具体实施方式

以下实验例是对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制

本发明中，术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同抗原决定簇的不同抗体的混合物)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们可以通过杂交瘤培养来合成，不会被其它免疫球蛋白污染。

本发明中，术语“人源化”是指其CDR来源于非人物种(优选小鼠)抗体，抗体分子中残余的部分(包括框架区和恒定区)来源于人抗体。此外，框架区残基可被改变以维持结合亲和性。

以下实施例中使用的检测方法说明如下：

SEC纯度、聚体检测方法：

流动相：200mM磷酸盐缓冲液，pH 6.8±0.1。经0.22μm滤膜过滤、超声脱气后使用。色谱柱：TSK G3000SWxl，7.8×300mm 5μm，TOSOH 08541。高效液相色谱仪：WatersAlliance e2695 2489紫外/可见光检测器，Dionex Ultimate 3000VWD-3400(RS)Detector或其他适合配有紫外检测器的HPLC系统。

系统适用性样品：取参考品用流动相稀释浓度至5.0mg/ml，13000rpm离心10min，取上清转移至进样瓶，放入HPLC样品盘。供试品：用流动相稀释供试品浓度至5.0mg/ml，13000rpm离心10min，取上清转移至进样瓶，放入HPLC样品盘。色谱条件：柱温25±2℃；样品温度10±2℃；检测波长UV 280nm；进样体积20μL；流速0.5ml/min。

用色谱软件进行积分，峰面积归一化法计算各个峰的峰面积百分比。系统适用性可接受标准：6针系统适用性样品，聚体与单体的分离度均≥1.5，主峰的保留时间RSD≤1.0％，主峰峰面积RSD≤2.0％，且主峰的不对称性均≤2.0，理论塔板数均≥4000。供试品报告结果：样品的SEC纯度报告为单体主峰的峰面积百分比，聚体含量为聚体峰的峰面积百分比。

IEC纯度检测方法：

流动相A：20mM磷酸盐缓冲液，pH 6.5±0.05。经0.22μm滤膜过滤、超声脱气后使用。流动相B：20mM磷酸盐缓冲液+200mM氯化钠，pH 6.5±0.05。经0.22μm滤膜过滤、超声脱气后使用。色谱柱：Propac WCX-10，4×250mm，Thermo Dionex 054993。高效液相色谱仪：Waters Alliance e2695，Dionex Ultimate 3000系列或其他适合配有紫外检测器的HPLC系统。

系统适用性样品：取参考品用流动相稀释浓度至1.0mg/ml，13000rpm离心10min，取上清转移至进样瓶，放入HPLC样品盘。供试品：用流动相稀释供试品浓度至1.0mg/ml，13000rpm离心10min，取上清转移至进样瓶，放入HPLC样品盘。色谱条件：柱温30±2℃；样品温度10±2℃；检测波长UV 214nm；进样体积20μL；流速1.0ml/min。流动相梯度如下：

纯度分析：用峰面积归一化法计算样品图谱上主峰、酸峰区和碱峰区的峰面积百分比。IEC纯度结果报告为主峰的峰面积百分比。

以下实施例中不包括对传统方法或本领域常规方法的详细描述。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述。

以下实施例中的蛋白若无特殊说明，均指抗PD-1抗体。

以下实施例中使用的抗PD-1抗体为重组抗PD-1人源化单克隆抗体，来源于WO2018137576A1(申请号为PCT/CN2018/073575)中公开的单克隆抗体mAb1-25-humanized。该抗体包括两条相同的轻链和两条相同的重链，系采用DNA重组技术在CHO细胞中表达的重组人源化IgG4型单克隆抗体。由抗PD-1鼠源抗体的重链和轻链可变区经人源化后，分别与人IgG4重链和kappa轻链的恒定区连接而成，可特异结合人PD-1。其重链的氨基酸序列如SEQ ID:1所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID:2所示。

mAb1-25-humanized的重链氨基酸序列SEQ ID NO：1

EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSSYDMSWVRQAPGKRLEWVATISGGGRYTYYPDTVKGRFTISRDNAKNSHYLQMNSLRAEDTAVYFCASPYGGYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

mAb1-25-humanized的轻链氨基酸序列SEQ ID NO：2

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISNFLHWYQQKPGQAPRLLIKYASQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYFCQQSNSWPHTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

以下实施例中的组氨酸缓冲体系指组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液，醋酸缓冲体系指醋酸盐缓冲液，柠檬酸体系指柠檬酸盐缓冲液、琥珀酸缓冲体系指琥珀酸盐缓冲液。

以下实施例中所用试剂和原料若无特殊说明，均可从商业途径购得。

实施例1pH对配方的影响

配制表1中5种不同pH值的缓冲溶液，将蛋白和辅料配制后得到下表处方溶液。分别经0.22μm滤膜除菌过滤后，1ml/瓶分装至2ml西林瓶中，加塞，轧盖，得候选处方样品，并置于40±2℃稳定性试验箱中，于第1周、2周、4周、6周、8周取样考察，考察指标为SEC纯度和IEC纯度。

表1 pH考察

结果如表2所示，结果表明，随pH值的升高，各处方溶液中蛋白的SEC纯度下降速度逐渐加快，pH4.5-6.0的范围较好。IEC纯度的变化趋势说明处方1-2、处方1-3和处方1-4优于处方1-1和处方1-5，说明pH5.0-6.0有利于IEC纯度。综合结果可知，pH5.0-6.0对蛋白SEC纯度、IEC纯度较优。

表2 pH考察结果

实施例2缓冲液体系对配方的影响

配制表3中4种不同的缓冲体系溶液，将蛋白和辅料配制得到目标处方溶液。分别经0.22μm滤膜除菌过滤后，1ml/瓶分装至2ml西林瓶中，加塞，轧盖，得候选处方样品，并置于40±2℃稳定性试验箱中，于第1周、2周、4周、6周、8周取样考察，考察指标为SEC纯度和IEC纯度。

表3缓冲体系筛选处方信息

40±2℃条件下考察各处方稳定性，SEC纯度和IEC纯度的变化趋势均表明处方2-1与处方2-2优于处方2-3和处方2-4；其他检测项变化趋势在各处方间无明显差异。由此可知醋酸缓冲体系和组氨酸-盐酸组氨酸缓冲体系较优。

表4缓冲体系考察结果

实施例3蛋白保护剂与表面活性剂对配方影响

配制表5中的组氨酸-盐酸组氨酸缓冲体系，将蛋白与辅料配制得到目标处方溶液。分别经0.22μm滤膜除菌过滤后，1ml/瓶分装至2ml西林瓶中，加塞，轧盖，得候选处方样品，并置于40±2℃稳定性试验箱中，于第1周、2周、4周、8周取样考察，考察指标为SEC纯度、IEC纯度、不溶性微粒。

表5蛋白保护剂与表面活性剂种类筛选处方信息

40±2℃条件下考察各处方稳定性，不溶性微粒和SEC纯度，结果进一步表明处方中加入糖类保护剂和聚山梨酯能够有效提高稳定性；其他检测项变化趋势在各处方间无明显差异。因此海藻糖、蔗糖、甘露醇均可作为蛋白保护剂，聚山梨酯80和聚山梨酯20均可作为表面活性剂起增溶作用，减少不溶性微粒。

表6蛋白保护剂和表面活性剂考察结果

实施例4配方辅料用量对配方的影响

配制表7中各个配方溶液，分别将蛋白加入相应的辅料，再用另外配制的辅料溶液将蛋白质浓度调节至25mg/ml，得到目标处方溶液。经0.22μm滤膜除菌过滤后，4.3ml/瓶分装至10ml西林瓶中，轧盖，得各处方样品，对各候选处方进行40±2℃条件下的稳定性考察，考察时间为2个月，考察指标为SEC纯度、IEC纯度。

表7辅料用量考察处方信息

由表8结果可知，各组配方变化趋势无显著差异。综合多次试验结果可知，蛋白保护剂的用量40-100mg/ml较优，表面活性剂用量0.05-1mg/ml较好，优选0.1mg/ml。

表8辅料用量考察结果

实施例5加速稳定性考察

按如下制剂配方配制抗PD-1单克隆抗体液体制剂：25mg/ml抗PD-1单克隆抗体、10mM组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液、95mg/ml海藻糖、0.1mg/ml聚山梨酯80，pH5.5±0.5。制备3批药品，在25±2℃放置6个月，于0、1.、2、3、6月取样检测SEC纯度和IEC纯度，结果如表9所示，由结果可知，加速6个月后药品纯度均符合标准要求。

表9加速稳定性结果

实施例6长期稳定性考察

按如下制剂配方配制抗PD-1单克隆抗体液体制剂：25mg/ml抗PD-1单克隆抗体、10mM组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液、95mg/ml海藻糖、0.1mg/ml聚山梨酯80，pH5.5±0.5。制备3批药品，在5±3℃放置长期稳定性，到点取样检测SEC纯度、IEC纯度和不溶性微粒，结果如表10所示。

表10长期稳定性结果

结果分析如图1所示，由图1可知，本发明的抗PD-1单克隆抗体制剂长期稳定性SEC纯度推测的有效期为167个月，IEC纯度在长稳过程中无发生下降，不溶性微粒数据也没有显著变化，因此可支持60个月的有效期。

序列表

<110> 三生国健药业（上海）股份有限公司

<120> 一种抗PD-1单克隆抗体液体制剂

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser His Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Ser Pro Tyr Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro

210 215 220

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

225 230 235 240

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

245 250 255

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe

260 265 270

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

275 280 285

Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

290 295 300

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

305 310 315 320

Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

325 330 335

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln

340 345 350

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

355 360 365

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

370 375 380

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

385 390 395 400

Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu

405 410 415

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

420 425 430

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440

<210> 2

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Phe

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro His

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210