假尿苷合成酶突变体、突变基因及其在制备维生素b2中的应用

文档序号：1916778 发布日期：2021-12-03 浏览：17次 >En<

阅读说明：本技术 假尿苷合成酶突变体、突变基因及其在制备维生素b2中的应用 (Pseudouridine synthetase mutant, mutant gene and application thereof in preparation of vitamin B2In (1) ) 是由解永梅马成兵尤淑芬李铭越刘川于 2021-08-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种假尿苷合成酶突变体、突变基因及其在制备维生素B2中的应用。其中所述突变体的多肽氨基酸序列相对于SEQ ID No.3所示序列仅存在下述突变：第239位组氨酸突变为亮氨酸。本发明以假尿苷合成酶ylyB为基础,选择第239位的氨基酸进行定点突变,将枯草芽孢杆菌BS-1中假尿苷合成酶编码基因ylyB变为假尿苷合成酶突变体(H239L)与枯草芽孢杆菌BS-1相比,含有假尿苷合成酶突变体(H239L)的菌株可以提高产维生素B-(2)的能力达10.8％,因而在制备维生素B-(2)中具有很大的应用价值。(The invention discloses a pseudouridine synthetase mutant, a mutant gene and application thereof in preparing vitamin B2. Wherein the polypeptide amino acid sequence of the mutant only has the following mutations relative to the sequence shown in SEQ ID No. 3: histidine at 239 was mutated to leucine. The invention selects the 239 th amino acid to perform site-directed mutagenesis on the basis of pseudouridine synthetase yB, and carries out site-directed mutagenesis on the pseudouridine synthetase coding gene yly in bacillus subtilis BS-1B-to-Pseudouridine synthetase mutant (H239L) the strain containing Pseudouridine synthetase mutant (H239L) had increased vitamin B production compared to Bacillus subtilis BS-1 2 The content of vitamin B in the product can reach 10.8%, and the vitamin B can be used for preparing vitamin B 2 Has great application value.)

假尿苷合成酶突变体、突变基因及其在制备维生素B2中的应用

技术领域

本发明涉及假尿苷合成酶突变体、突变基因及其在制备维生素B₂中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

核黄素(Riboflavin)又称维生素B₂，分子式为C₁₇H₂₀O₆N₄，是维生素B族中的一种水溶性维生素，在生物体内以黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)两种形式存在，作为机体内一些重要的氧化还原酶的辅酶参与氧化还原反应，起到递氢的作用。核黄素的缺乏会导致生物体代谢发生障碍，但人和动物均不能自身合成，只能从食物中摄取，因此核黄素的生产在食品、饲料以及医药行业都具有非常广阔的市场。

目前核黄素的工业生产方法有植物萃取法、化学合成法、半合成法以及微生物合成法。其中，微生物合成法以其成本低、环境友好以及能源可再生等优点逐步占据主导地位，成为大部分工业化生产的主要方法。在众多可生产核黄素的微生物中，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)作为一种非病原微生物，生理代谢及遗传背景清楚，便于确定代谢靶点及基因工程改造，并具有可靠的安全性，它们的发酵产物在食品与饲料业中已有长期的应用，对环境、医药和工业发酵生产都非常重要。其次枯草芽孢杆菌基因工程菌株能够过量合成叶酸、肌苷或鸟苷，具有为核黄素过量合成提供足够前体物的潜力，因此枯草芽孢杆菌基因工程菌在核黄素的微生物发酵生产中逐渐显示出了强大的生命力，成为主要生产菌株。

枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中核黄素的合成需要5-磷酸核酮糖(Ru5P)和鸟嘌呤-5’-三磷酸(GTP)两个前体物质，其中Ru5P来源于磷酸戊糖途径，GTP来源于嘌呤的从头合成途径。二者在一些列核黄素操纵子的作用下经7步反应由核黄素合成途径最终合成核黄素。

假尿苷合成酶由ylyB基因编码，可以催化尿嘧啶生成假尿苷。在嘧啶代谢途径中，存在从头合成途径和补救合成途径。在补救合成途径中尿嘧啶和磷酸核糖焦磷酸(PRPP)反应生成尿嘧啶核苷酸。从而消耗了游离的尿嘧啶和PRPP。而尿嘧啶生成假尿苷后，PRPP可以被积累。而PRPP又可以作为嘌呤从头合成途径和补救合成途径的前体，生成核黄素的前体GTP。因而认为假尿苷合成酶会影响核黄素的生成，即假尿苷合成酶编码基因的表达水平与核黄素的生成存在一定的潜在联系。目前，尚未有假尿苷合成酶突变基因用于维生素B₂合成的报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了假尿苷合成酶突变体、突变基因及其在制备维生素B₂中的应用。

首先，本发明提供一种假尿苷合成酶突变体，其特征在于，其多肽氨基酸序列相对于SEQ ID No.3所示序列仅存在下述突变：第239位组氨酸突变为亮氨酸。

根据本发明优选地，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

其次，本发明提供所述的假尿苷合成酶突变体的编码基因。

根据本发明优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

相应地，本发明第三方面还提供含有所述假尿苷合成酶突变体的编码基因的表达盒、重组载体。所述重组载体对出发载体并没有特别的限制，可为本领域中已知的任何载体，只要它能够在宿主中进行复制即可。例如，所述载体包括但不限于质粒，噬菌体。一旦转化入合适的宿主之后，所述载体可以复制并独立于宿主基因组发挥功能，或者在某些情况下整合入基因组本身。

更优选地是重组表达载体，更优选原核重表达载体。最优选是适合于在枯草芽孢杆菌中进行表达的表达载体。

第四方面，本发明提供含有所述假尿苷合成酶突变体的编码基因的重组宿主细胞。其中所述“宿主细胞”是具有本领域通常理解的含义，其能够导入本发明的突变体的编码基因的细胞，导入之后称为重组宿主细胞。本发明的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，优选为原核细胞，更优选为枯草芽孢杆菌。

第五方面，本发明提供假尿苷合成酶突变体编码基因在制备维生素B₂中的应用。

第六方面，本发明提供一种增强枯草芽孢杆菌产维生素B₂的方法，其是将染色体上的假尿苷合成酶编码基因进行定点突变，获得产维生素B₂的能力增强的枯草芽孢杆菌，其中所述定点突变是将所述编码基因的编码第239位组氨酸H的核苷酸替换为编码亮氨酸L的核苷酸，更具体的是所述编码基因的第716位核苷酸A突变为T。其中的定点突变可以采用本领域已知的各种方法来实现。

根据本发明优选地，所述枯草芽孢杆菌的原始出发菌株是枯草芽孢杆菌BS-1。

本发明第七方面，提供一种利用上述第六方面的方法获得的枯草芽孢杆菌制备维生素B₂的方法，其包括培养所述枯草芽孢杆菌，以及收集维生素B₂的步骤，更优选还包括纯化维生素B₂的步骤。

其中枯草芽孢杆菌的培养可以根据本领域的常规方法进行，例如摇瓶培养、批次培养、连续培养和分批补料培养等，并可以根据实际情况选择合适的培养条件如温度、时间和培养基的pH值等。此外，可以从细胞或培养基中回收或纯化维生素B₂的方法可采取本领域常规的方法，例如过滤、阴离子交换色谱、结晶和HPLC等方法。

本发明中未详细描述的实验操作均可按照本技术领域的常规实验操作进行。

本发明的技术特点在于：

选取枯草芽孢杆菌中的假尿苷合成酶基因ylyB，对其第239位组氨酸定点突变为亮氨酸，得到假尿苷合成酶突变体(H239L)。发现假尿苷合成酶基因ylyB经过突变后，其活性明显增强，推动尿嘧啶生成假尿苷，而尿嘧啶生成假尿苷后，减少了胞内尿嘧啶，使得磷酸核糖焦磷酸(PRPP)可以被积累，进一步地PRPP又可以作为嘌呤从头合成途径和补救合成途径的前体，因而可以增强GTP的合成，为维生素B₂提供充足的前体物质，提高维生素B₂的产量。

本发明的有益效果在于：

1、本发明以假尿苷合成酶ylyB为基础，选择第239位的氨基酸进行定点突变，将枯草芽孢杆菌BS-1中假尿苷合成酶编码基因ylyB变为假尿苷合成酶突变体(H239L)与枯草芽孢杆菌BS-1相比，含有假尿苷合成酶突变体(H239L)的菌株可以提高产维生素B₂的能力达10.8％，因而在制备维生素B₂中具有很大的应用价值。

2、经研究证实，本发明中含有假尿苷合成酶突变基因的基因工程菌生物安全，进一步的，实验表明染色体上基因突变不仅未对菌体的生长造成影响，反而对菌体的生长有益，故可以进一步地提高含有假尿苷合成酶突变体(H239L)的菌株生产维生素B₂的能力。

附图说明

图1是不同枯草芽孢杆菌菌株发酵41h后的VB₂产量。

具体实施方式

本发明的以下实施例和附图仅说明实现本发明的具体实施方案，这些方案和附图不可以理解为对本发明的限制，任何在不脱离本发明的原理和实质的情况下所做的任何改变，均落在本发明的保护范围之内。

本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。

本实施例中所述的高产维生素B₂的枯草芽孢杆菌，保藏编号为CGMCC NO.4018。枯草芽孢杆菌BS-1，保藏编号为CGMCC NO.4019。枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168为枯草芽孢杆菌模式菌株。

培养基配方：

LB培养基(g/L)：氯化钠10，胰蛋白胨10，酵母提取物5，固体培养基加琼脂粉18。

发酵培养基(g/L)：玉米浆干粉2、葡萄糖50、酵母膏5、硫酸镁0.05、硫酸铵0.5，其余为蒸馏水。

OD600的检测：

利用分光光度计测定发酵液在600nm下的浊度，快速准确得知发酵液中的生物量。精确移取一定体积的发酵液置于棕色容量瓶中，蒸馏水定容，混匀后置于比色杯中，以蒸馏水为参比空白，在600nm波长下测定生物量，OD600＝读数×稀释倍数。

维生素B₂的检测方法：

发酵液混匀，用0.01mol/L NaOH将其稀释到适当的倍数后，混匀，避光碱溶20min，12000rpm离心2min，取上清液以0.01mol/L NaOH做空白在444nm下测定吸光度(显示值控制在0.2-0.8之间)，按以下公式计算核黄素的含量：FB(mg/L)＝(稀释倍数*吸光度)/0.0321。

实施例1：ylyB基因突变位点的确认与验证

由于ylyB基因在枯草芽孢杆菌中负责编码假尿苷合成酶，推动尿嘧啶生成假尿苷，因此选择针对ylyB基因进行定点突变。

发明人对于ylyB基因编码的假尿苷合成酶，使用Jalview软件对其氨基酸序列高保守区域进行分析。同时使用Swiss-Model工具对ylyB基因的假尿苷合成酶进行蛋白质模拟建模，并使用HotSpot Wizard 2.0对该酶的活性中心进行预测。发现ylyB基因编码的假尿苷合成酶氨基酸序列的第239位，位于活性中心及高保守区域附近，对其进行定点突变极有可能提导致假尿苷合成酶活性提高。

本发明人前期筛选出了一株高产维生素B₂的枯草芽孢杆菌(CGMCC NO.4018)，可发酵生产维生素B₂。为了进一步验证ylyB基因编码的假尿苷合成酶氨基酸序列的第239位的作用，以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168的基因组为参考基因组，将高产维生素B₂的枯草芽孢杆菌送到金唯智生物科技有限公司进行测序，以发现对维生素B₂能力有影响的基因。通过序列对比分析，发现高产维生素B₂的枯草芽孢杆菌发生了大量突变，共包含203个突变位点，经过突变统计，突变共涉及50个基因，其中就包括ylyB基因。

进一步的，以高产维生素B₂的枯草芽孢杆菌的基因组为模板，以UPylyB-F，DNylyB-R为引物，克隆ylyB基因及上下游序列，得到PCR产物，然后将PCR产物送到金唯智生物科技有限公司进行测序。通过序列对比分析，发现高产维生素B₂的枯草芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168相比，ylyB基因发生突变，共包含4个突变位点，其中就包括第239位。其中枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168的ylyB基因核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，其编码的RNA解旋酶氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

除第239位突变为非同义突变外，另外三个位点的突变均为同义突变，不影响蛋白质结构。由以上结果可知，ylyB基因编码的假尿苷合成酶氨基酸序列的第239位是影响维生素B₂产量的关键位点，根据此位点设计假尿苷合成酶突变体(H239L)，其氨基酸序列如SEQID No.4所示，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

实施例2：构建ylyB回复突变的工程菌株18-yB

以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168染色体为模板，用引物UPylyB-F、UPylyB-R(含DR)扩增带接头的野生型的UPylyB(含DR)片段，用引物araR-F、araR-R(含DR)扩增带接头的araR(含DR)片段；以pC194质粒为模板，用引物cat-F、cat-R扩增带接头的cat片段；以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168的染色体为模板，用引物DNylyB-F、DNylyB-R扩增下游同源臂片段DNylyB，其中所述ylyB基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

以UPylyB片段、cat片段、araR片段和DNylyB片段为模板，用引物UPylyB-F、DNylyB-R进行融合PCR，得到组装片段UCR-ylyB，经核酸电泳检测正确，胶回收后得到纯化的UCR-ylyB片段。

将UCR-ylyB片段Spizizen转化高产维生素B₂的枯草芽孢杆菌(CGMCC NO.4018)，涂布于含有8mg/L氯霉素的LB固体平板上，培养24h后进行菌落PCR验证，核酸电泳正确的送金唯智测序，测序正确后，获得含有ylyB基因的中间菌株4018-UCR-ylyB，其中所述ylyB基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

挑取中间菌株4018-UCR-ylyB的单菌落于含有5mL LB的试管中，37℃振荡培养8h后，取200uL菌液涂布于含有40mg/L新霉素的LB固体平板上，培养24h后进行菌落PCR验证，核酸电泳正确的送金唯智测序，测序正确后，获得了染色体内部通过DR发生同源重组而去掉筛选标记cat-araR且含有ylyB基因的回复突变的工程菌株18-yB，其中所述ylyB基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

本部分所用引物如下：

本部分所用到的菌株及质粒如下：

实施例3：构建含ylyB突变体的工程菌株19-yB

以人工合成的假尿苷合成酶突变体(H239L)的编码基因为模板用引物UPylyB-F、UPylyB-R(含DR)扩增带接头的且带有点突变的UPylyB(含DR)片段，用引物araR-F、araR-R(含DR)扩增带接头的araR(含DR)片段；以pC194质粒为模板，用引物cat-F、cat-R扩增带接头的cat片段；以枯草芽孢杆菌B.subtilis 168的染色体为模板，用引物DNylyB-F、DNylyB-R扩增下游同源臂片段DNylyB。其中，所述假尿苷合成酶突变体(H239L)的核苷酸序列如SEQID No.2所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

将UCR-ylyB片段Spizizen转化枯草芽孢杆菌BS-1(CGMCC NO.4019)，涂布于含有8mg/L氯霉素的LB固体平板上，培养24h后进行菌落PCR验证，核酸电泳正确的送金唯智测序，测序正确后，获得含有假尿苷合成酶突变体(H239L)的中间菌株4019-UCR-ylyB。其中，所述假尿苷合成酶突变体(H239L)的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

挑取中间菌株4019-UCR-ylyB的单菌落于含有5mL LB的试管中，37℃振荡培养8h后，取200uL菌液涂布于含有40mg/L新霉素的LB固体平板上，培养24h后进行菌落PCR验证，核酸电泳正确的送金唯智测序，测序正确后，获得了染色体内部通过DR发生同源重组而去掉筛选标记cat-araR且含有假尿苷合成酶突变体(H239L)的工程菌株19-yB。其中。所述含有假尿苷合成酶突变体(H239L)的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

本部分所用到的菌株及质粒如下：

实施例4：评价不同菌株的维生素B₂生产能力

将工程菌株19-yB和枯草芽孢杆菌BS-1(CGMCC NO.4019)分别作为实验组和对照组，工程菌株18-yB和高产维生素B₂的枯草芽孢杆菌(CGMCC NO.4018)分别为实验组和对照组，进行菌株维生素B₂生产能力评价。

1、菌株培养条件

在无菌条件下用接种针划线含有20mg/L新霉素的LB固体平板，在37℃培养箱中倒置培养24-48h，以获得新鲜活化的单菌落。用接种针挑取单菌落划线含有20mg/L新霉素的LB固体斜面，在37℃培养箱中培养48h。刮取斜面上1/3的菌苔接种含有70mL发酵培养基的500mL挡板三角瓶中(每株菌3个平行)，37℃、200rpm振荡培养41h后取发酵液测定OD600和维生素B₂产量。

2、不同菌株OD600和维生素B₂产量的比较

工程菌株19-yB和枯草芽孢杆菌BS-1，含有假尿苷合成酶突变体(H239L)的菌株19-yB的维生素B₂产量提高了10.8％，工程菌株18-yB和高产维生素B₂的枯草芽孢杆菌相比，回复突变的菌株18-yB的维生素B₂产量下降了9.8％(参见下表4和图1)。

实验结果表明，本发明以假尿苷合成酶ylyB为基础，选择第239位的氨基酸进行定点突变，将枯草芽孢杆菌BS-1中假尿苷合成酶ylyB变为假尿苷合成酶突变体(H239L)，与出发菌株相比，含有假尿苷合成酶突变体(H239L)的菌株可以提高产维生素B₂的能力达10.8％，因而在制备维生素B₂中具有很大的应用价值。

另外，本发明中含有假尿苷合成酶突变基因的基因工程菌生物安全，进一步的，含有假尿苷合成酶突变基因的工程菌株19-yB的生物量高于出发菌株枯草芽孢杆菌BS-1，说明ylyB基因的点突变对菌体的生长有益，可以进一步地提高含有假尿苷合成酶突变体(H239L)的菌株生产维生素B₂的能力。

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<110> 新发药业有限公司

<120> 假尿苷合成酶突变体、突变基因及其在制备维生素B2中的应用

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