形态。
图2为本发明枯草芽孢杆菌革兰氏染色图。
图3为本发明枯草芽孢杆菌基于16S rDNA序列构建的系统发育树。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的附图和实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实验材料及试剂如下：
一、实验材料
Tryptone、Yeast Extract：Oxoid公司原装产品；
Ni2+column购于GE Healthcare；
其余试剂为国产分析纯试剂或国外进口分装产品。
二、主要试剂配制
1.LB液体培养基
按10g/L蛋白胨(Tryptone)、5g/L酵母提取物(Yeast Extract)、10g/L NaCl溶解于纯净水中，高压灭菌，备用。
2.LB固体培养基
按10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L NaCl、16g/L琼脂(Agar)溶解于纯净水中，高压灭菌，备用。
3.发酵培养基(1L)
20g蛋白胨，10g酵母提取物，6.7g Na2HPO4.7H2O，3.4g KH2PO4，2.6g NH4Cl，0.7gNa2SO4，0.5g MgSO4，5mL甘油(Glycerol)，0.5g葡萄糖(Glucose)，2g乳糖(Lactose)，0.003gFeCl3，溶解于1L纯净水中，高压灭菌，备用。
4.0.01M PBS缓冲液
135mM NaCl，2.7mM KCl，1.5mM KH2PO4和8mM K2HPO4，pH 7.2；
称取7.9g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH2PO4(或1.44g Na2HPO4)和1.8g K2HPO4，溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L；保存于4℃冰箱中。
5.裂解缓冲液
PBS缓冲液，1mg/mL溶菌酶，1％吐温20(Tween 20)，20mM咪唑(Imidazole)。
6.Binding buffer
20mM咪唑，20mM磷酸盐(Phosphate)，0.5M NaCl，pH 7.4-7.6。
7.Wash buffer
50mM咪唑，20mM磷酸盐，0.5M NaCl，pH 7.4-7.6。
8.Elution buffer
300mM咪唑，20mM磷酸盐，0.5M NaCl，pH 7.4-7.6。
9.透析缓冲液
20mM Tris-HCl pH 8.0，150mM NaCl，10％甘油(glycerol)。
10.10×酶切反应液
200mM Tris-HCl pH 8.0，1500mM NaCl，20mM二硫苏糖醇(dithiothreitol)。
11.10×Ulp protease store buffer
100mM Tris-HCl pH 8.0，750mM NaCl，50mM DTT，10mM EDTA。
12.Tricine-SDS-PAGE蛋白质电泳溶液
(1)正极缓冲液(10×)：121.14g Tris溶于400ml重蒸水，用1mol/L HCl调至pH8.9，定容至500ml。
(2)负极缓冲液(10×)：60.55g Tris，89.58g Tricine和5g SDS溶于400ml重蒸水中，加水至终体积为500ml。
(3)凝胶缓冲液(3×)：将18.15g Tris,1.5gSDS溶于400ml重蒸水中,用1mol/LHCl滴定至pH8.45，再加水稀释至500ml。
13.丙烯酰胺储存液配制
(1)3C丙烯酰胺储存液(49.5％T,3％C)：将48g丙烯酰胺和1.5g甲叉双丙烯酰胺溶于重蒸水中至100ml。
(2)5C丙烯酰胺储存液(49.5％T,5％C)：用重蒸水溶解47g丙烯酰胺和2.5g甲叉双丙烯酰胺成100ml溶液。
(3)6C丙烯酰胺储存液(49.5％T,6％C)：用重蒸水溶解46.5g丙烯酰胺和3.0g甲叉双丙烯酰胺成100ml溶液。
(4)上样缓冲液：由4％SDS、12％甘油、50mmol/L Tris、2％巯基乙醇以及少许溴酚蓝组成，pH6.8。
(5)固定液:250ml甲醇，50ml冰醋酸，0.05mol醋酸铵加水定容500ml(0.7mm，30min)。
(6)染色液:0.025％考马斯亮蓝G-250+甲醇50％+10％冰醋酸(0.7mm，60min)。
(7)脱色液:10％冰醋酸+30％甲醇+ddwater(0.7mm，2h或者过夜)。
14.卡那青霉素(kan)溶液
按50mg/mL卡那青霉素钠盐溶解于灭菌水中，微孔滤膜过滤除菌，分装，-20℃保存备用。
15.氯霉素(Cm)溶液
按34mg/mL氯霉素溶解于灭菌无水乙醇中，分装，-20℃保存备用。
本发明使用宿主菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。
实施例1
一、质粒转化表达宿主
取2μL质粒pET30a-stag-Bsulpstar，加入150μL感受态细胞中，轻缓转动以混匀内容物，先冰浴30min，随后42℃水浴热击90s，再快速转至冰浴中2min。
向上述感受态细胞中加入950μL的LB培养基，于37℃下150rpm摇动复苏培养0.5-1h，12000rpm离心2min，取100μL涂布于加有卡那青霉素(50μg/mL)和氯霉素(34μg/mL)的LB固体培养基上，于室温下至涂布的菌液被培养基吸干，倒置培养于37℃培养12-18h。
次日随机挑取单克隆，为保险起见，做菌落PCR，取阳性菌液与60％的甘油混匀后(甘油终浓度为20％)，-80℃保存三份。
二、SUMO蛋白酶的表达
1)将上述保存的单菌落接种于5mL LB液体培养基中(含Kan 50μg/mL，Cm 34μg/mL)，37℃培养过夜。
2)次日以1％的接种量(v/v)转接到500mL的发酵培养基，于30℃、220rpm的条件下振荡培养20h左右。
3)将上述培养液于6000rpm、4℃条件下离心10min，收集菌体；用PBS重悬菌体，再次离心收集菌体。
4)裂解细胞：将菌体沉淀重悬于裂解缓冲液中，4℃放置半小时，随后在冰浴中使用超声仪裂解细胞进行裂解，裂解条件为：功率为25％，以超声2秒停4秒为一个循环，裂解大约350个循环；裂解后，将裂解液于4℃、12000rpm条件下离心15min，收集上清，上清再经微孔滤膜过滤除颗粒物质。
本发明所述的基因工程菌BS20210415，已经于2021年4月30日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.22263，建议的分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。
上述基因工程菌的常规理化鉴定结果，如图1和图2所示：图1为本发明枯草芽孢杆菌的菌落形态；图2为本发明枯草芽孢杆菌革兰氏染色图。
上述基因工程菌的进化树见图3本发明枯草芽孢杆菌基于16S rDNA序列构建的系统发育树，图中划线标注处即为本发明的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。
三、SUMO蛋白酶的纯化
1)先用10倍柱体积的Binding buffer平衡镍柱。
2)上样(可将样品全部加入，充分混匀样品与镍基质，然后于4℃放置30min)，再分别用3倍柱体积的Binding buffer和Wash buffer洗涤柱体。
3)用40mL Elution buffer洗涤柱体，取少量用于12％SDS-PAGE检测纯度。
4)将流出液装入透析袋(SUMO蛋白酶采用14kDa的透析袋)，用透析缓冲液4℃过夜透析，至少更换2次缓冲液。
5)将SUMO蛋白酶样品、10×Ulp protease store buffer和100％甘油，按照5：1：6的比例混匀，-80℃保存。
四、融合蛋白体外切割
将Ulp protease融合蛋白与上述SUMO蛋白酶样品以1：5比例(v/v)在10×酶切反应液中于4℃酶切过夜(或30℃酶切1-2h)；同时设置不加酶以及失活酶(即100℃处理30min)做阴性对照。
四、SDS-PAGE电泳检测
将凝胶板依次用水和无水乙醇洗涤，然后使其自然风干或烘干；安装玻璃板、板条、并将玻璃板固定在电泳槽中，并蒸馏水检查是否漏；以表1配方分别配制分离胶和浓缩胶。
表1 SDS-PAGE电泳检测的分离胶和浓缩胶配方
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。