一种用于动物源性食品中头孢类药物残留量的检测方法
阅读说明：本技术 一种用于动物源性食品中头孢类药物残留量的检测方法 (Method for detecting residual quantity of cephalosporin drugs in animal derived food ) 是由 钟世欢 叶佳明 叶磊海 杨娜 苏敏 陈小丽 王京 秦芸桦 于 2021-09-09 设计创作，主要内容包括：本发明属于食品安全检测领域。技术方案是：一种用于动物源性产品中头孢类药物残留的检测方法,依照如下步骤进行：1)样品预处理：称取1-2g样品于50mL离心管中,加入10mL乙二胺四乙酸(EDTA)-磷酸盐缓冲溶液,50μL氯化胆碱邻甲苯酚混合溶液、0.05-0.1g磁性石墨烯分子印迹聚合物,涡旋、超声提取后,用磁力枪将磁性石墨烯分子印迹聚合物吸出；加入2mL 0.2％甲酸甲醇洗脱液将样品中的头孢类药物残留解析出来,氮气吹干后用1.0mL水复溶、过0.22μm滤膜,获得待测液；2)待测液的检测：运用HPLC-MS/MS,在质谱ESI源下正离子模式下测定。该方法选择性好、灵敏度高。(The invention belongs to the field of food safety detection. The technical scheme is as follows: a detection method for residual cephalo-type drugs in animal-derived products is carried out according to the following steps: 1) sample pretreatment: weighing 1-2g of sample, putting the sample into a 50mL centrifuge tube, adding 10mL of Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) -phosphate buffer solution, 50 mu L of choline chloride o-cresol mixed solution and 0.05-0.1g of magnetic graphene molecularly imprinted polymer, performing vortex extraction and ultrasonic extraction, and sucking out the magnetic graphene molecularly imprinted polymer by using a magnetic gun; adding 2mL of 0.2% formic acid methanol eluent to resolve cephalosporin drug residues in the sample, drying the cephalosporin drug residues with nitrogen, redissolving the cephalosporin drug residues with 1.0mL of water after drying the cephalosporin drug residues, and filtering the resolvent with a 0.22-micron filter membrane to obtain a solution to be detected; 2) and (3) detection of the liquid to be detected: the measurement was carried out in positive ion mode using HPLC-MS/MS under a mass spectrum ESI source. The method has good selectivity and high sensitivity.)
技术领域
本发明属于食品安全检测领域，尤其涉及一种动物源性食品中头孢类药物残留的检测方法。
背景技术
头孢类药物属于广谱抗生素，杀菌力强，然而过量使用头孢类药物会对人体健康带来潜在的危害，对儿童、老人，特别是胎儿的影响更大，严重者会导致胎儿病变、畸形甚至死亡。且由于细菌产生耐药性和过敏反应等原因，世界各国对部分动物源性产品中头孢类药物残留量均提出了限量要求。现国家标准针对动物源性食品中头孢类化合物检测发布了一系列测定方法。但操作较为繁琐，耗时较长，且对于同时测定这6种头孢类药物的检测方法尚未建立。
分子印迹技术(molecularly imprinted technique,MIT)是制备对模板分子具有特异选择性识别能力的聚合物-分子印迹聚合物的技术。该技术由于选择性较强、稳定性好、易于制备而受到广泛关注。石墨烯材料比表面积大及吸附能力优良，其原子以一种类似六角形蜂窝的形状排列，特殊的结构可以和其他有机化合物形成较强的π-π共轭体系，使其具备极好的耐酸碱性能和化学稳定性。通过将石墨烯化学性质修饰，具有更广泛的应用。若将石墨烯与磁性纳米材料结合起来，使其强吸附性能和便捷的磁性分离相结合，形成一种新型的磁性石墨烯复合材料，最后在石墨烯磁性纳米粒子表面合成分子印迹壳层。该磁性分子印迹聚合物不仅具有分子印迹的优势，能够特异性识别和吸附目标分子，而且能在磁场的作用下快速分离，同时由于石墨烯粒径较小，具有较大的比表面积，吸附容量较大，在兽药残留检测中有着广泛的应用前景。
发明内容
本发明的目的是克服动物源性产品中头孢类物质检测复杂的前处理手段，提供一种简便的头孢类药物残留的检测方法。该方法应具备选择性好、灵敏度高、检测时间短的特点，以提高检测效率。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种用于动物源性产品中头孢类药物残留的检测方法，依照如下步骤进行：
1)样品预处理：称取1-2g样品于50mL离心管中，加入10mL乙二胺四乙酸(EDTA) -磷酸盐缓冲溶液，50μL氯化胆碱邻甲苯酚混合溶液、0.05-0.1g磁性石墨烯分子印迹聚合物，涡旋、超声提取后，用磁力枪将磁性石墨烯分子印迹聚合物吸出；加入2mL 0.2％甲酸甲醇洗脱液将样品中的头孢类药物残留解析出来,氮气吹干后用1.0mL水复溶、过0.22μm滤膜，获得待测液；
2)待测液的检测：运用HPLC-MS/MS，在质谱ESI源下正离子模式下测定，外标法定量。
所述乙二胺四乙酸(EDTA)-磷酸盐缓冲溶液，按如下方法制备：称取30.25g乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA·2H2O)、6.0g磷酸二氢钠(NaH2PO4)，超纯水溶解，稀释至1 000mL，用磷酸氢二钠(Na2HPO4)调节pH值至8.5士0.1。
所述氯化胆碱邻甲苯酚混合溶液，按如下方法制备：氯化胆碱、邻甲苯酚、甲基叔丁基醚按0.1：0.2:1摩尔比例称取适量，在50℃恒定搅拌下加热，直至形成稳定的均匀透明的液体；将制备的混合溶液储存在密封的小瓶中并保存在干燥器中。
所述磁性石墨烯分子印迹聚合物，按如下方法制备：
(1)石墨烯的修饰：将石墨烯粉末置于-18℃冰箱中冷冻1小时，称取3g石墨烯粉末，缓慢加入200mL按3:1:0.1比例混合的浓硫酸H2SO4-浓硝酸HNO3-异丙醇混合溶液中，超声反应1h，在80℃下加热搅拌反应2h，抽滤，用蒸馏水涤至中性，于50℃真空干燥至恒重，研磨过筛得到修饰后石墨烯，备用；
(2)溶剂热法制备磁性碳纳米管：称取5.410g三氯化铁(FeCl3·6H2O)和3.475g硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)置于250mL平底烧瓶中加入100mL水，60℃下恒温磁力搅拌，全部溶解后，迅速加入25mL氨水、2g步骤(1)制得的修饰后石墨烯、5mL按1:1比例组成的乙二醇-聚乙二醇混合溶剂中，60℃下恒温磁力搅拌2h得到黑色的混合溶液，用乙醇和水洗数次，于50℃真空干燥至恒重，获得磁性碳纳米管备用；
(3)将步骤(2)得到的磁性碳纳米管、1mmol 7-氨基去乙酰氨基头孢磺酸、5mmol甲基丙烯酸、5mmol丙烯酸、1mL二甲基亚砜、50mL按9:1比例组成的乙醇-聚乙二醇混合溶液涡旋混合1min，再加入10mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯、0.2g聚乙烯吡咯烷酮、0.010g 引发剂偶氮二异丁脐(AIBN)，通氮气密封，80℃水浴超声5h；反应结束后磁场分离除去上清液，其余材料用体积比为9：1的甲醇-甲酸混合溶液反复超声洗涤，直至上清液经示差检测器检测不到模板分子为止，于50℃真空干燥至恒重，得到磁性石墨烯分子印迹聚合物。
超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪色谱条件为：
色谱柱：Agilent RRHD SB-C18色谱柱(2.1×100mm,1.8μm))；流速：0.25mL/min；进样量：2μL；柱温：35℃。溶液A-0.1％甲酸水溶液，B-乙腈(含0.1％甲酸)，梯度洗脱程序：0min，10％B％，0min-0.20min，11％B％，0.20min-3.00min，11％-90％B％， 3.00min-4.00min，90％B％，4.10min-11.00min，11％B％。
超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪质谱条件为：
离子源：电喷雾离子源(ESI源)。
喷雾压力：40psi。
干燥气流速：11L/min。
干燥气温度：300℃。
毛细管电压：3500V。
监测模式：正离子监测模式。监测离子对及相关电压参数设定见表1。
表1三重四极杆离子对及相关电压参数设定表
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1)将EDTA-磷酸盐缓冲溶液与疏水性低共熔溶剂(氯化胆碱邻甲苯酚混合溶液)相结合作为提取溶剂，极大的提高了头孢类物质的提取率；同比对不同提取液的提取效果进行实验，数据见表2；
表2不同提取液提取效果对比
可见，利用本发明提供的提取液对动物源性产品中头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢喹肟、头孢唑林、头孢噻呋药物进行提取选择性好，提取率明显高于磷酸盐缓冲溶液、EDTA 缓冲溶液、乙腈。同时对上述六种药物的提取率均能达到90％以上，提取溶剂用量仅为10mL, 减少了有机溶剂的使用，更加环保。
2)将修饰的磁性石墨烯分子印迹聚合物作为净化手段，减少了对固相萃取柱净化、氮吹浓缩等步骤，操作更加简便，能够去除大部分的基质干扰物，简化了前处理步骤，大大缩短了前处理时间(将预处理时间从数小时缩短至5分钟)，适合同时处理多批次样品，提高了检测效率。磁性石墨烯分子印迹聚合物能够循环使用，降低了检测成本。
3)通过色谱、质谱条件的优化，6个化合物的定量限均1.0μg/kg，灵敏度高，相对标准偏差(RSD)小于5％，回收率在90～110％，结果表明该方法灵敏度、精密度、准确度标准方法，适用于动物源性产品中头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢喹肟、头孢唑林、头孢噻呋药物残留的检测。
具体实施方式
下面结合具体实施例来详细说明本发明。
实施例1
1)样品预处理：称取2.0g猪肉样品于50mL离心管中，加入10mL乙二胺四乙酸-磷酸盐缓冲溶液、50μL氯化胆碱邻甲苯酚混合溶液、0.05g磁性石墨烯分子印迹聚合物，涡旋、超声提取后，用磁力枪将磁性石墨烯分子印迹聚合物吸出。加入2mL洗脱液(0.2％甲酸甲醇)将样品中的头孢类药物残留解析出来,氮气吹干后用1.0mL水复溶、过0.22μm滤膜，获得待测液；
2)待测液的检测：运用HPLC-MS/MS，在质谱ESI源下正离子模式下测定，外标法定量。
超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪色谱条件为：
色谱柱：Agilent RRHD SB-C18色谱柱(2.1×100mm,1.8μm))；流速：0.25mL/min；进样量：2μL；柱温：35℃。溶液A-0.1％甲酸水溶液，B-乙腈(含0.1％甲酸)，梯度洗脱程序：0min，10％B％，0min-0.20min，11％B％，0.20min-3.00min，11％-90％B％，3.00min-4.00min，90％B％，4.10min-11.00min，11％B％。
超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪质谱条件为：
离子源：电喷雾离子源(ESI源)。
喷雾压力：40psi。
干燥气流速：11L/min。
干燥气温度：300℃。
毛细管电压：3500V。
监测模式：正离子监测模式。监测离子对及相关电压参数设定见表3。
表3三重四极杆离子对及相关电压参数设定表
3)样品检测结果省略。
上述样品的检测数据准确性验证如下：
1)标准储备液的配置：分别称取头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢喹肟、头孢唑林、头孢噻呋各10mg，分别用超纯水溶解定容100.0mL，获得六种标准储备液，浓度均为 100μg/mL；
2)混合标准储备液的配置：分别吸取1.00mL头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢喹肟、头孢唑林、头孢噻呋标准储备液于同一100mL容量瓶中，混匀后用超纯水定容，得到1.00 μg/mL混合标准溶液；
3)基质工作液的配置：按前述样品预处理方法对阴性猪肉样品进行处理后，用获得的阴性猪肉样品基质溶液稀释混合标准储备液，制成1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、 15.0ng/mL、25.0ng/mL六种不同浓度的混合标准工作液；
4)上机检测；运用HPLC-MS/MS，在质谱ESI源下正离子模式下测定，外标法定量。
质谱仪色谱条件、质谱条件以及监测离子对及相关电压参数，均与前述待测液检测相同。
将混合标准工作液按由低到高浓度进样，在上述仪器条件下测定，以混合标准工作溶液浓度为横坐标，以目标化合物(六种头孢类药物)的峰面积比为纵坐标进行线性回归；其回归方程、相关系数、检出限和线性范围见表4；
表4猪肉中头孢类药物回归方程、相关系数、检出限和线性范围
由表4的结果可知，在猪肝基质中6种头孢类药物的回归方程相关系数均超过0.999；定量限：1.0μg/kg；线性范围1.0-25ng/mL；
称取三份阴性猪肉样品(每份2.0g)，按实施例1中步骤1)的样品预处理方法后，再分别添加1.0μg/kg、5.0μg/kg、10.0μg/kg三种浓度的混合标准工作液，进行加标回收试验考察回收率和精密度，结果见表5：
表5猪肉样品中回收率和精密度试验
由表5可知，在猪肉基质中本发明的6种头孢药物的平均回收率为92.4～101.5％，RSD 为2.0～3.4％。由以上结果可知，本实施例的回收率、精密度满足检测要求。
实施例2
1)样品预处理：称取2.0g鸡蛋样品于50mL离心管中，加入10mL乙二胺四乙酸-磷酸盐缓冲溶液，50μL氯化胆碱邻甲苯酚混合溶液、0.1g磁性石墨烯分子印迹聚合物，涡旋、超声提取后，用磁力枪将磁性石墨烯分子印迹聚合物吸出。加入1mL洗脱液(0.2％甲酸甲醇)将样品中的头孢类药物残留解析出来，氮气吹干后用1.0mL水复溶、过0.22μm滤膜，获得待测液；
2)待测液的检测：运用HPLC-MS/MS，在质谱ESI源下正离子模式下测定，外标法定量。
超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪色谱条件为：
色谱柱：Agilent RRHD SB-C18色谱柱(2.1×100mm,1.8μm))；流速：0.25mL/min；进样量：2μL；柱温：35℃。溶液A-0.1％甲酸水溶液，B-乙腈(含0.1％甲酸)，梯度洗脱程序：0min，10％B％，0min-0.20min，11％B％，0.20min-3.00min，11％-90％B％，3.00min-4.00min，90％B％，4.10min-11.00min，11％B％。
超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪质谱条件为：
离子源：电喷雾离子源(ESI源)。
喷雾压力：40psi。
干燥气流速：11L/min。
干燥气温度：300℃。
毛细管电压：3500V。
监测模式：正离子监测模式。监测离子对及相关电压参数设定见表6。
表6三重四极杆离子对及相关电压参数设定表
3)样品检测结果省略。
上述样品的检测数据准确性验证如下：
1)标准储备液的配置：分别称取头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢喹肟、头孢唑林、头孢噻呋各10mg，分别用超纯水溶解定容100.0mL，获得六种标准储备液，浓度均为 100μg/mL；
2)混合标准储备液的配置：分别吸取1.00mL头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢喹肟、头孢唑林、头孢噻呋储备液于同一100mL容量瓶中，混匀后用超纯水定容，得到浓度为1.00μg/mL的混合标准溶液；
3)基质工作液的配置：按步骤1)样品预处理方法对阴性鸡蛋样品进行处理后，用获得的阴性鸡蛋样品基质溶液稀释混合标准储备液，制成1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0 ng/mL、15.0ng/mL、25.0ng/mL六种不同浓度的混合标准工作液。
4)上机检测；运用HPLC-MS/MS，在质谱ESI源下正离子模式下测定，外标法定量；质谱仪色谱条件、质谱条件以及监测离子对及相关电压参数，均与前述待测液检测相同。
将混合标准工作液按由低到高浓度进样，在上述仪器条件下测定，以混合标准工作溶液浓度为横坐标，以目标化合物(六种头孢类药物)的峰面积比为纵坐标进行线性回归。其回归方程、相关系数、检出限和线性范围见表7。
表7鸡蛋中头孢类药物回归方程、相关系数、检出限和线性范围
由表7的结果可知，在鸡蛋基质中6种头孢类药物的回归方程相关系数均超过0.999；定量限：1.0μg/kg；线性范围1.0-25ng/mL。
称取三份阴性鸡蛋样品(每份2.0g)，按实施例2中步骤1)的样品预处理方法处理后，再分别添加1.0μg/kg、5.0μg/kg、10μg/kg三种浓度的混合标准工作液，进行加标回收试验考察回收率和精密度，结果见表8：
表8鸡蛋样品中回收率和精密度试验
由表8可知，在鸡蛋基质中本发明的6种头孢药物的平均回收率为92.5～102.5％，RSD 为2.1～4.1％。由以上结果可知，本实施例的回收率、精密度满足检测要求。
实施例3
1）样品预处理：称取2.0g牛奶样品于50mL离心管中，加入10mL乙二胺四乙酸-磷酸盐缓冲溶液，50μL氯化胆碱邻甲苯酚混合溶液、0.05g磁性石墨烯分子印迹聚合物，涡旋、超声提取后，用磁力枪将磁性石墨烯分子印迹聚合物吸出。加入1mL洗脱液(0.2%甲酸甲醇)将样品中的头孢类药物残留解析出来,氮气吹干后用1.0mL水复溶、过0.22μm滤膜，获得待测液；
2）待测液的检测：运用高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS），在质谱ESI源下正离子模式下测定，外标法定量。
超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪色谱条件为：
色谱柱：Agilent RRHD SB-C18色谱柱（2.1×100mm,1.8μm)）；流速：0.25mL/min；进样量：2μL；柱温：35℃。溶液A-0.1%甲酸水溶液，B-乙腈（含0.1%甲酸），梯度洗脱程序：0min，10%B%，0min-0.20min，11%B%，0.20min-3.00min，11%-90%B%，3.00min-4.00 min，90%B%，4.10min-11.00min，11%B%。
超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪质谱条件为：
离子源：电喷雾离子源（ESI源）。
喷雾压力：40psi。
干燥气流速：11L/min。
干燥气温度：300℃。
毛细管电压：3500V。
监测模式：正离子监测模式。监测离子对及相关电压参数设定见表9。
表9 三重四极杆离子对及相关电压参数设定表
3)样品检测结果省略。
上述样品的检测数据准确性验证如下：
1)标准储备液的配置：分别称取头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢喹肟、头孢唑林、头孢噻呋各10mg，分别用超纯水溶解定容100.0mL，获得六种标准储备液，浓度均为 100μg/mL；
2)混合标准储备液的配置：分别吸取1.00mL头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢喹肟、头孢唑林、头孢噻呋标准储备液于同一100mL容量瓶中，混匀后用超纯水定容，得到1.00 μg/mL混合标准溶液；
3)基质工作液的配置：按样品预处理方法对阴性牛奶样品进行处理后，用获得的阴性牛奶样品基质溶液稀释混合标准储备液，制成1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、 15.0ng/mL、25.0ng/mL六种不同浓度的混合标准工作液。
4)上机检测；运用HPLC-MS/MS，在质谱ESI源下正离子模式下测定，外标法定量；质谱仪色谱条件、质谱条件以及监测离子对及相关电压参数，均与前述待测液检测相同。
将混合标准工作液按由低到高浓度进样，在上述仪器条件下测定，以混合标准工作溶液浓度为横坐标，以目标化合物峰面积比为纵坐标进行线性回归。其回归方程、相关系数、检出限和线性范围见表10。
表10 牛奶中头孢类药物回归方程、相关系数、检出限和线性范围
由表10的结果可知，在牛奶基质中6种头孢类药物的回归方程相关系数均超过0.999；定量限：1.0μg/kg；线性范围1.0-25ng/mL。
三份阴性牛奶样品(每份2.0g)，按实施例3中步骤1)的样品预处理方法处理后，再分别添加1.0μg/kg、5.0μg/kg、10μg/kg三种浓度的混合标准工作液，进行加标回收试验考察回收率和精密度，结果见表11：
表11 牛奶样品中回收率和精密度试验
由表11可知，在牛奶基质中本发明的6种头孢药物的回收率为93.2～100.9％，RSD为 2.1～3.9％。由以上结果可知，本实施例的回收率、精密度满足检测要求。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：乌蛇止痒丸的指纹图谱构建和检测方法