一种小儿咽扁颗粒中麦冬掺伪检验方法
阅读说明：本技术 一种小儿咽扁颗粒中麦冬掺伪检验方法 (Method for detecting adulteration of radix ophiopogonis in children throat and tonsil particles ) 是由 胡亮 罗疆南 周明 文庆 王湘波 李瑞莲 于 2021-08-31 设计创作，主要内容包括：本发明采用超高效液相色谱和质谱的联用的方法检测小儿咽扁颗粒中是否含有麦冬掺伪成分山麦冬皂苷B和短葶山麦冬皂苷C。具体过程如下：分别制备一定浓度的供试品溶液和对照品溶液,并分别采用超高效液相色谱-质谱联用仪进行检测,并分别获得供试品溶液和对照品溶液的选择离子色谱图,然后进行掺伪分析；当供试品溶液和对照品溶液的选择离子色谱图中,出峰时间相同且峰面积比一致时视为掺伪。本发明所述的检测方法能排除小儿咽扁颗粒中其他7种药味的干扰；并同时兼具专属性强、灵敏度较好、精密度好、重复性好、稳定性强及回收率高的特点；且该方法能够检测出市面上掺伪10％以上的山麦冬。(The method provided by the invention adopts a method of combining ultra-high performance liquid chromatography and mass spectrometry to detect whether the children pharyngeal and prolapsus granule contains liriope spicata saponin B and liriope muscari saponin C which are pseudo-doped ingredients of radix ophiopogonis. The specific process is as follows: respectively preparing a test solution and a reference solution with certain concentrations, respectively detecting by using an ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometer, respectively obtaining selective ion chromatograms of the test solution and the reference solution, and then performing adulteration analysis; and when the peak emergence time is the same and the peak area ratio is consistent in the selective ion chromatograms of the test solution and the reference solution, the sample solution and the reference solution are considered to be adulterated. The detection method can eliminate the interference of other 7 medicinal flavors in the children throat and flat granules; meanwhile, the method has the characteristics of strong specificity, good sensitivity, good precision, good repeatability, strong stability and high recovery rate; and the method can detect the wild ophiopogon root which is adulterated by more than 10% in the market.)
技术领域
本发明涉及一种麦冬掺伪检验方法，特别是一种小儿咽扁颗粒中麦冬掺伪检验方法。
背景技术
小儿咽扁颗粒为甲类非处方药，处方由金银花、射干、金果榄、桔梗、玄参、麦冬、人工牛黄(体外培育牛黄)和冰片八味药组成，麦冬处方量为78.1g，在制剂中的处方量占比为第三。方中金银花清热解毒、轻宣疏散，射干祛痰利咽，共为君药；金果榄清咽止痛，桔梗开宣肺气，化痰利咽，玄参、麦冬养阴润燥、散结利咽，共为臣药；人工牛黄(体外培育牛黄)清热解毒、化痰开窍，冰片清热止痛、醒神开窍，共为佐药；诸药合用，共奏清热利咽，解毒止痛之功。
目前市场上麦冬的混伪品主要为山麦冬，与麦冬一起收载于《中国药典》2020年版一部，两者功能与主治相同，均具有养阴生津，润肺清心的作用。其中麦冬为百合科植物麦冬Ophiopogon japonicus(L.f)Ker-Gawl.的干燥块根；山麦冬为百合科植物湖北麦冬Liriope spicata(Thunb.)Lour.Var.prolifera Y.T.Ma或短葶山麦冬Liriope muscari(Decne.)Baily的干燥块根。经查阅相关文献，麦冬、山麦冬主要成分为甾体皂苷类，麦冬主要含麦冬皂苷A、麦冬皂苷D等，湖北麦冬主要含山麦冬皂苷B，短葶山麦冬主要含有短葶山麦冬皂苷C。所以麦冬掺伪检测实质上也是检测样品中是否有含有山麦冬皂苷B和短葶山麦冬皂苷C。在目前的检测方法中往往存在一些缺陷，(1)采用薄层色谱法对山麦冬特征成分进行检查时，存在灵敏度不足、专属性不强，斑点有干扰导致假阳性，无法准确判断小儿烟扁颗粒中是否存在山麦冬掺伪情况；(2)采用高效液相色谱蒸发光(HPLC-ELSD)法对山麦冬特征成分进行检查时，灵敏度低、专属性差，无法检测到山麦冬特征性成分，导致假阴性的结果。
并且麦冬在不同的医药产品中，由于干扰成分不一样，其检测难度和检测方法也有所不同。故此研究一种兼具专属性强、灵敏度较好、精密度好、重复性好、稳定性强及回收率高，且适用于小儿咽扁颗粒中麦冬掺伪检验方法尤为重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术不足，提供一种能排除金银花、射干、金果榄、桔梗、玄参、人工牛黄(体外培育牛黄)和冰片八兼7种药味的干扰，且兼具专属性强、灵敏度较好、精密度好、重复性好、稳定性强及回收率高的小儿咽扁颗粒中麦冬掺伪检验方法。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
一种小儿咽扁颗粒中麦冬掺伪检验方法，包括以下步骤：
S1样品的制备：
供试品溶液的制备：将小儿咽扁颗粒溶于甲醇中，超声20-60min后过滤，得供试品溶液；
对照品溶液的制备：分别制备山麦冬皂苷B对照品溶液和短葶山麦冬皂苷C对照品溶液；
山麦冬皂苷B对照品溶液：精密称定山麦冬皂苷B对照品，并将其溶于甲醇溶液中得山麦冬皂苷B对照品溶液；
短葶山麦冬皂苷C对照品溶液：精密称定短葶山麦冬皂苷C对照品，并将其溶于甲醇溶液中得短葶山麦冬皂苷C对照品溶液；
S2掺伪分析：将S1所得的供试品溶液和对照品溶液，分别用超高效液相色谱-质谱仪进行检测，分别获得供试品溶液和对照品溶液的选择离子色谱图，然后进行掺伪分析；
所述掺伪分析具体是：当供试品溶液和对照品溶液的选择离子色谱图中，供试品溶液和对照品溶液所对应的离子对的出峰时间相同且供试品溶液和对照品溶液的峰面积比一致时视为掺伪。
进一步地，S1中供试品溶液的制备还包括预处理，所述预处理为对小儿咽扁颗粒预先进行研磨处理。
进一步地，S1中供试品溶液的浓度为3-5×105μg/ml，对照品溶液的浓度为1-3μg/ml，S2中供试品溶液和对照品溶液检检测时的用量均为2-5μl。
进一步地，S2中，所述高效液相色谱-质谱仪的检测参数设置如下：
仪器：Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000超高效液相色谱仪，TSQEndura三重四极杆质谱系统；
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以浓度为10mmol/L的乙酸铵溶液为流动相A，乙腈为流动相B，按下表进行梯度洗脱，且流动相A和流动相B的流速均为0.2-0.3ml/min；
时间(min)
流动相A
流动相B
0～1.5
55
45
1.5～8
55→5
45→95
质谱条件：电离源条件设置如下：为负离子模式ESI-，喷雾电压为2500-3800V，鞘气为20Arb，辅助气为10Arb，离子传输管温度为350℃，蒸发温度为350℃，扫描模式为MRM，碰撞气体为氩气，监测离子对见下表：
筛查成分
母离子
子离子
山麦冬皂苷B
721.2
575.3、89.1
短葶山麦冬皂苷C
870.2
738.3、576.2
进一步地，所述喷雾电压优选为3500V，所述山麦冬皂苷B子离子m/z 575.3、89.1碰撞能量分别为23.0V、32.6V，短葶山麦冬皂苷C子离子m/z 738.3、576.2碰撞能量分别为26.5V、32.9V。
进一步地，S2中，所述掺伪分析具体是：供试品溶液和对照品溶液所对应的离子对的出峰时间相同且供试品溶液和对照品溶液的峰面积比一致时视为掺伪，具体参照标准如下：
进一步地，S1中供试品溶液的制备还包括预处理，所述预处理为对小儿咽扁颗粒预先进行研磨处理。
进一步地，上述任一种小儿咽扁颗粒中麦冬掺伪检验方法中所检测的小儿咽扁颗粒为《中国药典》2020年版一部P568所记载的小儿咽扁颗粒。
本发明中，检测山麦冬皂苷B和短葶山麦冬皂苷C的对象为小儿咽扁颗粒，该成方试剂处方中，主要的药味干扰有7种，即金银花、射干、金果榄、桔梗、玄参、人工牛黄(体外培育牛黄)和冰片八；本发明采用高效液相色谱和质谱的联用，对比特征成分山麦冬皂苷B和短葶山麦冬皂苷C的出峰时间和峰面积比是否同时一致，当同时满足一致时视为含有相对应的特征成分；当检测出样品中含山麦冬皂苷B和短葶山麦冬皂苷C任一项时即为掺伪。本发明通过判断指标及限度的确定，能够检测出市面上掺伪10％以上的山麦冬。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：(1)能排除小儿咽扁颗粒中金银花、射干、金果榄、桔梗、玄参、人工牛黄(体外培育牛黄)和冰片八7种药味的干扰；(2)该检测方法能同时兼具专属性强、灵敏度较好、精密度好、重复性好、稳定性强及回收率高的特点；(3)能够检测出市面上掺伪10％以上的山麦冬。
附图说明
图1为实施例1中供试品溶液X中山麦冬皂苷B的选择离子色谱图。
图2为实施例1中供试品溶液Y中短葶山麦冬皂苷C的选择离子色谱图。
图3为实施例1中山麦冬皂苷B对照品溶液的选择离子色谱图。
图4为实施例1中短葶山麦冬皂苷C对照品溶液的选择离子色谱图。
图5为实施例1中麦冬皂苷D对照品溶液的选择离子色谱图。
图6为流动相0.1％甲酸溶液时山麦冬皂苷B的选择离子色谱图。
图7为流动相10mmol/L乙酸铵溶液的山麦冬皂苷B的选择离子色谱图。
图8为麦冬皂苷D子离子优化图。
图9为麦冬皂苷D子离子强度响应图[m/z 721.3(a)、575.3(b)、707.33(c)]。
图10为麦冬皂苷D子离子[m/z 721.3(a)、575.3(b)]碰撞能量优化图。
图11为麦冬皂苷B子离子优化图。
图12为麦冬皂苷B子离子强度响应图[m/z 575.3(a)、103.05(b)、89.1(c)]。
图13为麦冬皂苷B子离子[m/z 575.3(a)、89.1(b)]碰撞能量优化图。
图14为麦冬皂苷C子离子优化图。
图15为麦冬皂苷C子离子强度响应图[m/z 738.3(a)、576.2(b)、708.3(c)]。
图16为麦冬皂苷C子离子[m/z 738.3(a)、576.2(b)]碰撞能量优化图。
图17为2号样品麦冬对照药材的选择离子色谱图，其中(a)表示山麦冬皂苷B的检。测，(b)表示短葶山麦冬皂苷C的检测，(c)表示麦冬皂苷D的检测。
图18为3号山麦冬(湖北麦冬)对照药材的选择离子色谱图,其中(a)表示山麦冬皂苷B的检测，(b)表示短葶山麦冬皂苷C的检测，(c)表示麦冬皂苷D的检测。
图19为6号样品的选择离子色谱图。
图20为7号样品的选择离子色谱图。
图21为专属性实验中阴性对照溶液中山麦冬皂苷B的选择离子色谱图。
图22为为专属性实验中阴性对照溶液中短葶山麦冬皂苷C的选择离子色谱图。
图23为山麦冬皂苷B的线性图。
图24为短葶山麦冬皂苷C的线性图。
具体实施方式
实施例1
S1样品的制备：
供试品溶液的制备：将X和Y两个公司购得的小儿咽扁颗粒先研细，再分别取4g溶于甲醇中，超声30min，冷却后过滤，分别得供试品溶液X和供试品溶液Y；
对照品溶液的制备：
山麦冬皂苷B对照品溶液：精密称定山麦冬皂苷B对照品，并将其溶于甲醇溶液中得山麦冬皂苷B对照品溶液；
短葶山麦冬皂苷C对照品溶液：精密称定短葶山麦冬皂苷C对照品，并将其溶于甲醇溶液中得短葶山麦冬皂苷C对照品溶液；
麦冬皂苷D对照品溶液:精密称定短葶山麦冬皂苷D对照品，并将其溶于甲醇溶液中得短葶山麦冬皂苷D对照品溶液；
上述三个对照品溶液的溶度均为2μg/ml；且三个对照品均由中检院标本馆提供。
S2掺伪分析：分别取S1所得的供试品溶液和对照品溶液5μl，并采用超高效液相色谱-质谱仪进行检测，并分别获得供试品溶液和对照品溶液的选择离子色谱图，然后进行掺伪分析；
图1-5，分别为供试品溶液X、供试品溶液Y、山麦冬皂苷B对照品溶液、短葶山麦冬皂苷C对照品溶液、麦冬皂苷D对照品溶液的选择离子色谱图。
表1为实施例1中三个对照品溶液样品的参比数据
表1即为中国药典2015年版通则0512和通则0431的测定参比规定。
表2为实施例1中X和Y两个公司的参比数据
对比表1和表2可知，筛查过程中X公司样品中检出与山麦冬皂苷B对照品出峰时间一致的色谱峰，且样品监测离子对峰面积比与对照品的监测离子对峰面积比一致；Y公司样品中检出与短葶山麦冬皂苷C对照品出峰时间一致的色谱峰，且样品监测离子对峰面积比与对照品的监测离子对峰面积比一致；故此X公司和Y公司生产的小儿咽扁颗粒均为掺伪10％以上不合格产品。
提示部分企业在生产过程中存在掺山麦冬或使用山麦冬替代麦冬投料的情况，该发明方法可以有效打击不按生产工艺生产、涉嫌掺伪掺假投料生产的行为，为人民群众用药安全提供坚实的保障。
下面还对本方案进行了参数的优化和方法学的验证：
1、液相色谱条件的优化
对不同品牌超高效液相色谱柱(weltch ultimate C18、Thermo C18)、不同进样量1、3、5μl，流速0.2、0.3ml/min，柱温30℃、35℃，流动相10mmol/L乙酸铵溶液、0.1％甲酸溶液梯度洗脱进行考察，结果表明，不同品牌色谱柱、流速、柱温对测定结果影响较小，但采用0.1％甲酸为流动相、进样量为5μl时山麦冬皂苷B对照品提取离子色谱图存在拖尾现象(见图6)；采用10mmol/L乙酸铵溶液为流动相可以较好解决山麦冬皂苷B色谱图峰形欠佳问题(见图7)，梯度洗脱条件见表3。
表3梯度洗脱条件表
时间(min)
流动相A
流动相B
0～1.5
55
45
1.5～8
55→5
45→95
2、质谱条件的优化
本发明方法采用统一的离子源，均为负离子模式ESI-，克服了不同离子源的切换对样品检测带来的影响，喷雾电压优化范围2500-3800V，最终确定3500V时仪器响应较高，鞘气为20Arb，辅助气为10Arb，离子传输管温度为350℃，蒸发温度为350℃，扫描模式为MRM，碰撞气体为高纯氩气。
麦冬皂苷类成分离子对优化过程中，麦冬皂苷D母离子为m/z 853.3，得到3个子离子，分别为m/z 721.3、575.3、707.3(见图8)，其响应强度分别为497801、57551、11195(见图9)，本发明选取离子相应强度较高的2个离子(m/z 721.3、575.3)作为子离子，对其碰撞能量(15-55V)进行优化，结果表明碰撞能量分别为27.0V，32.9V时，响应强度高(见图10)。
山麦冬皂苷B母离子为m/z 721.2，得到3个子离子，分别为m/z 575.3、103.05、89.1(见图11)，根据响应强度选取2个离子(m/z 575.3、89.1)作为子离子(见图12)，对其碰撞能量(15-55V)进行优化，结果表明碰撞能量分别为23.0V，32.6V时，响应强度高(见图13)。
短葶山麦冬皂苷C母离子为m/z 870.2，得到3个子离子，分别为m/z 738.3、576.2、708.3(见图14)，根据响应强度选取2个离子(m/z 738.3、576.2)作为子离子(见图15)，对其碰撞能量(15-55V)进行优化，结果表明碰撞能量分别为26.5V，32.9V时，相应强度高(见图16)。
3、判断指标及限度的确定
为了判断本方案的指及限度，一共制备了八个编号不同批次的样品，具体的样品制备过程如下：
所有1号样品，按照实施例1中的供试品溶液的制备方法制备；
对照品药材的制备(2-4号)：取各企业提供的麦冬药材及收集的山麦冬药材各1g，精密称定，加甲醇15ml，超声处理30分钟(300W，50kHz)，放冷，过滤，取续滤液，即得。
阳性供试品溶液的制备(5-8号)：
《中国药典》2015年版四部中规定，药材允许含杂质的限度为3％，为避免误判，拟按含3％山麦冬样品进行供试品溶液浓度考察。
分别按小儿咽扁颗粒处方及制法按3％、6％、10％、100％的比例掺入山麦冬投料，制成含3％、6％、10％、100％山麦冬的模拟样品。
取上述模拟样品各4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加甲醇10ml，称定重量，超声处理30分钟(300W，50kHz)，放冷，再称定重量，加甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
测定结果见表4及图17～20。
结果表明，麦冬皂苷D为麦冬及山麦冬的共有成分，而山麦冬皂苷B为山麦冬的特有成分。经查阅中国药典及相关文献，山麦冬中短葶山麦冬含短葶山麦冬皂苷C，故本次研究中暂以山麦冬皂苷B及短葶山麦冬皂苷C作为考察指标。
实验表明，当山麦冬(湖北麦冬)的掺入量大于10％时，即可检出山麦冬皂苷B，可排除药材中允许含3％杂质的干扰，同时通过调研，山麦冬中短葶山麦冬在市场上流通较少，未收集到药材，为严格控制小儿咽扁颗粒成方制剂的质量，故将山麦冬掺伪检查的限度定为不得检出。
表4-1对照药材及各药材检出结果表
表4-2样品出峰时间和峰面积比结果表
4、方法学的测定
在方法学的测定过程中，利用到了不同溶度的对照品溶液，其制备过程藏着实施例1，具体如下：
短葶山麦冬皂苷C对照品溶液：精密称取短葶山麦冬皂苷C对照品10.96mg，置100ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容，即得短葶山麦冬皂苷C对照品溶液①(109.6μg/ml)精密吸取上述对照品溶液1ml分别置10ml及50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得短葶山麦冬皂苷C对照品溶液(②10.96μg/ml，③2.192μg/ml)。
山麦冬皂苷B对照品溶液:精密称取山麦冬皂苷B对照品12.94mg，置100ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容，即得短葶山麦冬皂苷C对照品溶液①(129.4μg/ml)精密吸取上述对照品溶液1ml分别置10ml及50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得短葶山麦冬皂苷C对照品溶液(②12.94μg/ml，③2.588μg/ml)。
麦冬皂苷D对照品溶液：精密称取麦冬皂苷D对照品10.41mg，置5ml量瓶中，用甲醇溶解并定容，精密吸取上述对照品溶液1ml到10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得麦冬皂苷D对照品溶液(①2.082mg/ml，②20.82μg/ml)。
(一)专属性实验
按处方称取缺麦冬的其它药味，制成缺麦冬的阴性对照样品，同法制备缺麦冬的阴性对照溶液。精密吸取短葶山麦冬皂苷C对照品溶液③、山麦冬皂苷B对照品溶液③，阴性对照溶液5μl，测定，结果见图21～22。缺麦冬阴性对照溶液与短葶山麦冬皂苷C对照品、山麦冬皂苷B对照品色谱出峰时间相同的位置上均无相应离子流，表明处方中其它药味对测定结果无干扰，专属性强。
(二)灵敏度
山麦冬皂苷B检测限
以m/z 721.2→89.11作为检测离子对进行检测，精密吸取山麦冬皂苷B对照品溶液③1μl，注入UPLC-MS-MS仪，特征峰的信噪比为23，计算出检出限为0.28ng，仪器灵敏度较好。
短葶山麦冬皂苷C检测限
以m/z 870.2→576.2作为检测离子对进行检测，精密吸取短葶山麦冬皂苷C对照品溶液③1μl，注入UPLC-MS-MS仪，特征峰的信噪比为12，计算出检出限为0.65ng，仪器灵敏度较好。
(三)精密度试验
山麦冬皂苷B精密度
精密吸取山麦冬皂苷B对照品溶液③5μl，注入UPLC-MS-MS仪，连续进样6针，测定，结果见表5。以m/z721.2→575.3提取的供试品离子流色谱中，峰面积值RSD为4.2％，精密度好。
短葶山麦冬皂苷C精密度
精密吸取短葶山麦冬皂苷C对照品溶液③5μl，注入UPLC-MS-MS仪，连续进样6针，测定，结果见表5。以m/z 870.2→738.3提取的供试品离子流色谱中，峰面积值RSD为3.1％，精密度好。
表5精密度试验结果
(四)重复性试验
山麦冬皂苷B
取同一批阳性供试品(河北承德燕峰药业有限责任公司生产批号为：19852001)，依法制备6份供试品溶液，测定，结果见表6。供试品中山麦冬皂苷B测得结果RSD为5.80％。
表6重复性试验结果(m/z721.2→575.3)
短葶山麦冬皂苷C
取阳性供试品(山西迈迪制药有限公司生产批号为：521802)，依法制备6份供试品溶液，测定，结果见表7。供试品中短葶山麦冬皂苷C测得结果RSD为3.81％。
表7重复性试验结果(m/z 870.2→738.3)
(五)稳定性试验
山麦冬皂苷B
取重复性下供试品溶液①，分别于制备后的0、1、2、4、8、16小时，精密吸取5μl，注入UPLC-MS-MS，测定，结果见表8。试验结果表明供试品溶液在制备后16小时内基本稳定。
表8供试品溶液稳定性试验结果
短葶山麦冬皂苷C
取重复性下供试品溶液①，分别于制备后的0、1、2、4、8、16小时，精密吸取5μl，注入UPLC-MS-MS，测定，结果见表9。试验结果表明供试品溶液在制备后16小时内基本稳定。
表9供试品溶液稳定性试验结果
(六)线性关系试验
山麦冬皂苷B
精密吸取山麦冬皂苷B对照品溶液②2μl、5μl、10μl及山麦冬皂苷B对照品溶液③1μl、3μl、5μl按上述色谱条件，注入液相色谱仪，测得峰面积。以峰面积值为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程：Y＝1.380x+1006,r＝0.9975，在2.192ng～109.6ng范围内，山麦冬皂苷B进样量与色谱峰面积成线性关系。结果见表10和图23。
短葶山麦冬皂苷C
精密吸取短葶山麦冬皂苷C对照品溶液②2μl、5μl、10μl及短葶山麦冬皂苷C对照品溶液③1μl、3μl、5μl按上述色谱条件，注入液相色谱仪，测得峰面积。以峰面积值为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程：Y＝1.169x+1006,r＝0.9975，在2.588ng～129.400ng范围内，短葶山麦冬皂苷C进样量与色谱峰面积成线性关系。结果见表10和图24。
表10线性关系试验结果表
(七)回收率试验
取同一份阴性样品的粉末6份，每份约2.0g，分别精密称定，精密加入山麦冬皂苷B对照品及短葶山麦冬C对照品，依法制备供试品溶液，测定，计算，结果见表11。
表11回收率试验结果表