成纤维细胞激活蛋白结合剂及其用途
阅读说明：本技术 成纤维细胞激活蛋白结合剂及其用途 (Fibroblast activation protein binding agents and uses thereof ) 是由 N·克雷 E·德普拉 L·扎比奥 于 2020-03-27 设计创作，主要内容包括：本发明部分地涉及结合成纤维细胞激活蛋白(FAP)的剂、嵌合蛋白和蛋白复合物以及它们作为诊断剂和治疗剂的用途。本发明还涉及包含所述FAP结合剂、嵌合蛋白和蛋白复合物的药物组合物以及所述药物组合物在治疗各种疾病中的用途。(The present invention relates in part to agents that bind Fibroblast Activation Protein (FAP), chimeric proteins and protein complexes and their use as diagnostic and therapeutic agents. The invention also relates to pharmaceutical compositions comprising said FAP-binding agents, chimeric proteins and protein complexes and the use of said pharmaceutical compositions in the treatment of various diseases.)
相关申请的交叉引用
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技术领域
本发明技术部分地涉及结合成纤维细胞激活蛋白(FAP)的结合剂、嵌合蛋白和基于Fc的嵌合蛋白复合物以及它们作为治疗剂和诊断剂的用途。
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背景技术
成纤维细胞调控健康组织的结构和功能，在急性炎症后短暂参与组织修复，并且在包括癌症在内的慢性炎症状态中发挥异常的刺激作用。癌症相关成纤维细胞(CAF)调节肿瘤微环境并且以促进肿瘤或抑制肿瘤的方式影响赘生性细胞的行为。了解肿瘤的微环境对于癌症治疗很重要。成纤维细胞表达多种免疫调节因子，诸如细胞因子、脂质介体和生长因子。此外，成纤维细胞展示许多表面和细胞内受体，以及响应外部信号所必需的分子机制。鉴于成纤维细胞可引发炎症，因此可认为成纤维细胞是“专业”免疫系统的延伸。成纤维细胞参与许多正常和病理过程。已知与异常成纤维细胞相关的说明性疾病包括癌症、心血管疾病和自身免疫性疾病。CAF是重要的基质组分，并且主要通过释放蛋白水解酶、生长因子和细胞因子在调节肿瘤微环境和影响肿瘤细胞行为中发挥重要作用。研究表明，基质的促癌和抗治疗特性可归因于成纤维细胞的活性。
人成纤维细胞激活蛋白(FAP；GenBank登录号AAC51668；NCBI参考序列：NM004460.3)，也称为Seprase，是一种170kDa的整合膜丝氨酸肽酶(EC 3.4.21.B28)。FAP属于二肽基肽酶IV家族，是一种同源二聚体，其含有两个N-糖基化亚基并且具有大的C端细胞外结构域，该酶的催化结构域位于其中(Scanlan等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(1994),5657-5661)。糖基化形式的FAP兼具后脯氨酰二肽基肽酶和明胶酶活性(Sun等人,ProteinExpr.Purif.24(2002),274-281)。因此，FAP是一种丝氨酸蛋白酶，既具有二肽基肽酶活性，也具有切割明胶和I型胶原的肽链内切酶活性。
FAP具有独特的组织分布：发现其表达在所有原发性和转移性上皮肿瘤(包括肺癌、结肠直肠癌、膀胱癌、卵巢癌和乳腺癌)的超过90％的反应性基质成纤维细胞中高度上调，而在正常成人组织中普遍缺失(Rettig等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988),3110-31 14；Garin-Chesa等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1990),7235-7239)。后续报告表明，FAP不仅在基质成纤维细胞中表达，而且在某些类型的上皮来源的恶性细胞中表达，并且FAP表达与恶性表型直接相关(Jin等人,Anticancer Res.23(2003),3195-3198)。
由于FAP在许多常见癌症中表达并且在正常组织中表达受限，因此在各种癌瘤的成像、诊断和治疗中是一个很有前景的抗原靶点。仍然需要用于治疗与异常成纤维细胞相关的疾病的改进疗法，例如治疗纤维化疾病或通过改变CAF功能来治疗癌症。
发明内容
在一方面，本发明技术涉及靶向或结合至FAP的成纤维细胞激活蛋白(FAP)结合剂。在一些实施方案中，所述FAP结合剂包含靶向FAP的部分。所述FAP结合剂或所述FAP靶向部分可以例如是全长抗体、单结构域抗体、只有重链的重组抗体(VHH)、单链抗体(scFv)、只有重链的鲨鱼抗体(VNAR)、微量蛋白、darpin、抗运载蛋白、adnectin、适体、Fv、Fab、Fab'、F(ab')2、肽模拟分子、受体的天然配体，或合成分子。在一些实施方案中，所述FAP靶向部分是单结构域抗体(VHH)。在一些实施方案中，所述FAP结合剂直接或间接地改变包含疾病相关F2成纤维细胞的疾病微环境(例如包含疾病相关F2成纤维细胞的肿瘤微环境)。在一些实施方案中，所述FAP结合剂直接或间接地极化与疾病相关的F2成纤维细胞。在一些实施方案中，所述FAP结合剂还包含信号传导剂，例如但不限于干扰素、白介素和肿瘤坏死因子，所述信号传导剂可以经过修饰以减弱其活性。在一些实施方案中，所述FAP结合剂包含结合至其他目标靶标(例如抗原或受体)的另外的靶向部分。在另一个实施方案中，所述其他目标靶标(例如抗原或受体)存在于成纤维细胞上。在一些实施方案中，所述其他目标靶标(例如抗原或受体)存在于癌基质中的成纤维细胞上。在一些实施方案中，本发明的成纤维细胞结合剂可以直接或间接地将免疫细胞(例如树突状细胞)募集至作用位点(作为非限制性实例，诸如肿瘤微环境)。在一些实施方案中，本发明的FAP结合剂促进肿瘤基质中的免疫细胞(例如树突状细胞、巨噬细胞)呈递抗原(例如抗原或受体)或促进成纤维细胞直接呈递抗原。
在一些实施方案中，这些FAP结合剂结合至FAP，但不在功能上调节(例如，部分或完全中和)FAP。因此，在一些实施方案中，本发明的FAP结合剂用于例如直接或间接地将表达FAP的细胞募集至目标位点，同时仍允许表达FAP的细胞经由FAP进行信号传导(即，所述FAP结合剂的结合不会降低或消除所述目标位点处的FAP信号传导)。相反地，在一些实施方案中，本发明的FAP结合剂用于例如直接或间接地将表达FAP的细胞募集至目标位点，但不允许表达FAP的细胞经由FAP进行信号传导(即，所述FAP结合剂的结合降低或消除所述目标位点处的FAP信号传导)。在一些实施方案中，所述FAP靶向部分是单结构域抗体(VHH)。
在另一方面，本发明技术涉及具有本文所公开的FAP结合剂或具有至少一个靶向或结合至FAP的靶向部分的嵌合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物。在另一方面，本文所公开的FAP结合剂或嵌合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物可用于治疗各种疾病或病症(诸如癌症、感染、炎性疾病或疾患、免疫病症、纤维化疾病和其他疾病和病症)的方法中。
在另一方面，一个或多个靶向部分(即，FAP结合剂)和一个或多个信号传导剂缀合至一个或多个Fc结构域以形成基于Fc的嵌合蛋白复合物。在一些实施方案中，所述一个或多个靶向部分(即，FAP结合剂)和所述一个或多个信号传导剂直接连接至所述一个或多个Fc结构域或经由接头连接。与缺乏Fc的嵌合体相比，此类基于Fc的嵌合蛋白复合物出人意料地具有显著改善的体内半衰期，当呈如本文所描述的异源二聚体构型时尤其如此，特别适于生产和纯化。因此，本发明的基于Fc的嵌合蛋白方法产生了特别适合用作治疗剂的剂。
在另一方面，本发明技术涉及在人、小鼠和食蟹猴之间具有交叉反应性的FAP结合剂、嵌合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物。
附图说明
图1示出了FAP VHH结合的荧光激活细胞分选(FACS)数据。将FAP VHH周质提取物施加至用人FAP、小鼠FAP或空载体(MOCK)瞬时转染的HEK293T细胞。测量结合，并绘制为经FAP和MOCK转染的细胞之间的平均荧光强度(MFI)差异。
图2A-图2H示出了FACS中VHH与人、小鼠和食蟹猴FAP的结合选择。将用人FAP、小鼠FAP或空载体(MOCK)瞬时转染的HEK293T细胞与连续稀释的纯化FAP VHH一起孵育。测量结合，并绘制为经FAP和MOCK转染的细胞之间的平均荧光强度(MFI)差异。图2A示出了2PE14的数据，图2B示出了2PE17的数据，图2C示出了2PE36的数据，图2D示出了2PE40的数据，图2E示出了2PE42的数据，图2F示出了2PE44的数据，图2G示出了3PE12的数据，图2H示出了3PE42的数据，图2I示出了3PE57的数据，图2J示出了3PE93的数据，并且图2K示出了3PE94的数据。
图3A-图3D示出了靶向后HL116和HL116-hFAP细胞中的野生型IFNα2和FAP VHHActaFeron(AFN)信号传导。如所指示的将亲本HL116或衍生的HL116-hFAP细胞用野生型IFNa2或FAP VHH AFN刺激6小时。绘制三次测量的平均荧光素酶值(±STDEV)。图3A示出了IFNα2的数据，图3B示出了2PE14-AFN的数据，图3C示出了3PE12-AFN的数据，并且图3D示出了3PE42-AFN的数据。
图4示出了结合人FAP的VHH的一些实施方案的蛋白质序列比对。方框围住这些VHH序列的CDR1、CDR2、CDR3并示出它们的比对。
图5A-图5F、图6A-图6H、图7A-图7H、图8A-图8D、图9A-图9F、图10A-图10J、图11A-图11D、图12A-图12F、图13A-图13J、图14A-图14F、图15A-图15L、图16A-图16L、图17A-图17F、图18A-图18L、图19A-图19L、图20A-图20J、图21A-图21J、图22A-图22F和图23A-图23F示出了本发明的基于Fc的嵌合蛋白复合物的各个非限制性说明性示意图。在多个实施方案中，每个示意图是本发明的组合物。在图中适用的情况下，“TM”是指如本文所描述的“靶向部分”。“SA”是指如本文所描述的“信号传导剂”。是如本文所描述的任选的“接头”。两个长平行矩形是如本文所描述的人Fc结构域，例如来自IgG1、来自IgG2或来自IgG4，且任选地具有同样如本文所描述的效应子敲除和/或稳定化突变。两个长平行矩形(其中一个具有突出部，另一个具有低凹部)是如本文所描述的人Fc结构域，例如来自IgG1、来自IgG2或来自IgG4，具有如本文所描述的旋钮入孔洞和/或离子对(又名带电对、离子键或带电残基对)突变，并且任选地具有同样如本文所描述的效应子敲除和/或稳定化突变。
图5A-图5F示出了说明性同源二聚体2链复合物。这些图示出了同源二聚体2链复合物的说明性构型。
图6A-图6H示出了说明性同源二聚体2链复合物，其具有两个靶向部分(TM)(如本文所描述的，在一些实施方案中可以存在更多的靶向部分)。在多个实施方案中，TM1和TM2的位置是可互换的。在多个实施方案中，框中所示的构建体(即图6G和图6H)在TM1与TM2之间或在TM1与Fc之间具有信号传导剂(SA)。
图7A-图7H示出了说明性同源二聚体2链复合物，其具有两个信号传导剂(如本文所描述的，在一些实施方案中可以存在更多的信号传导剂)。在多个实施方案中，SA1和SA2的位置是可互换的。在多个实施方案中，框中所示的构建体(即图7G和图7H)在SA1与SA2之间具有TM，或者在N端或C端处具有TM。
图8A-图8D示出了说明性异源二聚体2链复合物，其具有分裂TM链和SA链，即TM在Fc的旋钮链上，而SA在Fc的孔洞链上。
图9A-图9F示出了说明性异源二聚体2链复合物，其具有分裂TM链和SA链，即两个TM都在Fc的旋钮链上，而SA在Fc的孔洞链上，具有两个靶向部分(如本文所描述的，在一些实施方案中可以存在更多的靶向部分)。在多个实施方案中，TM1和TM2的位置是可互换的。在一些实施方案中，TM1和TM2可以是相同的。
图10A-图10J示出了说明性异源二聚体2链复合物，其具有分裂TM链和SA链，即TM在Fc的旋钮链上，而SA在Fc的孔洞链上，具有两个信号传导剂(如本文所描述的，在一些实施方案中可以存在更多的信号传导剂)。在这些取向/构型中，一个SA在旋钮链上，一个SA在孔洞链上。在多个实施方案中，SA1和SA2的位置是可互换的。
图11A-图11D示出了说明性异源二聚体2链复合物，其具有分裂TM链和SA链，即SA在Fc的旋钮链上，而TM在Fc的孔洞链上。
图12A-图12F示出了说明性异源二聚体2链复合物，其具有分裂TM链和SA链，即SA在Fc的旋钮链上，而两个TM都在Fc的孔洞链上，具有两个靶向部分(如本文所描述的，在一些实施方案中可以存在更多的靶向部分)。在多个实施方案中，TM1和TM2的位置是可互换的。在一些实施方案中，TM1和TM2可以是相同的。
图13A-图13J示出了说明性异源二聚体2链复合物，其具有分裂TM链和SA链，即SA在Fc的旋钮链上，而TM在Fc的孔洞链上，具有两个信号传导剂(如本文所描述的，在一些实施方案中可以存在更多的信号传导剂)。在这些取向/构型中，一个SA在旋钮链上，一个SA在孔洞链上。在多个实施方案中，SA1和SA2的位置是可互换的。
图14A-图14F示出了说明性异源二聚体2链复合物，其中TM和SA在同一链上，即SA和TM均在Fc的旋钮链上。
图15A-图15L示出了说明性异源二聚体2链复合物，其中TM和SA在同一链上，即SA和TM均在Fc的旋钮链上，具有两个靶向部分(如本文所描述的，在一些实施方案中可以存在更多的靶向部分)。在多个实施方案中，TM1和TM2的位置是可互换的。在一些实施方案中，TM1和TM2可以是相同的。
图16A-图16L示出了说明性异源二聚体2链复合物，其中TM和SA在同一链上，即SA和TM均在Fc的旋钮链上，具有两个信号传导剂(如本文所描述的，在一些实施方案中可以存在更多的信号传导剂)。在多个实施方案中，SA1和SA2的位置是可互换的。
图17A-图17F示出了说明性异源二聚体2链复合物，其中TM和SA在同一链上，即SA和TM均在Fc的孔洞链上。
图18A-图18L示出了说明性异源二聚体2链复合物，其中TM和SA在同一链上，即SA和TM均在Fc的孔洞链上，具有两个靶向部分(如本文所描述的，在一些实施方案中存在更多的靶向部分)。在多个实施方案中，TM1和TM2的位置是可互换的。在多个实施方案中，TM1和TM2可以是相同的。
图19A-图19L示出了说明性异源二聚体2链复合物，其中TM和SA在同一链上，即SA和TM均在Fc的孔洞链上，具有两个信号传导剂(如本文所描述的，在一些实施方案中可以存在更多的信号传导剂)。在多个实施方案中，SA1和SA2的位置是可互换的。
图20A-图20J示出了说明性异源二聚体2链复合物，其具有两个靶向部分(如本文所描述的，在一些实施方案中可以存在更多的靶向部分)，并且其中SA在旋钮Fc上并且TM在每个链上。在多个实施方案中，TM1和TM2可以是相同的。
图21A-图21J示出了说明性异源二聚体2链复合物，其具有两个靶向部分(如本文所描述的，在一些实施方案中可以存在更多的靶向部分)，并且其中SA在孔洞Fc上并且TM在每个链上。在多个实施方案中，TM1和TM2可以是相同的。
图22A-图22F示出了说明性异源二聚体2链复合物，其具有两个信号传导剂(如本文所描述的，在一些实施方案中可以存在更多的信号传导剂)并且具有分裂SA链和TM链：SA在旋钮上并且TM在孔洞Fc上。
图23A-图23F示出了说明性异源二聚体2链复合物，其具有两个信号传导剂(如本文所描述的，在一些实施方案中可以存在更多的信号传导剂)并且具有分裂SA链和TM链：TM在旋钮上并且SA在孔洞Fc上。
图24A-图24H示出了在生物层干涉法(BLI)中结合至生物素化FAP的FAP VHH变体的传感图。
具体实施方式
本发明技术部分地基于识别、靶向或结合至成纤维细胞或成纤维细胞激活蛋白的成纤维细胞结合剂或成纤维细胞激活蛋白结合剂(例如抗体，作为非限制性实例，诸如VHH)的发现。在一些实施方案中，本发明的成纤维细胞结合剂是具有一个或多个靶向部分和/或一个或多个信号传导剂的嵌合或融合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物的一部分。
在一些实施方案中，所述成纤维细胞结合剂或成纤维细胞激活蛋白结合剂靶向F2成纤维细胞。在一些实施方案中，所述成纤维细胞结合剂或FAP结合剂直接或间接地改变包含疾病相关F2成纤维细胞的疾病微环境(例如包含所述F2成纤维细胞的肿瘤微环境)。在一些实施方案中，所述成纤维细胞结合剂或FAP结合剂直接或间接地将F2成纤维细胞极化成F1成纤维细胞，其中在一些情况下，所述成纤维细胞与疾病相关。
F2成纤维细胞是指促致瘤(或促进肿瘤)的癌症相关成纤维细胞(CAF)(又名II型-CAF)。F1成纤维细胞是指抑瘤性CAF(又名I型-CAF)。极化是指改变细胞的表型，例如将致瘤性F2成纤维细胞转变为抑瘤性F1成纤维细胞。
在一些实施方案中，所述成纤维细胞结合剂或FAP结合剂靶向FAP标记物。在一些实施方案中，所述成纤维细胞结合剂或FAP结合剂包含靶向FAP的部分。在一些实施方案中，所述成纤维细胞结合剂或FAP结合剂的靶向FAP的部分是本文公开的任何靶向FAP的部分。
在一些实施方案中，成纤维细胞结合剂或FAP结合剂包含与SEQ ID NO:2-42或46-86中的任一者具有至少90％序列相似性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，成纤维细胞结合剂或FAP结合剂还包含一个或多个信号传导剂。在一些实施方案中，所述信号传导剂选自干扰素、白介素和肿瘤坏死因子中的一者或多者，所述干扰素、白介素和肿瘤坏死因子中的任一者任选地是经修饰的。
在一些实施方案中，还包含一个或多个信号传导剂的成纤维细胞结合剂或FAP结合剂直接或间接地改变包含疾病相关F2成纤维细胞的疾病微环境(例如包含所述F2成纤维细胞的肿瘤微环境)。在一些实施方案中，还包含一个或多个信号传导剂的成纤维细胞结合剂或FAP结合剂直接或间接地将F2成纤维细胞极化成F1成纤维细胞。
在一些实施方案中，成纤维细胞结合剂或FAP结合剂还包含一个或多个另外的靶向部分。在一些实施方案中，所述一个或多个另外的靶向部分识别并任选地在功能上调节肿瘤抗原。在一些实施方案中，所述一个或多个另外的靶向部分识别并任选地在功能上调节免疫细胞上的抗原。
在一些实施方案中，所述免疫细胞选自T细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和NK细胞。
在一些实施方案中，所述成纤维细胞结合剂或FAP结合剂将细胞毒性T细胞募集至肿瘤细胞或肿瘤环境。
在一些实施方案中，所述成纤维细胞结合剂或FAP结合剂识别并结合FAP而基本上不在功能上调节所述FAP的活性。
在另一方面，本发明技术部分地基于识别并结合至成纤维细胞激活蛋白(FAP)的剂(例如抗体，作为非限制性实例，诸如VHH)的发现。在一些实施方案中，本发明的FAP结合剂是具有一个或多个靶向部分和/或一个或多个信号传导剂的嵌合或融合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物的一部分。在一些实施方案中，这些FAP结合剂结合至FAP，但不在功能上调节FAP。在一些实施方案中，这些FAP结合剂可以结合免疫细胞并直接或间接地将所述免疫细胞募集至需要治疗作用的位点(例如肿瘤或肿瘤微环境)。在一些实施方案中，FAP结合剂增强肿瘤抗原呈递以引发有效的抗肿瘤免疫应答。
在一些实施方案中，FAP结合剂调节抗原呈递。在一些实施方案中，FAP结合剂调和免疫应答以避免或降低自身免疫性。在一些实施方案中，FAP结合剂提供免疫阻抑。在一些实施方案中，FAP结合剂使得患者的Treg与CD8+T细胞和/或CD4+T细胞的比率增加。在一些实施方案中，本发明的方法涉及减少患者的自身反应性T细胞。
在一些实施方案中，本发明技术提供了包含所述FAP结合剂的药物组合物以及所述药物组合物在治疗的各种疾病，包括纤维化疾病中的用途。在一些实施方案中，本发明技术提供了包含所述FAP结合剂的药物组合物以及所述药物组合物在治疗各种疾病，包括癌症、自身免疫性疾病和/或神经退行性疾病中的用途。
在一些实施方案中，本发明的FAP结合剂用于靶向癌症相关成纤维细胞(CAF)。举例来说，在各个实施方案中，本发明的FAP结合剂，例如在癌症例如上皮来源的癌症诸如癌瘤的治疗中，靶向肿瘤基质内的成纤维细胞。由于CAF在调节恶性上皮细胞、细胞外基质(ECM)和肿瘤环境中常见的众多非癌细胞(包括内皮细胞、脂肪细胞、炎性细胞和免疫细胞)之间发生的动态和双向相互作用中起着核心作用，因此本发明的FAP结合剂提供了一种将至关重要的抗肿瘤疗法(例如如本文其他部分所描述的经修饰的细胞因子和/或其他靶向部分)递送至目标部位的方式。在各个实施方案中，本发明的FAP结合剂靶向由激活的成纤维细胞、参与管腺发生的内皮细胞(EC)和细胞外基质(ECM)组成的基质微环境，所述环境会不断重塑以适应肿瘤生长。因此，例如在具有细胞因子、任选地具有另外的靶向部分的嵌合体(或嵌合蛋白)的情形下，本发明的FAP结合剂可将抗肿瘤信号递送至基质微环境，这对于肿瘤发展至关重要。在各个实施方案中，所述FAP结合剂用于靶向对原发性肿瘤或转移中的肿瘤龛形成至关重要的细胞(诸如癌症相关成纤维细胞、MSC、选择的癌细胞和内皮细胞)的膜。
FAP结合剂
成纤维细胞激活蛋白(FAP)是属于丝氨酸蛋白酶家族的170kDa的黑素瘤膜结合明胶酶。FAP在上皮癌的反应性基质成纤维细胞、愈合创伤的肉芽组织以及骨肉瘤和软组织肉瘤的恶性细胞中选择性表达。据信FAP参与控制发育、组织修复和上皮癌变过程中的成纤维细胞生长或上皮-间质相互作用。
在一些实施方案中，本发明的FAP结合剂是能够特异性地结合至FAP的基于蛋白质的剂。在一些实施方案中，本发明的FAP结合剂是能够特异性地结合至FAP而不在功能上调节(例如，部分或完全中和)FAP的基于蛋白质的剂。
在一些实施方案中，本发明技术的FAP结合剂包含具有抗原识别结构域的靶向部分，所述抗原识别结构域识别FAP上存在的表位。在一些实施方案中，所述抗原识别结构域识别FAP上存在的一个或多个线性表位。如本文所使用，线性表位是指FAP上存在的任何连续氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗原识别结构域识别FAP上存在的一个或多个构象表位。如本文所使用，构象表位是指形成具有能够被抗原识别结构域识别的特征和/或形状和/或三级结构的三维表面的一个或多个氨基酸区段(可能是不连续的)。
在一些实施方案中，本发明技术的FAP结合剂可以结合至人FAP的全长和/或成熟形式和/或同种型和/或剪接变体和/或片段和/或任何其他天然存在的或合成的类似物、变体或突变体。在一些实施方案中，本发明技术的FAP结合剂可以结合至人FAP的任何形式，包括单体形式、二聚体形式、异源二聚体形式、多聚体形式和相关形式。在一个实施方案中，所述FAP结合剂结合至FAP的单体形式。在另一个实施方案中，所述FAP结合剂结合至FAP的二聚体形式。在另一个实施方案中，所述FAP结合剂结合至FAP的糖基化形式，所述糖基化形式可以是单体形式或二聚体形式。
在一个实施方案中，本发明的FAP结合剂包含具有抗原识别结构域的靶向部分，所述抗原识别结构域识别人FAP上存在的一个或多个表位。在一些实施方案中，所述人FAP包含以下氨基酸序列：
MKTWVKIVFGVATSAVLALLVMCIVLRPSRVHNSEENTMRALTLKDILNGTFSYKTFFPNWISGQEYLHQSADNNIVLYNIETGQSYTILSNRTMKSVNASNYGLSPDRQFVYLESDYSKLWRYSYTATYYIYDLSNGEFVRGNELPRPIQYLCWSPVGSKLAYVYQNNIYLKQRPGDPPFQITFNGRENKIFNGIPDWVYEEEMLPTKYALWWSPNGKFLAYAEFNDKDIPVIAYSYYGDEQYPRTINIPYPKAGAKNPVVRIFIIDTTYPAYVGPQEVPVPAMIASSDYYFSWLTWVTDERVCLQWLKRVQNVSVLSICDFREDWQTWDCPKTQEHIEESRTGWAGGFFVSRPVFSYDAISYYKIFSDKDGYKHIHYIKDTVENAIQITSGKWEAINIFRVTQDSLFYSSNEFEEYPGRRNIYRISIGSYPPSKKCVTCHLRKERCQYYTASFSDYAKYYALVCYGPGIPISTLHDGRTDQEIKILEENKELENALKNIQLPKEEIKKLEVDEITLWYKMILPPQFDRSKKYPLLIQVYGGPCSQSVRSVFAVNWISYLASKEGMVIALVDGRGTAFQGDKLLYAVYRKLGVYEVEDQITAVRKFIEMGFIDEKRIAIWGWSYGGYVSSLALASGTGLFKCGIAVAPVSSWEYYASVYTERFMGLPTKDDNLEHYKNSTVMARAEYFRNVDYLLIHGTADDNVHFQNSAQIAKALVNAQVDFQAMWYSDQNHGLSGLSTNHLYTHMTHFLKQCFSLSD(SEQ ID NO:1)。
在一些实施方案中，本发明的FAP结合剂包含能够特异性结合的靶向部分。在一些实施方案中，所述FAP结合剂包含具有抗原识别结构域的靶向部分，诸如抗体或其衍生物。在一个实施方案中，所述FAP结合剂包含靶向部分，所述靶向部分是抗体。在一些实施方案中，抗体是包括两条重链和两条轻链的全长多聚体蛋白。每条重链包括一个可变区(例如VH)和至少三个恒定区(例如CH1、CH2和CH3)，并且每条轻链包括一个可变区(VL)和一个恒定区(CL)。可变区决定了抗体的特异性。每个可变区包括由四个相对保守的框架区(FR)侧接的三个高变区，也称为互补性决定区(CDR)。所述三个CDR(称为CDR1、CDR2和CDR3)有助于抗体结合特异性。在一些实施方案中，所述抗体是嵌合抗体。在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。
在一些实施方案中，所述FAP结合剂包含靶向部分，所述靶向部分是抗体衍生物或抗体形式。在一些实施方案中，本发明的FAP结合剂包含靶向部分，所述靶向部分是单结构域抗体、只有重链的重组抗体(VHH)、单链抗体(scFv)、只有重链的鲨鱼抗体(VNAR)、微量蛋白(半胱氨酸结蛋白、打结素(knottin))、DARPin；四连接素(Tetranectin)；Affibody；反式体(Transbody)；抗运载蛋白；AdNectin；Affilin；Affimer；微型体(Microbody)；适体；奥特瑞斯(alterase)；塑性抗体；费洛体(phylomer)；斯塔都体(stradobody)；巨型体(maxibody)；伊维体(evibody)；菲诺体(fynomer)、犰狳重复蛋白、库尼茨型结构域(Kunitzdomain)、高亲合性多聚体(avimer)、阿特里体(atrimer)、普罗体(probody)、免疫体(immunobody)、曲奥单抗(triomab)、特洛伊体(troybody)；佩普体(pepbody)；疫苗体(vaccibody)、单特异性体(UniBody)；双特异性体(DuoBody)、Fv、Fab、Fab'、F(ab')2、肽模拟分子或合成分子，如以下美国专利号或专利公布号中所描述：US 7,417,130、US 2004/132094、US 5,831,012、US 2004/023334、US 7,250,297、US 6,818,418、US 2004/209243、US 7,838,629、US 7,186,524、US 6,004,746、US 5,475,096、US 2004/146938、US 2004/157209、US 6,994,982、US 6,794,144、US 2010/239633、US 7,803,907、US 2010/119446和/或US 7,166,697，所述专利的内容特此以引用方式整体并入。还参见Storz MAbs.2011年5月-6月；3(3):310-317。
在一些实施方案中，所述FAP结合剂包含靶向部分，所述靶向部分是单结构域抗体，诸如VHH。所述VHH可以来源于例如产生VHH抗体的生物体，诸如骆驼、鲨鱼，或者所述VHH可以是设计的VHH。VHH是抗体来源的治疗性蛋白质，它们含有天然存在的重链抗体的独特结构和功能性质。VHH技术是基于来自骆驼的缺乏轻链的完全功能抗体。这些重链抗体含有单个可变结构域(VHH)和两个恒定结构域(CH2和CH3)。VHH可以NANOBODY或NANOBODIES的商标购得。
在一个实施方案中，所述FAP结合剂包含VHH。在一些实施方案中，所述VHH是人源化VHH或骆驼化VHH。
在一些实施方案中，所述VHH包含完全人VH结构域，例如HUMABODY(CrescendoBiologics,Cambridge,UK)。在一些实施方案中，完全人VH结构域(例如HUMABODY)是单价、二价或三价的。在一些实施方案中，所述完全人VH结构域(例如HUMABODY)是单特异性或多特异性的，诸如单特异性、双特异性或三特异性的。说明性的完全人VH结构域(例如HUMABODIES)描述于例如WO 2016/113555和WO 2016/113557中，所述文献的全部公开内容以引用方式并入。
作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，人VHH FAP结合剂包含选自以下序列的氨基酸序列：
2PE2：
QVQLQESGGGSVQVGGSLRLSCADSGSTFTINAMGWYRQAPGKRRDWVAGITSSGVTQYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPSGRIYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:2)
2PE5：
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2PE7：
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2PE20：
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2PE23：
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2PE25：
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2PE27：
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2PE30：
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2PE38：
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2PE39：
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2PE40：
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2PE41：
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2PE42：
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2PE43：
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2PE44：
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2PE47：
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2PE49：
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2PE55：
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2PE56：
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCADSGSTFTINAMGWYRQAPGKRRDWVAGITSSGVTQYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPSGRIYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:29)
2PE58：
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2PE59：
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2PE60：
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2PE61：
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2PE63：
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2PE67：
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2PE68：
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSTNAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRAPPDGRVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:37)
2PE71：
QVQLQESGGGMVQSGRSLRLSCLASVNIVNLNSVGWYRQAPGQQRELVASITSAGSTNYAESVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLKPSDTAVYYCNLWPPRVSPSGRGYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:38)
2PE72：
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2PE76：
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2PE83：
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2PE84：
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在各个说明性实施方案中，所述FAP结合剂包含选自以上提供的任一序列的氨基酸序列，有或没有末端组氨酸标签序列(即，HHHHHH；SEQ ID NO:43)。
在各个说明性实施方案中，所述FAP结合剂包含选自以上提供的任一序列的氨基酸序列，有或没有HA标签(即，YPYDVPDYGS；SEQ ID NO:44)。
在各个说明性实施方案中，所述FAP结合剂包含选自以上提供的任一序列的氨基酸序列，有或没有AAA接头(即，AAA)。
在各个说明性实施方案中，所述FAP结合剂包含选自以上提供的任一序列的氨基酸序列，有或没有AAA接头、HA标签和末端组氨酸标签序列(即，AAAYPYDVPDYGSHHHHHH；SEQID NO:45)。
作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，人VHH FAP结合剂包含选自以下序列的氨基酸序列：
2PE86：
QVQLQESGGGLVQVGGSLRLSCADSGSTFSINAMGWYRQAPGKRRDWVAGITSDGVTKYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNLWPPRVSPSGRIYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:46)
2PE87：
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2PE88：
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2PE95：
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3PE1：
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3PE5：
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3PE12：
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3PE21：
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3PE28：
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3PE47：
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3PE72：
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3PE82：
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3PE90：
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3PE92：
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3PE93：
QVQLQESGGGLVQPGESLRLSCAVSGSTSSMNAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSMKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:68)
3PE94：
QVQLQESGGGLVQPEGSLRLSCAASGSISSINAMAWYRQAPGKRRELVAGIDGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:69)
2PE18：
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2PE22：
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2PE26：
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3PE4：
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCADSGSTFGLGAMGWYRQSPGKQRELVASITSGGRTNYSDSVKGRFTISRVNPKRIVYLQMNSLKPEDTAVYVCNARFGIRDFWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:73)
3PE16：
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCADSGSTFGLSAMGWYRLTPGKQRELVASITSDGRTNYADSVKGRFTISRVNPKRTVYLQMNSLKPDDTAVYVCNARFGIRDFWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:74)
3PE22：
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3PE25：
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCADSGSTFGLTAIGWYRQSPGKQRELVASITSGGRTNYADSVKGRFTISRVNPKRTVYLQMNSLKPEDTAVYVCNARFGIRDFWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:76)
3PE26：
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCADSGSTFGLGAMGWYRQSPGKQRELVASITSGGRTNYADSVKGRFTISRVGAKRTVYLQMNSLKPEDTAVYVCNARFGIRDFWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:77)
3PE33：
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCADSGSTFGLGAMGWYRQSPGKQRELVASITSGGRTNYADSVKGRFTISRENPKRTVYLQMNSLKPEDTAVYVCNARFGIRDFWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:78)
3PE46：
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3PE61：
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3PE63：
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCADSGSTFGLSAMGWYRQSPGKQRELVASIISDGRTNYADSVKGRFTISRVNAKRTVYLQMNSLKPEDTAVYVCNARFGIRDFWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:82)
3PE70：
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCADSGSTFGLGAMGWYRQSPGKQRELVASITSGGRTNYSDSVKGRFTISRVTPKRIVYLQMNSLKPEDTAVYVCNARFGIRDFWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:83)
2PE1：
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFGINAVGWYRQAPGKQRELVATFTRGGDINYADSVKGRFTIFRDNAANTVYLQMNSLKAEDTAVYYCNTPPRIGRGYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:84)
2PE35：
QVQLQESGGGLVQVGGSLRLSCAASGSIFGINAVGWYRQAPGKQRELVATFTRGGDINYADSVKGRFTIFRDNAANTVYLQMNSLKAEDTAVYYCNTPPRIGRGYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:85)
3PE11：
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFGINAVGWYRQAPGKQRELVATFTRGGDINYADSVKGRFTIFRDNAANTVYLQMNSLKAEDTAVYYCNTPPRIGRGYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:86)作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，人源化VHH FAP结合剂包含选自以下序列的氨基酸序列：
·P-1901：2PE14 QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSINAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTQVTVSS(SEQ IDNO:1045)
·P-1902：2PE14_opt1(Q1D_Q5V_A74S_K83R_Q108L；粗体字母表示突变)VQLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSINAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNKNTVYLQMSSLPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTVTVSS(SEQ ID NO:1046)
·P-1903：2PE14_opt2(Q1D_Q5V_P60A_A74S_K83R_Q108L；粗体字母表示突变)VQLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSINAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYDSVKGRFTISRDNKNTVYLQMSSLPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTVTVSS(SEQ ID NO:1047)
·P-1904：2PE14_opt3(Q1D_Q5V_A74S_S82N_K83R_Q108L；粗体字母表示突变)VQLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSINAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNKNTVYLQMNSLPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTVTVSS(SEQ ID NO:1048)
·P-1905：2PE14_opt4(Q1D_Q5V_P60A_A74S_S82N_K83R_Q108L；粗体字母表示突变)VQLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSINAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYDSVKGRFTISRDNKNTVYLQMSLPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTVTVSS(SEQ ID NO:1049)
·P-1906：2PE14_N32A(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSIAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1050)
·P-1907：2PE14_N32D(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSIAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1051)
·P-1908：2PE14_N32E(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSIAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1052)
·P-1909：2PE14_N32F(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSIAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1053)
·P-1910：2PE14_N32G(粗体字母表示突变)
·QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSIAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1054)
·P-1911：2PE14_N32H(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSIAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1055)
·P-1912：2PE14_N32I(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSIAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1056)
·P-1913：2PE14_N32K(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSIAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1057)
·P-1914：2PE14_N32L(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSIAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1058)
·P-1915：2PE14_N32P(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSIAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1059)
·P-1916：2PE14_N32Q(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSIAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1060)
·P-1917：2PE14_N32R(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSIAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1061)
·P-1918：2PE14_N32S(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSIAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1062)
·P-1919：2PE14_N32T(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSIAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1063)
·P-1920：2PE14_N32V(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSIAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1064)
·P-1921：2PE14_N32W(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSIAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1065)
·P-1922：2PE14_N32Y(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSIAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1066)
·P-1923：3PE42(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGESLRLSCAVSGSTSSMNAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1067)
·P-1924：3PE42_M31A(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGESLRLSCAVSGSTSSNAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1068)
·P-1925：3PE42_M31D(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGESLRLSCAVSGSTSSNAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1069)
·P-1926：3PE42_M31E(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGESLRLSCAVSGSTSSNAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1070)
·P-1927：3PE42_M31F(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGESLRLSCAVSGSTSSNAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1071)
·P-1928：3PE42_M31G(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGESLRLSCAVSGSTSSNAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1072)
·P-1929：3PE42_M31H(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGESLRLSCAVSGSTSSNAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1073)
·P-1930：3PE42_M31I(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGESLRLSCAVSGSTSSNAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1074)
·P-1931：3PE42_M31K(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGESLRLSCAVSGSTSSNAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1075)
·P-1932：3PE42_M31L(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGESLRLSCAVSGSTSSNAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1076)
·P-1933：3PE42_M31N(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGESLRLSCAVSGSTSSNAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1077)
·P-1934：3PE42_M31P(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGESLRLSCAVSGSTSSNAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1078)
·P-1935：3PE42_M31Q(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGESLRLSCAVSGSTSSNAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1079)
·P-1936：3PE42_M31R(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGESLRLSCAVSGSTSSNAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1080)
·P-1937：3PE42_M31S(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGESLRLSCAVSGSTSSNAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1081)
·P-1938：3PE42_M31T(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGESLRLSCAVSGSTSSNAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1082)
·P-1939：3PE42_M31V(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGESLRLSCAVSGSTSSNAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1083)
·P-1940：3PE42_M31W(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGESLRLSCAVSGSTSSNAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1084)
·P-1941：3PE42_M31Y(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGESLRLSCAVSGSTSSNAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1085)
·P-2219：2PE14_OptA(Q1D_Q5V_N32W_A74S_K83R_Q108L)
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSIWAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMSSLRPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:1086)
·P-2220：2PE14_OptB(Q1D_Q5V_N32W_A74S_S82N_K83R_Q108L)
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSIWAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:1087)
·P-1923：3PE42 QVQLQESGGGLVQPGESLRLSCAVSGSTSSMNAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTQVTVSSHHHHHH(SEQID NO:1088)
·P-2221：3PE42_OptA(Q1D_Q5V_M31A_N32W_A74S_K83R_Q108L)
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTSSAWAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMSSLRPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:1089)
·P-2222：3PE42_OptB(Q1D_Q5V_M31D_N32W_A74S_K83R_Q108L)
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTSSDWAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMSSLRPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:1090)
·P-2223：3PE42_OptC(Q1D_Q5V_M31A_N32W_A74S_S82N_K83R_Q108L)
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTSSAWAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:1091)
·P-2224：3PE42_OptD(Q1D_Q5V_M31D_N32W_A74S_S82N_K83R_Q108L)
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTSSDWAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:1092)
在一些实施方案中，所述FAP结合剂包含靶向部分，所述靶向部分是包含具有四个“框架区”或FR和三个“互补决定区”或CDR的单个氨基酸链的VHH。如本文所使用，“框架区”或“FR”是指可变结构域中位于CDR之间的区域。如本文所使用，“互补决定区”或“CDR”是指VHH中含有能够特异性地结合至抗原性靶标的氨基酸序列的可变区。
在一些实施方案中，所述FAP结合剂包含具有包含至少一个CDR1、CDR2和/或CDR3序列的可变结构域的VHH。在一些实施方案中，所述FAP结合剂包含具有包含至少一个FR1、FR2、FR3和FR4序列的可变区的VHH。
在一些实施方案中，人FAP结合剂包含选自以下的CDR1序列：
ATISSMNSMA(SEQ ID NO:87)；EFTLAYFGVG(SEQ ID NO:88)；ESTFSINAVA(SEQ IDNO:89)；GFIFRSTSMG(SEQ ID NO:90)；GGIFTIGPLG(SEQ ID NO:91)；GRDFRDNSMG(SEQ IDNO:92)；GSIFGINAVG(SEQ ID NO:93)；GSIFSLNAMA(SEQ ID NO:94)；GSIFSMG(SEQ ID NO:95)；GSIFSTNAMA(SEQ ID NO:96)；GSISSINAMA(SEQ ID NO:97)；GSISSLNAMG(SEQ ID NO:98)；GSISSRNAMG(SEQ ID NO:99)；GSSFIINAMG(SEQ ID NO:100)；GSTARLDAMG(SEQ ID NO:101)；GSTFGLGAMG(SEQ ID NO:102)；GSTFGLSAMG(SEQ ID NO:103)；GSTFGLTAIG(SEQ IDNO:104)；GSTFILNAMA(SEQ ID NO:105)；GSTFILNAMG(SEQ ID NO:106)；GSTFSGNAMA(SEQ IDNO:107)；GSTFSINAMA(SEQ ID NO:108)；GSTFSINAMG(SEQ ID NO:109)；GSTFSINAMM(SEQ IDNO:110)；GSTFSINAVA(SEQ ID NO:111)；GSTFSINNAMG(SEQ ID NO:112)；GSTFSINSMG(SEQID NO:113)；GSTFSSNAMA(SEQ ID NO:114)；GSTFSVNAVA(SEQ ID NO:115)。
在一些实施方案中，人FAP结合剂包含选自以下的CDR2序列：
AISSGGSTNYAASVKG(SEQ ID NO:116)；AVTSGGVTNYADSVKG(SEQ ID NO:117)；GIATDGRTNYAHSVKG(SEQ ID NO:118)；GIDGGGVTNYPDSVKG(SEQ ID NO:119)；GIDSADITDYARFVKG(SEQ ID NO:120)；GIIGSHSTNYADSVKG(SEQ ID NO:121)；GISGDNITNYPDSVKG(SEQ ID NO:122)；GISGDNITNYPNSVKG(SEQ ID NO:123)；GISGGDVTHYPDSVKG(SEQ ID NO:124)；GISGGGATNYPDSMKG(SEQ ID NO:125)；GISGGGATNYPDSVKG(SEQ ID NO:126)；GISGGGVTNHPDSVKG(SEQ ID NO:127)；GISGGGVTNYPDSVKG(SEQ ID NO:128)；GISGGGVTNYPDSVRG(SEQ ID NO:129)；GISGGGVTSYPDSVKG(SEQ ID NO:130)；GISGGITTYPDSVKG(SEQ ID NO:131)；GISGGSVTNYPDSVKG(SEQ ID NO:132)；GISGGVTNYPDSVKG(SEQ ID NO:133)；GISSDDITYYPDSVKG(SEQ ID NO:134)；GISSDGATHYPDSVKG(SEQ ID NO:135)；GISSGGDTNYPDSVKG(SEQ ID NO:136)；GISSGGVTHYPDSVKG(SEQ ID NO:137)；GISSSGPPHYPDSVKG(SEQ ID NO:138)；GITSDGITNYADSVKG(SEQ ID NO:139)；GITSDGLGNYVDFVKG(SEQ ID NO:140)；GITSDGLGNYVGFAKG(SEQ ID NO:141)；GITSDGVTKYPDSVKG(SEQ ID NO:142)；GITSDGVTNYPDSVKG(SEQ ID NO:143)；GITSDSVTKYPDSVKG(SEQ ID NO:144)。
在一些实施方案中，人FAP结合剂包含选自以下的CDR3序列：
AAVVTAKGMGAIQSRGY(SEQ ID NO:145)；ADSSRGKIYFSNYRSWNY(SEQ ID NO:146)；ARFGIRDF(SEQ ID NO:147)；FWPPLYGRP(SEQ ID NO:148)；FWPPPSDRPI(SEQ ID NO:149)；FWPPPSGRPI(SEQ ID NO:150)；KWPPSVPPN(SEQ ID NO:151)；LWPPMASPSGAIY(SEQ ID NO:152)；LWPPRAPPDGRVY(SEQ ID NO:153)；LWPPRAPPGGRVY(SEQ ID NO:154)；LWPPRASPDGGVY(SEQ ID NO:155)；LWPPRASPDGRVY(SEQ IDNO:156)；LWPPRASPGGGVY(SEQ ID NO:157)；LWPPRASPGGLVY(SEQ ID NO:158)；LWPPRASPGGRVY(SEQ ID NO:159)；LWPPRASPSGAVY(SEQID NO:160)；LWPPRASPSGRGY(SEQ ID NO:161)；LWPPRASPSGRID(SEQ ID NO:162)；LWPPRASPSGRIY(SEQ ID NO:163)；LWPPRASPSGRLY(SEQ ID NO:164)；LWPPRASPSGRPY(SEQID NO:165)；LWPPRASPSGRVY(SEQ ID NO:166)；LWPPRASPSGSIY(SEQ ID NO:167)；LWPPRASPSGTIY(SEQ ID NO:168)；LWPPRVSPGGGVY(SEQ ID NO:169)；LWPPRVSPGGRVY(SEQID NO:170)；LWPPRVSPSGRGY(SEQ ID NO:171)；LWPPRVSPSGRIY(SEQ ID NO:172)；LYPPASSGR(SEQ ID NO:173)；MYRPGTYDY(SEQ ID NO:174)；QWPPRALDA(SEQ ID NO:175)。
作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，人VHH FAP结合剂包含选自以下序列的氨基酸序列：
2PE48：
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGTMLSRNAMGWYRQAPGKPRQWVAGITSDGLGNYVGFAKGRFTISRDNAKNTVYLQMNTLKPDDTAVYHCNFWPPPSGRPIWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:837)
3PE60：
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGTMLSRNAMGWYRQAPGKQRQWVAGITSDGLGNYVDFVKGRFTISRDNARNTVYLQMNTLKPDDTAVYYCNFWPPPSDRPIWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:838)
2PE34：
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAVSGSTARLDAMGWYRQAPGKQREWVAGIDSADITDYARFVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNKWPPSVPPNWGHGTQVTVSS(SEQ ID NO:839)
3PE80：
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAVSGSTARLDAMGWYRQAPGKQREWVAGIDSADITDYARFVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNKWPPSVPPNWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:840)
2PE54：
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCVHSGGIFTIGPLGWYRQAPGSQRELVATVTNGGGTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNAAVVTAKGMGAIQSRGYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:841)
3PE81：
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAHSGGIFTIGPLGWYRQAPGSQRELVATVTNGGGTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNAAVVTAKGMGAIQSRGYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:842)
2PE10：
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSTFSINAMMWYRQAPGKQRELVASIGSGGNTYYADSVKGRFTISRDNGKSTLYLQMNSLKPEDTAVYYCKMYRPGTYDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:843)
3PE66：
QVQLQESGGGWVQPGGSLRLSCAASGSTFSINAMMWYRQAPGKQRELVASIGSGGNTYYADSVKGRFTISRDNGKSTLYLQMNSLKPEDTAVYYCKMYRPGTYDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:844)
2PE31：
QVQLQESGGGLVQAGGSLSVSCAASGSIFSMGWFRQAPGKQRELVAAVTSGGVTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMKSLKPEDTAVYYCAADSSRGKIYFSNYRSWNYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:845)
2PE79：
QVQLQESGGGLVQAGESLRLSCAVSATISSMNSMAWYRQAPGKQREWVAGLETGGRANYVDSVKGRFTISRDNARNTVLLQMNSLKPEDTAVYYCNRWPPLRSSWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:846)
2PE91：
QVQLQESGGGLVQPGESLRLSCAASGSISSRNAMGWYRQAPGKEREWVAGITSDGITNYADSVKGRFTISRDNAKNTVGLQMNSLKPDDTAVYYCNFWPPLYGRPWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:847)
3PE38：
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFIFRSTSMGWYRQAPGKQREFVAGIIGSHSTNYADSVKGRFTISRDNAQNAVYLHMNTLKPEDTAVYYCNLYPPASSGRWGKGTQVTVSS(SEQ ID NO:848)
2PE57：
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASLKISSINAMAWYRQAAGKQRELVAGIATDGRTNYAHSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNQWPPRALDAWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:849)
3PE15：
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGVTFGIGAMGWYRQTPENERELVAAISSGGSTNYAASVKGRFTISRDNAPNTVYLQMNSLKPEDTAIYYCNVRRGLAWYPGWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:850)在一些实施方案中，所述FAP结合剂包含具有包含至少一个CDR1、CDR2和/或CDR3序列的可变结构域的VHH。在一些实施方案中，所述FAP结合剂包含具有包含至少一个FR1、FR2、FR3和FR4序列的可变区的VHH。
在一些实施方案中，人FAP结合剂包含选自以下的CDR1序列：
GSTFSVNAVG(SEQ ID NO:851)；GSTFTINAMA(SEQ ID NO:852)；GSTFTINAMG(SEQ IDNO:853)；GSTSSINAMA(SEQ ID NO:854)；GSTSSMNAMA(SEQ ID NO:855)；GTMLSRNAMG(SEQ IDNO:856)；GVELSRSAMA(SEQ ID NO:857)；GVTFGIGAMG(SEQ ID NO:858)；LKISSINAMA(SEQ IDNO:859)；SGSTFSINAMA(SEQ ID NO:860)；VNIVNLNSVG(SEQ ID NO:861)。
在一些实施方案中，人FAP结合剂包含选自以下的CDR2序列：
GITSGGSTNYADSVKG(SEQ ID NO:862)；GITSGVTHYPDSVKG(SEQ ID NO:863)；GITSSGVTKYPDSVKG(SEQ ID NO:864)；GITSSGVTNYPDSVKG(SEQ ID NO:865)；GITSSGVTQYPDSVKG(SEQ ID NO:866)；GITTDGITKYPDSLKG(SEQ ID NO:867)；GLETGGRANYVDSVKG(SEQ ID NO:868)；SIGSGGNTYYADSVKG(SEQ ID NO:869)；SIISDGRTNYADSVKG(SEQ ID NO:870)；SITSAGSTNYAESVKG(SEQ ID NO:871)；SITSDGRTNYADSVKG(SEQ ID NO:872)；SITSGGRTNYADSVKG(SEQ ID NO:873)；SITSGGRTNYSDSVKG(SEQ ID NO:874)；TFTRGGDINYADSVKG(SEQ ID NO:875)；TVTNGGGTYYADSVKG(SEQ ID NO:876)。
在一些实施方案中，人FAP结合剂包含选自以下的CDR3序列：
RWPPLRSS(SEQ ID NO:877)；TPPRIGRGY(SEQ ID NO:878)；VRRGLAWYPG(SEQ IDNO:879)。
在一些实施方案中，人FAP结合剂包含选自以下的CDR1序列：
GSTFSIAAVA(SEQ ID NO:1093)；GSTFSIDAVA(SEQ ID NO:1094)；GSTFSIEAVA(SEQID NO:1095)；GSTFSIFAVA(SEQ ID NO:1096)；GSTFSIGAVA(SEQ ID NO:1097)；GSTFSIHAVA(SEQ ID NO:1098)；GSTFSIIAVA(SEQ ID NO:1099)；GSTFSIKAVA(SEQ ID NO:1100)；GSTFSILAVA(SEQ ID NO:1101)；GSTFSIPAVA(SEQ ID NO:1102)；GSTFSIQAVA(SEQ ID NO:1103)；GSTFSIRAVA(SEQ ID NO:1104)；GSTFSISAVA(SEQ ID NO:1105)；GSTFSITAVA(SEQ IDNO:1106)；GSTFSIVAVA(SEQ ID NO:1107)；GSTFSIWAVA(SEQ ID NO:1108)；GSTFSIYAVA(SEQID NO:1109)；GSTSSANAMA(SEQ ID NO:1110)；GSTSSDNAMA(SEQ ID NO:1111)；GSTSSENAMA(SEQ ID NO:1112)；GSTSSFNAMA(SEQ ID NO:1113)；GSTSSGNAMA(SEQ ID NO:1114)；GSTSSHNAMA(SEQ ID NO:1115)；GSTSSINAMA(SEQ ID NO:1116)；GSTSSKNAMA(SEQ ID NO:1117)；GSTSSLNAMA(SEQ ID NO:1118)；GSTSSNNAMA(SEQ ID NO:1119)；GSTSSPNAMA(SEQ IDNO:1120)；GSTSSQNAMA(SEQ ID NO:1121)；GSTSSRNAMA(SEQ ID NO:1122)；GSTSSSNAMA(SEQID NO:1123)；GSTSSTNAMA(SEQ ID NO:1124)；GSTSSVNAMA(SEQ ID NO:1125)；GSTSSWNAMA(SEQ ID NO:1126)；GSTSSYNAMA(SEQ ID NO:1127)；GSTSSAWAMA(SEQ ID NO:1128)；GSTSSDWAMA(SEQ ID NO:1129)。
在一些实施方案中，本发明的FAP结合剂是如国际专利公布号WO 2016/110598(其以引用方式整体并入本文)中所描述的人FAP抗体(例如NI-206.82C2、NI-206.59B4、NI-206.22F7、NI-206.27E8、NI-206.12G4)或其部分(诸如VH链、VL链、CDR1、CDR2或CDR3)，其中VH链、VL链及其CDR的氨基酸序列如下：
FAP结合剂NI-206.82C2
NI-206.82C2 VH：
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSVTWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKGRITINPDTSKNQFYLQLKSVTPEDAAVYYCARDSSILYGDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:880)
NI-206.82C2 VL：
QAVLTQPSSLSASPGASASLTCTLPSGINVGTYRIFWFQQKPGSPPQYLLSYKSDSDNHQGSGVPSRFSGSKDASANAGILLISGLQSEDEADYYCMIWHSSAWVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:881)
本发明的FAP结合剂可以包括NI-206.82C2的VH链或VL链的CDR1、CDR2或CDR3。NI-206.82C2的VH链包括以下CDR：
CDR1：GDSVSSNSVTWN(SEQ ID NO:882)
CDR2：RTYYRSKWYND(SEQ ID NO:883)
CDR3：DSSILYGDY(SEQ ID NO:884)
NI-206.82C2的VL链包括以下CDR：
CDR1：TLPSGINVGTYRIF(SEQ ID NO:915)
CDR2：KSDSDNH(SEQ ID NO:916)
CDR3：MIWHSSAWV(SEQ ID NO:917)
FAP结合剂NI-206.59B4
NI-206.59B4 VH：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTDYYIHWVRQAPGQGLEWMGWINPNRGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSIATAYMELSRLRSDDTAVYYCATASLKIAAVGTFDCWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:918)
NI-206.59B4 VL：
SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGDALSKQYAFWFQQKPGQAPILVIYQDTKRPSGIPGRFSGSSSGTTVTLTISGAQADDEADYYCQSADSSGTYVFGTGTKVTVL(SEQ ID NO:919)
本发明的FAP结合剂可以包括NI-206.59B4的VH链或VL链的CDR1、CDR2或CDR3。NI-206.59B4的VH链包括以下CDR：
CDR1：GYTFTDYYIH(SEQ ID NO:920)
CDR2：WINPNRGGTN(SEQ ID NO:921)
CDR3：ASLKIAAVGTFDC(SEQ ID NO:922)
NI-206.82C2的VL链包括以下CDR：
CDR1：SGDALSKQYAF(SEQ ID NO:923)
CDR2：QDTKRPS(SEQ ID NO:924)
CDR3：QSADSSGTYV(SEQ ID NO:925)
FAP结合剂NI-206.22F7
NI-206.22F7 VH：
EVQLVETGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSTHGMYWVRQPPGKGLEWVAVISYDGSDKKYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLEMSSVRAEDTALYYCFCRRDAFDLWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO:926)
NI-206.22F7 VL：
SYVLTQPPSVSVSPGQTARITCSGDALPKKYAYWYQQKSGQAPVLVIYEDTKRPSGIPERFSGSSSGTMATLTISGAQVEDEADYYCYSTDSSGNYWVFGGGTEVTVL(SEQ ID NO:927)
本发明的FAP结合剂可以包括NI-206.22F7的VH链或VL链的CDR1、CDR2或CDR3。NI-206.22F7的VH链包括以下CDR：
CDR1：GFSFSTHGMY(SEQ ID NO:928)
CDR2：VISYDGSDKK(SEQ ID NO:929)
CDR3：RRDAFDL(SEQ ID NO:930)
NI-206.22F7的VL链包括以下CDR：
CDR1：SGDALPKKYAY(SEQ ID NO:931)
CDR2：EDTKRPS(SEQ ID NO:932)
CDR3：YSTDSSGNYWV(SEQ ID NO:933)
FAP结合剂NI-206.27E8
NI-206.27E8 VH：
EVQLVESGGGLVEPGGSLRLSCAASGFTFSDAWMNWVRQAPGKGLEWVGRIKTKSDGGTTDYAAPVRGRFSISRDDSKNTLFLEMNSLKTEDTAIYYCFITVIVVSSESPLDHWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:934)
NI-206.27E8 VL：
SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGDELPKQYAYWYQQKPGQAPVLVIYKDRQRPSGIPERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYCQSAYSINTYVIFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:935)
本发明的FAP结合剂可以包括NI-206.27E8的VH链或VL链的CDR1、CDR2或CDR3。NI-206.27E8的VH链包括以下CDR：
CDR1：GFTFSDAWMN(SEQ ID NO:936)
CDR2：RIKTKSDGGTTD(SEQ ID NO:937)
CDR3：TVIVVSSESPLDH(SEQ ID NO:938)
NI-206.27E8的VL链包括以下CDR：
CDR1：SGDELPKQYAY(SEQ ID NO:939)
CDR2：KDRQRPS(SEQ ID NO:940)
CDR3：QSAYSINTYVI(SEQ ID NO:941)
FAP结合剂NI-206.12G4
NI-206.12G4 VH：
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWISYISSGSSYTNYADSVKGRFTISRDNAKKSVYLEVNGLTVEDTAVYYCARVRYGDREMATIGGFDFWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:942)
NI-206.12G4 VL：
SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGDALPKQYAYWYQQSPGQAPVLVIYKDSERPSGIPERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYCQSADSGGTSRIFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:943)
本发明的FAP结合剂可以包括NI-206.12G4的VH链或VL链的CDR1、CDR2或CDR3。NI-206.12G4的VH链包括以下CDR：
CDR1：GFTFSDYYMS(SEQ ID NO:944)
CDR2：YISSGSSYTN(SEQ ID NO:945)
CDR3：VRYGDREMATIGGFDF(SEQ ID NO:946)
NI-206.12G4的VL链包括以下CDR：
CDR1：SGDALPKQYAY(SEQ ID NO:947)
CDR2：KDSERPS(SEQ ID NO:948)
CDR3：QSADSGGTSRI(SEQ ID NO:949)
FAP结合剂NI-206.17A6
NI-206.17A6 VH：
QVQLQESGPGLVRSTETLSLTCLVSGDSINSHYWSWLRQSPGRGLEWIGYIYYTGPTNYNPSLKSRVSISLGTSKDQFSLKLSSVTAADTARYYCARNKVFWRGSDFYYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:950)
NI-206.17A6 VL：
EIVLTQSPGTLSLSLGERATLSCRASQSLANNYLAWYQQKPGQAPRLLMYDASTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQFVTSHHMYIFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:951)
本发明的FAP结合剂可以包括NI-206.17A6的VH链或VL链的CDR1、CDR2或CDR3。NI-206.17A6的VH链包括以下CDR：
CDR1：GDSINSHYWS(SEQ ID NO:952)
CDR2：YIYYTGPTN(SEQ ID NO:953)
CDR3：NKVFWRGSDFYYYMDV(SEQ ID NO:954)
NI-206.17A6的VL链包括以下CDR：
CDR1：RASQSLANNYLA(SEQ ID NO:955)
CDR2：DASTRAT(SEQ ID NO:956)
CDR3：QQFVTSHHMYI(SEQ ID NO:957)
在一些实施方案中，本发明的FAP结合剂是来自国际专利公布号WO 1999/057151(其以引用方式整体并入本文)中的FAP抗体(例如人源化F19)或其部分(诸如VH链、VL链、CDR1、CDR2或CDR3)，其中VH链、VL链及其CDR的氨基酸序列如下：
人源化F19 VH：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSRYTFTEYTIHWVRQAPGQRLEWIGGINPNNGIPNYNQKFKGRVTITVDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRRIAYGYDEGHAMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:958)
人源化F19 VL：
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSRNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIFWASTRESGVPDRFSGSGFGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYFSYPLTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:959)
本发明的FAP结合剂可以包括F19的VH链或VL链的CDR1、CDR2或CDR3。F19的VH链包括以下CDR：
CDR1：RYTFTEYTIH(SEQ ID NO:960)
CDR2：GINPNNGIPN(SEQ ID NO:961)
CDR3：RRIAYGYDEGHAMDY(SEQ ID NO:962)
F19的VL链包括以下CDR：
CDR1：KSSQSLLYSRNQKNYLA(SEQ ID NO:963)
CDR2：WASTRES(SEQ ID NO:964)
CDR3：QQYFSYPLT(SEQ ID NO:965)
在一些实施方案中，本发明的FAP结合剂是来自国际专利公布号WO 2007/077173(其以引用方式整体并入本文)中的FAP抗体(例如MFP5小鼠、MFP5人源化变体1和MFP5人源化变体2)或其部分(诸如VH链、VL链、CDR1、CDR2或CDR3)，其中VH链、VL链及其CDR的氨基酸序列如下：
FAP结合剂MP5(小鼠)
MFP5 VH(小鼠)：
QVQLQQSGAELARPGASVNLSCKASGYTFTNNGINWLKQRTGQGLEWIGEIYPRSTNTLYNEKFKGKATLTADRSSNTAYMELRSLTSEDSAVYFCARTLTAPFAFWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:966)
MFP5 VL(小鼠)：
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSGVNFMHWYQQKSGTSPKRWIFDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO:967)
本发明的FAP结合剂可以包括MFP5(小鼠)的VH链或VL链的CDR1、CDR2或CDR3。MFP5的VH链包括以下CDR：
CDR1：GYTFTNNGIN(SEQ ID NO:968)
CDR2：EIYPRSTNTL(SEQ ID NO:969)
CDR3：TLTAPFAF(SEQ ID NO:970)
MFP5的VL链包括以下CDR：
CDR1：SASSGVNFMH(SEQ ID NO:971)
CDR2：DTSKLAS(SEQ ID NO:972)
CDR3：QQWSFNPPT(SEQ ID NO:973)
FAP结合剂MP5(人源化变体1)
MFP5(人源化变体1)VH：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNNGINWLRQAPGQGLEWMGEIYPRSTNTLYAQKFQGRVTITADRSSNTAYMELSSLRSEDTAVYFCARTLTAPFAFWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:974)
MFP5(人源化变体1)VL：
QIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSGVNFMHWYQQKPGQAPRRLIFDTSKLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:975)
本发明的FAP结合剂可以包括MFP5(人源化变体1)的VH链或VL链的CDR1、CDR2或CDR3。MFP5(人源化变体1)的VH链包括以下CDR：
CDR1：GYTFTNNGIN(SEQ ID NO:976)
CDR2：EIYPRSTNTL(SEQ ID NO:977)
CDR3：TLTAPFAF(SEQ ID NO:978)
MFP5(人源化变体1)的VL链包括以下CDR：
CDR1：SASSGVNFMH(SEQ ID NO:979)
CDR2：DTSKLAS(SEQ ID NO:980)
CDR3：QQWSFNPPT(SEQ ID NO:981)
FAP结合剂MP5(人源化变体2)
MFP5(人源化变体2)VH：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNNGINWLRQAPGQGLEWMGEIYPRSTNTLYAQKFQGRVTITADRSSNTAYMELSSLRSEDTAVYFCARTLTAPFAFWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:982)
MFP5(人源化变体2)VL：
QIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSGVNFMHWYQQKPGQAPKRLIFDTSKLASGVPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:983)
本发明的FAP结合剂可以包括MFP5(人源化变体2)的VH链或VL链的CDR1、CDR2或CDR3。MFP5(人源化变体2)的VH链包括以下CDR：
CDR1：GYTFTNNGIN(SEQ ID NO:984)
CDR2：EIYPRSTNTL(SEQ ID NO:985)
CDR3：TLTAPFAF(SEQ ID NO:986)
MFP5(人源化变体2)的VL链包括以下CDR：
CDR1：SASSGVNFMH(SEQ ID NO:987)
CDR2：DTSKLAS(SEQ ID NO:988)
CDR3：QQWSFNPPT(SEQ ID NO:989)
在一些实施方案中，本发明的FAP结合剂是来自国际专利公布号WO 2012/107417(其以引用方式整体并入本文)中的FAP抗体(例如4G8、3F2、28H1、29B11、14B3和4B9)或其部分(诸如VH链、VL链、CDR1、CDR2或CDR3)，其中VH链、VL链及其CDR的氨基酸序列如下：
FAP结合剂4G8
4G8 VH：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWLGNFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:990)
4G8 VL：
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSRSYLAWYQQKPGQAPRLLIIGASTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGQVIPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:991)
本发明的FAP结合剂可以包括4G8的VH链或VL链的CDR1、CDR2或CDR3。4G8的VH链包括以下CDR：
CDR1：GFTFSSYAMS(SEQ ID NO:992)
CDR2：AISGSGGSTY(SEQ ID NO:993)
CDR3：GWLGNFDY(SEQ ID NO:994)
4G8的VL链包括以下CDR：
CDR1：RASQSVSRSYLA(SEQ ID NO:995)
CDR2：GASTRAT(SEQ ID NO:996)
CDR3：QQGQVIPPT(SEQ ID NO:997)
FAP结合剂3F2
3F2 VH：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:998)
3F2 VL：
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:999)
本发明的FAP结合剂可以包括3F2的VH链或VL链的CDR1、CDR2或CDR3。3F2的VH链包括以下CDR：
CDR1：GFTFSSYAMS(SEQ ID NO:1000)
CDR2：AISGSGGSTY(SEQ ID NO:1001)
CDR3：GWFGGFNY(SEQ ID NO:1002)
3F2的VL链包括以下CDR：
CDR1：RASQSVTSSYLA(SEQ ID NO:1003)
CDR2：VGSRRAT(SEQ ID NO:1004)
CDR3：QQGIMLPPT(SEQ ID NO:1005)
FAP结合剂28H1
28H1 VH：
QVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAPGKGLEWVSAIWASGEQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWLGNFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:1006)
28H1 VL：
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSRSYLAWYQQKPGQAPRLLIIGASTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGQVIPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:1007)
本发明的FAP结合剂可以包括28H1的VH链或VL链的CDR1、CDR2或CDR3。28H1的VH链包括以下CDR：
CDR1：GFTFSSHAMS(SEQ ID NO:1008)
CDR2：AIWASGEQY(SEQ ID NO:1009)
CDR3：GWLGNFDY(SEQ ID NO:1010)
28H1的VL链包括以下CDR：
CDR1：RASQSVSRSYLA(SEQ ID NO:1011)
CDR2：GASTRAT(SEQ ID NO:1012)
CDR3：QQGQVIPPT(SEQ ID NO:1013)
FAP结合剂29B11
29B11 VH：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGGITYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:1014)
29B11 VL：
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:1015)
本发明的FAP结合剂可以包括29B11的VH链或VL链的CDR1、CDR2或CDR3。29B11的VH链包括以下CDR：
CDR1：GFTFSSYAMS(SEQ ID NO:1016)
CDR2：AIIGSGGITY(SEQ ID NO:1017)
CDR3：GWFGGFNY(SEQ ID NO:1018)
29B11的VL链包括以下CDR：
CDR1：RASQSVTSSYLA(SEQ ID NO:1019)
CDR2：VGSRRAT(SEQ ID NO:1020)
CDR3：QQGIMLPPT(SEQ ID NO:1021)
FAP结合剂14B3
14B3 VH：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAILASGAITYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:1022)
14B3 VL：
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:1023)
本发明的FAP结合剂可以包括14B3的VH链或VL链的CDR1、CDR2或CDR3。14B3的VH链包括以下CDR：
CDR1：GFTFSSYAMS(SEQ ID NO:1024)
CDR2：AILASGAITY(SEQ ID NO:1025)
CDR3：GWFGGFNY(SEQ ID NO:1026)
14B3的VL链包括以下CDR：
CDR1：RASQSVTSSYLA(SEQ ID NO:1027)
CDR2：VGSRRAT(SEQ ID NO:1028)
CDR3：QQGIMLPPT(SEQ ID NO:1029)
FAP结合剂4B9
4B9 VH：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:1030)
4B9 VL：
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:1031)
本发明的FAP结合剂可以包括4B9的VH链或VL链的CDR1、CDR2或CDR3。4B9的VH链包括以下CDR：
CDR1：GFTFSSYAMS(SEQ ID NO:1032)
CDR2：AIIGSGASTY(SEQ ID NO:1033)
CDR3：GWFGGFNY(SEQ ID NO:1034)
4B9的VL链包括以下CDR：
CDR1：RASQSVTSSYLA(SEQ ID NO:1035)
CDR2：VGSRRAT(SEQ ID NO:1036)
CDR3：QQGIMLPPT(SEQ ID NO:1037).
本文所公开的任一种FAP结合剂可以是抗体。作为抗体的FAP结合剂可以是本文所公开的任一种嵌合蛋白或嵌合蛋白复合物的一部分。如本文所使用，术语“抗体”是指特异性地结合至抗原的任何免疫球蛋白或抗体(例如人、仓鼠、猫科动物、小鼠、软骨鱼或骆驼科动物抗体)及其任何衍生物或缀合物。本领域技术人员已知多种抗体。抗体的非限制性实例包括单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、单链抗体(例如单结构域抗体、骆驼科动物抗体和软骨鱼抗体)、嵌合抗体、猫科动物抗体和猫源化抗体。单克隆抗体是针对抗原特定表位的均质抗体群。多克隆抗体是包含在免疫动物血清中的异质抗体分子群。术语“抗体”还包括抗体衍生物和缀合物(例如，与稳定化蛋白、可检测部分或治疗剂缀合的抗体)。
本文所公开的任一种FAP结合剂可以是抗体的抗原结合片段。作为抗体的抗原结合片段的FAP结合剂可以是本文所公开的任一种嵌合蛋白或嵌合蛋白复合物的一部分。“抗原结合片段”是含有至少一个能够与抗原特异性结合的可变结构域(例如，哺乳动物(例如猫科动物、人、仓鼠或小鼠)重链或轻链免疫球蛋白的可变结构域、骆驼科动物可变抗原结合结构域(VHH)或软骨鱼免疫球蛋白新抗原受体(Ig-NAR)结构域)的全长抗体的任何部分。抗体片段的非限制性实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、双抗体、线性抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。含有至少一个骆驼科动物VHH结构域或至少一个软骨鱼Ig-NAR结构域的另外的抗体片段包括迷你抗体(mini-body)、微型体(micro-antibody)、亚纳米抗体(subnano-antibody)和纳米抗体，以及例如在美国公布号2010/0092470中所描述的抗体的其他形式中的任何形式。
本文所公开的任一种FAP结合剂可以是抗体的Fv片段。作为抗体的Fv片段的FAP结合剂可以是本文所公开的任一种嵌合蛋白或嵌合蛋白复合物的一部分。“Fv片段”是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密的非共价缔合的一个重链可变结构域与一个轻链可变结构域的二聚体组成。在该构型中，每个可变结构域的三个互补决定区(CDR)相互作用以在VH-VL二聚体的表面上限定抗原结合部位。
本文所公开的任一种FAP结合剂可以是抗体的互补决定区(CDR)。作为抗体的CDR的FAP结合剂可以是本文所公开的任一种嵌合蛋白或嵌合蛋白复合物的一部分。术语CDR是指免疫球蛋白(重链或轻链免疫球蛋白)内的区域，其形成抗体或其抗原结合片段中抗原结合部位的一部分。如本领域中所已知的，重链和轻链免疫球蛋白各自含有三个CDR，称为CDR1、CDR2和CDR3。在任何抗体或抗原结合片段中，来自重链免疫球蛋白的三个CDR和来自轻链免疫球蛋白的三个CDR一起在抗体或其抗原结合片段中形成抗原结合位点。Kabat数据库是在本领域中用于对存在于轻链免疫球蛋白或重链免疫球蛋白中的CDR序列进行编号的一个系统。
六个CDR一起赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包含三个对抗原特异的CDR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管通常具有比完整结合位点低的亲和力。“Fab片段”还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。“Fab片段”与“Fab'片段”的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基端添加了一些残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。“F(ab')2片段”最初被产生为一对“Fab'片段”，它们之间具有铰链半胱氨酸。制备此类抗体片段的方法(诸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化)是本领域技术人员已知的。举例来说，可以通过胃蛋白酶消化抗体分子产生F(ab')2片段，并且可以通过还原F(ab')2片段的二硫桥产生Fab片段。在一些情况下，可以构建Fab表达文库。参见，例如，Huse等人,Science,246:1275,1989。一旦产生，可以使用标准免疫测定方法诸如ELISA技术、放射免疫测定和蛋白质印迹来测试抗体或其片段对TNFRSF25多肽的识别。参见，Short Protocols in Molecular Biology,第11章,Green Publishing Associatesand John Wiley&Sons,Ausubel等人编辑,1992。
抗体可以为IgA型、IgD型、IgE型、IgG型或IgM型，包括IgG型或IgM型，诸如但不限于IgG1型、IgG2型、IgG3型、IgG4型、IgM1型和IgM2型。举例来说，在一些情况下，抗体是IgG1型、IgG2型或IgG4型。
在一些实施方案中，如本文所提供的抗体可以是完全人抗体或人源化抗体。“人抗体”是指由存在于人基因组中的核酸(例如重排的人免疫球蛋白重链或轻链基因座)编码的抗体。在一些实施方案中，可以在人细胞培养物(例如猫科动物杂交瘤细胞)中产生人抗体。在一些实施方案中，可以在非人细胞(例如小鼠或仓鼠细胞系)中产生人抗体。在一些实施方案中，可以在细菌或酵母细胞中产生人抗体。
人抗体可以避免与异种抗体(诸如具有鼠或大鼠可变区和/或恒定区的抗体)相关的某些问题。举例来说，因为效应部分是人，其可以更好地与人免疫系统的其他部分相互作用，例如，通过补体依赖性细胞毒性或抗体依赖性细胞毒性更高效地破坏靶细胞。此外，人免疫系统不应该将抗体识别为外来的。另外，人体循环中的半衰期与天然存在的人抗体相似，允许给予更小和更少频率的剂量。制备人抗体的方法在本领域中是已知的。
如本文所使用，术语“人源化抗体”是指含有来源于非人(例如小鼠、仓鼠、大鼠、兔或山羊)免疫球蛋白的最小序列的人抗体。人源化抗体一般是来自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或其他物种的嵌合或突变单克隆抗体，其携带人恒定区和/或可变区结构域或特异性变化。在非限制性实例中，人源化抗体是人抗体(受体抗体)，其中受体抗体的高变区(HVR)残基被来自非人物种(供体)抗体(诸如具有所期望的特异性、亲和力和容量的小鼠、大鼠、兔或山羊抗体)的HVR残基替换。在一些实施方案中，人免疫球蛋白的Fv框架残基可以被对应的非人残基替换。在一些实施方案中，人源化抗体可以含有不存在于受体抗体或供体抗体中的残基。举例来说，可以进行这样的修饰以改善抗体性能。
在一些实施方案中，人源化抗体可含有基本上全部、至少一个以及通常两个可变结构域，其中全部或基本上全部高变环(CDR)对应于非人免疫球蛋白的那些高变环，而全部或基本上全部框架区是人免疫球蛋白序列的那些框架区。人源化抗体还可含有免疫球蛋白恒定(Fc)区的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的区域。
在一些实施方案中，如本文所提供的人源化抗体或抗原结合片段可具有降低的或最小的效应功能(例如，如与对应的非人源化抗体相比)，使得其不会刺激效应细胞作用至与对应的非人源化抗体会产生的程度相同的程度。
产生人源化抗体的技术是本领域技术人员熟知的。在一些实施方案中，可以利用通过蛋白质二硫键连接(以形成新的人工蛋白质分子或“嵌合”抗体)的抗体结构域的受控重排(Konieczny等人,Haematologia(Budap.)14:95,1981)。重组DNA技术可用于构建编码小鼠抗体可变轻链和重链结构域与人抗体轻链和重链恒定结构域的DNA序列之间的基因融合物(Morrison等人,Proc Natl Acad Sci USA 81:6851,1984)。举例来说，编码鼠单克隆抗体的抗原结合部分或CDR的DNA序列可以通过分子方法移植到编码人抗体重链和轻链框架的DNA序列中(Jones等人,Nature 321:522,1986；和Riechmann等人,Nature 332:323,1988)。表达的重组产物称为“重塑过的(reshaped)”或人源化的抗体，并含有人抗体轻链或重链的框架和鼠单克隆抗体的抗原识别部分CDR。
用于设计重链和轻链以及用于产生人源化抗体的其他方法描述于例如美国专利号5,530,101；5,565,332；5,585,089；5,639,641；5,693,761；5,693,762；和5,733,743中。用于对抗体进行人源化的另外的方法描述于例如美国专利号4,816,567；4,935,496；5,502,167；5,558,864；5,693,493；5,698,417；5,705,154；5,750,078；和5,770,403中。
可以使用标准方法产生本文所公开的抗体。举例来说，可以重组方式产生所述抗体，从生物样品(例如异源表达系统)纯化，或以化学方式合成，并将其用于免疫宿主动物，包括兔、鸡、小鼠、豚鼠或大鼠。可用于增加免疫应答的各种佐剂取决于宿主物种，其包括弗氏佐剂(完全和不完全)、矿物凝胶诸如氢氧化铝、表面活性物质诸如溶血卵磷脂、复合多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔戚血蓝蛋白和二硝基苯酚。可以使用例如FAP和标准杂交瘤技术制备单克隆抗体。具体地，单克隆抗体可以通过任何技术获得，所述技术通过培养中的连续细胞系(诸如由Kohler等人(Nature 256:495,1975)所述的)、Kosbor等人(ImmunologyToday,4:72,1983)或Cote等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:2026,1983)的人B细胞杂交瘤技术和由Cole等人(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,第77-96页,1983)描述的EBV-杂交瘤技术提供抗体分子的产生。此类抗体可以是任何免疫球蛋白类别，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD及其任何亚类。可以在体外和体内培养产生单克隆抗体的杂交瘤。
在一些实施方案中，如本文所提供的抗体具有重链可变区，所述重链可变区含有本文所公开的任一VH氨基酸序列。在其他实施方案中，如本文所提供的抗体具有重链可变区，所述重链可变区含有本文所公开的任一VH氨基酸序列，但具有1至24个修饰(例如取代、添加或缺失)，使得氨基酸序列具有例如一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个、十九个、二十个、二十一个、二十二个、二十三个或二十四个修饰。在一些实施方案中，如本文所提供的抗体具有轻链可变区，所述轻链可变区含有本文所公开的任一VL氨基酸序列。在其他实施方案中，如本文所提供的抗体具有轻链可变区，所述轻链可变区含有本文所公开的任一VL氨基酸序列，但具有1至24个修饰(例如取代、添加或缺失)，使得氨基酸序列具有例如一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个、十九个、二十个、二十一个、二十二个、二十三个或二十四个修饰。本文件还提供了含有如本文所公开的重链可变区多肽和轻链可变区多肽的抗体和抗原结合片段。举例来说，根据式(FW1)-(CDR1)-(FW2)-(CDR2)-(FW3)-(CDR3)-(FW4)，如本文所公开的抗体或抗原结合片段还可以包括并置在CDR之间的可变区重链框架(FW)序列。在一些实施方案中，FW序列可以是人序列。
在一些实施方案中，举例来说，FAP结合剂在本文所公开的抗体的CDR的氨基酸序列中的任一者中具有多达五个修饰(取代、缺失或插入)。举例来说，FAP结合剂在本文所公开的抗体的CDR1、CDR2或CDR3的氨基酸序列中的任一者中包括多达五个取代、缺失或插入。
在一些实施方案中，对本文所公开的抗体或FAP结合剂的氨基酸取代可以通过选择保守取代来进行，所述保守取代在它们对以下面的影响方面没有显著差异：维持(a)取代区域中肽骨架的结构，(b)靶位点的分子的电荷或疏水性，或(c)侧链体积。举例来说，可以基于侧链特性将天然存在的残基分成以下组：(1)疏水性氨基酸(正亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)；(2)中性亲水氨基酸(半胱氨酸、丝氨酸和苏氨酸)；(3)酸性氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)；(4)碱性氨基酸(天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸和精氨酸)；(5)影响链取向的氨基酸(甘氨酸和脯氨酸)；和(6)芳香族氨基酸(色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸)。在这些组内进行的取代可以被认为是保守取代。保守取代的非限制性实例包括但不限于缬氨酸对丙氨酸的取代、赖氨酸对精氨酸的取代、谷氨酰胺对天冬氨酸的取代、谷氨酸对天冬氨酸的取代、丝氨酸对半胱氨酸的取代、天冬酰胺对谷氨酰胺的取代、天冬氨酸对谷氨酸的取代、脯氨酸对甘氨酸的取代、精氨酸对组氨酸的取代、亮氨酸对异亮氨酸的取代、异亮氨酸对亮氨酸的取代、精氨酸对赖氨酸的取代、亮氨酸对甲硫氨酸的取代、亮氨酸对苯丙氨酸的取代、甘氨酸对脯氨酸的取代、苏氨酸对丝氨酸的取代、丝氨酸对苏氨酸的取代、酪氨酸对色氨酸的取代、苯丙氨酸对酪氨酸的取代和/或亮氨酸对缬氨酸的取代。在一些实施方案中，氨基酸取代可以是非保守的，使得上述氨基酸类别之一的成员被交换为另一类别的成员。在一些实施方案中，FAP结合剂与选自SEQ ID NO:2-42、46-86、837-850、1045-1085或1086-1092的任一氨基酸序列或本文所公开的任一种FAP结合剂的氨基酸序列具有至少90％的同一性。在一些实施方案中，FAP结合剂与选自SEQ ID NO:2-42、46-86、837-850、1045-1085或1086-1092的任一氨基酸或本文所公开的任一种FAP结合剂的氨基酸具有约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％的同一性。
在一个实施方案中，举例来说，FAP结合剂在选自SEQ ID NO:87-175或851-879或本文所公开的FAP结合剂的任何CDR的任一氨基酸序列中具有多达五个取代、缺失或插入。举例来说，FAP结合剂在选自CDR1，例如SEQ ID NO:87-115、851-861、1093-1129、882、915、920、923、928、931、936、939、944、947、952、955、960、963、968、971、976、979、984、987、992、995、1000、1003、1008、1011、1016、1019、1024、1027、1032或1035的任一氨基酸序列中包括多达五个取代、缺失或插入(例如一个、二个、三个、四个或五个总氨基酸取代、缺失或插入)。相似地，在另一个实施方案中，FAP结合剂在选自CDR2，例如SEQ ID NO:116-144、862-876、883、916、921、924、929、932、937、940、945、948、953、956、961、964、969、972、977、980、985、988、993、996、1001、1004、1009、1012、1017、1020、1025、1028、1033或1036的任一氨基酸序列中包括多达五个取代、缺失或插入(例如一个、二个、三个、四个或五个总氨基酸取代、缺失或插入)。相似地，在另一个实施方案中，FAP结合剂在选自CDR3，例如SEQ ID NO:145-175、877-879、884、917、922、925、930、933、938、941、946、949、954、957、962、965、970、973、978、981、986、989、994、997、1002、1005、1010、1013、1018、1021、1026、1029、1034、1037的任一氨基酸序列中包括多达五个取代、缺失或插入(例如一个、二个、三个、四个或五个总氨基酸取代、缺失或插入)。氨基酸取代是指将肽序列中的一个或多个氨基酸残基替换为另外一个或多个残基。氨基酸缺失是指从肽序列中除去一个或多个氨基酸残基。氨基酸插入是指将一个或多个氨基酸残基添加到肽序列中。
在各个说明性实施方案中，鼠FAP结合剂与西伯妥珠单抗(sibrotuzumab)的氨基酸序列具有至少90％的同一性。
在一些实施方案中，本发明技术设想了如本文所描述的本发明技术的FAP结合剂的任何天然或合成类似物、突变体、变体、等位基因、同系物和直系同源物(本文中统称为“类似物”)的用途。在一些实施方案中，所述FAP结合剂的氨基酸序列还包括氨基酸类似物、氨基酸衍生物或其他非经典氨基酸。
在一些实施方案中，所述FAP结合剂包含靶向部分，所述靶向部分包含与本文所公开的FAP序列中的任一者具有至少60％同一性的序列。举例来说，所述FAP结合剂可以包含靶向部分，所述靶向部分包含与本文所公开的FAP序列中的任一者具有至少约60％、至少约61％、至少约62％、至少约63％、至少约64％、至少约65％、至少约66％、至少约67％、至少约68％、至少约69％、至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或100％同一性(例如，与本文所公开的序列中的任一者具有约60％、或约61％、或约62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、约99％或约100％序列同一性)的序列。
在一些实施方案中，所述FAP结合剂包含靶向部分，所述靶向部分包含相对于本文所公开的序列中的任一者具有一个或多个氨基酸突变的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述FAP结合剂包含靶向部分，所述靶向部分包含相对于本文所公开的序列中的任一者具有一个、或两个、或三个、或四个、或五个、或六个、或七个、或八个、或九个、或十个、或十五个、或二十个氨基酸突变的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸突变可以独立地选自取代、插入、缺失和截短。
在一些实施方案中，所述氨基酸突变是氨基酸取代，并且可以包括保守和/或非保守取代。
可以例如基于在所涉及的氨基酸残基的极性、电荷、大小、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲特性方面的相似性进行“保守取代”。20种天然存在的氨基酸可以分组至以下六个标准氨基酸组中：(1)疏水性：Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；以及(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
如本文所使用，“保守取代”定义为以上所示的六个标准氨基酸组中的同一组内所列出的一个氨基酸交换为另一个氨基酸。举例来说，Asp交换为Glu使得经如此修饰的多肽中保留一个负电荷。另外，基于甘氨酸和脯氨酸能够破坏a螺旋，它们可以彼此取代。
如本文所使用，“非保守取代”定义为以上所示的六个标准氨基酸组(1)至(6)中的不同组中所列出的一个氨基酸交换为另一个氨基酸。
在一些实施方案中，所述取代包括非经典氨基酸。说明性非经典氨基酸总体上包括但不限于硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸β-丙氨酸、GABA和δ-氨基乙酰丙酸、4-氨基苯甲酸(PABA)、普通氨基酸的D-异构体、2,4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟基脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、磺基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代氨基酸、设计师氨基酸诸如β甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸和氨基酸类似物。
在一些实施方案中，一个或多个氨基酸突变在靶向部分的CDR(例如，CDR1区、CDR2区或CDR3区)中。在另一个实施方案中，一个或多个氨基酸突变在靶向部分的框架区(FR)(例如，FR1区、FR2区、FR3区或FR4区)中。
可以使用本领域中的任何已知技术，例如定点诱变或基于PCR的诱变来实现对氨基酸序列的修饰。此类技术描述于例如以下文献中：Sambrook等人,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Plainview,N.Y.,1989和Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,N.Y.,1989。
在一些实施方案中，所述突变基本上不降低本发明的FAP结合剂特异性地结合至FAP的能力。在一些实施方案中，所述突变基本上不降低本发明的FAP结合剂特异性地结合至FAP并且不在功能上调节(例如，部分或完全中和)FAP的能力。
在一些实施方案中，可以用平衡解离常数(KD)来描述本发明技术的FAP结合剂对人FAP的全长和/或成熟形式和/或同种型和/或剪接变体和/或片段和/或单体和/或二聚体形式和/或任何其他天然存在的或合成的类似物、变体或突变体(包括单体和/或二聚体形式)的结合亲和力。在一些实施方案中，所述FAP结合剂包含靶向部分，所述靶向部分结合至人FAP的全长和/或成熟形式和/或同种型和/或剪接变体和/或片段和/或任何其他天然存在的或合成的类似物、变体或突变体(包括单体和/或二聚体形式)，其中KD低于约1μM、约900nM、约800nM、约700nM、约600nM、约500nM、约400nM、约300nM、约200nM、约100nM、约90nM、约80nM、约70nM、约60nM、约50nM、约40nM、约30nM、约20nM、约10nM、或约5nM、或约1nM。
在一些实施方案中，所述FAP结合剂包含靶向部分，所述靶向部分结合目标抗原但不在功能上调节(例如，部分或完全中和)目标抗原，即FAP。举例来说，在一些实施方案中，所述FAP结合剂的靶向部分仅仅靶向所述抗原但基本上不在功能上调节(例如，部分或完全抑制、降低或中和)所述抗原具有的生物效应。在一些实施方案中，所述FAP结合剂的靶向部分结合在物理上与对抗原的生物活性重要的抗原位点(例如，抗原的活性位点)隔开的表位。
此类无显著功能调节的结合可用于本发明技术的一些实施方案中，包括使用本发明的FAP结合剂直接或间接地经由效应抗原将活性免疫细胞募集至所需位点的方法。举例来说，在一些实施方案中，本发明的FAP结合剂可以用在减小或消除肿瘤的方法中以便直接或间接地经由FAP将树突状细胞募集至肿瘤细胞(例如，所述FAP结合剂可以包含具有抗FAP抗原识别结构域的靶向部分和具有针对肿瘤抗原或受体的识别结构域(例如抗原识别结构域)的靶向部分)。在此类实施方案中，需要直接或间接地募集树突状细胞但不在功能上调节或中和FAP活性。在这些实施方案中，FAP信号传导是肿瘤减小或消除作用的重要部分。
在一些实施方案中，所述FAP结合剂增强了树突状细胞的抗原呈递。举例来说，在一些实施方案中，本发明的FAP结合剂直接或间接地经由FAP将树突状细胞募集至肿瘤细胞，其中随后将肿瘤抗原内吞并且呈递在所述树突状细胞上以便诱导有效的体液应答和细胞毒性T细胞应答。
在其他实施方案(例如，涉及治疗癌症、自身免疫性或神经退行性疾病)中，所述FAP结合剂包含结合并且中和目标抗原，即FAP的靶向部分。举例来说，在一些实施方案中，本发明的方法可以抑制或减少FAP信号传导或表达，例如，以致使免疫应答减少。
具有信号传导剂的嵌合体和融合物
在一些实施方案中，如本文所公开的本发明技术的FAP结合剂是具有一个或多个信号传导剂的嵌合体或融合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物的一部分。因此，本发明技术提供了包括例如针对FAP的靶向部分和一个或多个信号传导剂的嵌合或融合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物。在一些实施方案中，所述信号传导剂是野生型信号传导剂或经修饰的信号传导剂。
在各个实施方案中，所述嵌合体或融合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物包含野生型信号传导剂，所述野生型信号传导剂相对于i)未融合至Fc的信号传导剂；ii)或不在复合物(例如但不限于异源二聚体复合物)情形内的信号传导剂具有提高的靶标选择性和安全性。在各个实施方案中，所述嵌合体或融合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物包含野生型信号传导剂，所述野生型信号传导剂相对于i)未融合至Fc的信号传导剂；ii)或不在复合物(例如但不限于异源二聚体复合物)情形内的信号传导剂具有提高的靶标选择活性。在各个实施方案中，所述基于Fc的嵌合蛋白复合物实现条件活性。
在各个实施方案中，所述嵌合体或融合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物包含野生型信号传导剂，所述野生型信号传导剂相对于未融合至Fc的信号传导剂或不在复合物(例如但不限于异源二聚体复合物)情形内的信号传导剂具有提高的安全性，诸如降低的全身毒性、降低的副作用和降低的脱靶效应。在各个实施方案中，提高的安全性意指与未融合至Fc的信号传导剂或不在复合物(例如但不限于异源二聚体复合物)情形内的信号传导剂相比本发明的嵌合体或融合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白提供了较低的毒性(例如全身毒性和/或组织/器官相关毒性)；和/或减轻或基本上消除的副作用；和/或增加的耐受性、减轻或基本上消除的不良事件；和/或减少或基本上消除的脱靶效应；和/或增加的治疗窗。
在一些实施方案中，所述受体处降低的亲和力或活性可通过与一个或多个如本文所描述的靶向部分连接或在包含于如本文所公开的基于Fc的嵌合蛋白复合物中后而恢复。
在各个实施方案中，所述嵌合体或融合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物包含野生型信号传导剂，所述野生型信号传导剂对其受体中的一者或多者具有降低、基本上降低或消除的亲和力，例如结合(例如KD)和/或激活(例如，当所述经修饰的信号传导剂是其受体的激动剂时，可测量为例如KA和/或EC50)和/或抑制(例如，当所述经修饰的信号传导剂是其受体的拮抗剂时，可测量为例如KI和/或IC50)。在各个实施方案中，信号传导剂受体处降低的亲和力允许减弱活性。在此类实施方案中，与未融合至Fc的信号传导剂或不在复合物(例如但不限于异源二聚体复合物)范围内的信号传导剂相比，所述经修饰的信号传导剂对受体具有约1％、或约3％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％，或约10％-20％、约20％-40％、约50％、约40％-60％、约60％-80％、约80％-100％的亲和力。在一些实施方案中，与未融合至Fc的信号传导剂或不在复合物(例如但不限于异源二聚体复合物)范围内的信号传导剂相比，所述结合亲和力至少低约2倍、低约3倍、低约4倍、低约5倍、低约6倍、低约7倍、低约8倍、低约9倍、低至少约10倍、低至少约15倍、低至少约20倍、低至少约25倍、低至少约30倍、低至少约35倍、低至少约40倍、低至少约45倍、低至少约50倍、低至少约100倍、低至少约150倍，或低约10-50倍、低约50-100倍、低约100-150倍、低约150-200倍或低超过200倍。
在各个实施方案中，所述嵌合体或融合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物包含野生型信号传导剂，诸如与未融合至Fc的信号传导剂或不在复合物(例如但不限于异源二聚体复合物)范围内的信号传导剂相比，所述野生型信号传导剂使所述信号传导剂的内源活性降至约75％、或约70％、或约60％、或约50％、或约40％、或约30％、或约25％、或约20％、或约10％、或约5％、或约3％、或约1％。
在一些实施方案中，所述信号传导剂经过修饰以便对其受体中的一者或多者具有降低的亲和力或活性，从而允许减弱活性(包括激动或拮抗)和/或预防嵌合或融合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物的非特异性信号传导或不理想螯合。在一些实施方案中，所述信号传导剂在其野生型形式下具有拮抗性，并且携带一个或多个减弱其拮抗活性的突变。在一些实施方案中，所述信号传导剂由于一个或多个突变而具有拮抗性，例如激动性信号传导剂被转化成拮抗性信号传导剂，并且任选地，这种经过转化的信号传导剂还携带一个或多个减弱其拮抗活性的突变(例如，如WO 2015/007520中所描述，所述文献的全部内容特此以引用方式并入)。
因此，在一些实施方案中，所述信号传导剂是具有一个或多个突变(例如多个突变)的信号传导剂的经修饰(例如突变)形式。在一些实施方案中，所述突变允许经修饰的信号传导剂相对于信号传导剂的未突变，即野生型形式具有一种或多种减弱的活性，诸如降低的结合亲和力、降低的内源活性和降低的特异性生物活性中的一者或多者(例如，比较同一种信号传导剂的野生型形式对比修饰(例如突变)形式)。在一些实施方案中，减弱或降低结合或亲和力的突变包括基本上降低或消除结合或活性的那些突变。在一些实施方案中，减弱或降低结合或亲和力的突变不同于基本上降低或消除结合或活性的那些突变。结果，在一些实施方案中，所述突变允许信号传导剂相对于未突变，即野生型信号传导剂具有提高的安全性，例如，降低的全身毒性、减少的副作用和减少的脱靶效应(例如，比较同一种信号传导剂的野生型形式对比修饰(例如突变)形式)。
如本文所描述，该剂由于一个或多个修饰(例如突变)而可以具有提高的安全性。在一些实施方案中，提高的安全性意指本发明的嵌合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物提供了较低的毒性(例如全身毒性和/或组织/器官相关毒性)；和/或减轻或基本上消除的副作用；和/或增加的耐受性、减轻或基本上消除的不良事件；和/或减少或基本上消除的脱靶效应；和/或增加的治疗窗。
在一些实施方案中，所述信号传导剂经过修饰以具有一个或多个降低其对其受体中的一者或多者的结合亲和力或活性的突变。在一些实施方案中，所述信号传导剂经过修饰以具有一个或多个基本上降低或消除对所述受体的结合亲和力或活性的突变。在一些实施方案中，所述野生型信号传导剂提供的活性是在所述受体处的激动作用(例如，激活治疗部位的细胞效应)。举例来说，所述野生型信号传导剂可以激活其受体。在此类实施方案中，所述突变使得经修饰的信号传导剂在所述受体处的激活活性被降低或消除。举例来说，所述突变可以使得所述经修饰的信号传导剂向靶细胞递送减弱的激活信号，或者可以消除所述激活信号。在一些实施方案中，所述野生型信号传导剂提供的活性是在所述受体处的拮抗作用(例如阻断或阻遏治疗部位的细胞效应)。举例来说，所述野生型信号传导剂可以拮抗或抑制所述受体。在这些实施方案中，所述突变使得所述经修饰的信号传导剂在所述受体处的拮抗活性被降低或消除。举例来说，所述突变可以使得所述经修饰的信号传导剂向靶细胞递送减弱的抑制信号，或者可以消除所述抑制信号。在一些实施方案中，所述信号传导剂由于一个或多个突变而具有拮抗性，例如将激动性信号传导剂转化成拮抗性信号传导剂(例如，如WO 2015/007520中所描述，所述文献的全部内容特此以引用方式并入)，并且任选地，这种经转化的信号传导剂还携带一个或多个降低其对其受体中的一种或多种的结合亲和力或活性，或者基本上降低或消除对其受体中的一种或多种的结合亲和力或活性的突变。
在一些实施方案中，所述受体处降低的亲和力或活性可通过与一个或多个如本文所描述的靶向部分(例如针对FAP的靶向部分)连接或在包含于如本文所公开的基于Fc的嵌合蛋白复合物中后而恢复。在其他实施方案中，所述受体处降低的亲和力或活性基本上不能通过一个或多个靶向部分的活性或在包含于如本文所公开的基于Fc的嵌合蛋白复合物中后而恢复。
在一些实施方案中，本发明技术的嵌合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物减少了脱靶效应，因为它们的信号传导剂具有削弱或消除在受体处的结合亲和力或活性的突变。在一些实施方案中，观察到副作用相对于例如野生型信号传导剂存在这种减少。在一些实施方案中，所述信号传导剂对靶细胞具有活性，因为所述一个或多个靶向部分补偿了实质性激活所需的结合(例如但不限于和/或亲合力)的缺失/不足。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对治疗活性位点的途径基本上无活性，并且其效应基本上针对特异性靶向的细胞类型，从而大大减少了不希望的副作用。
在一些实施方案中，所述信号传导剂可以包括一个或多个减弱或减少对一个受体(即，治疗受体)的结合或亲和力的突变以及一个或多个基本上降低或消除第二受体处的结合或活性的突变。在此类实施方案中，这些突变可以处在相同或不同的位置上(即，相同突变或多个突变)。在一些实施方案中，减少一个受体处的结合和/或活性的一个或多个突变与基本上降低或消除另一个受体处的结合和/或活性的一个或多个突变不同。在一些实施方案中，减少一个受体处的结合和/或活性的一个或多个突变与基本上降低或消除另一个受体处的结合和/或活性的一个或多个突变相同。在一些实施方案中，本发明的嵌合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物具有经修饰的信号传导剂，所述经修饰的信号传导剂兼具减弱治疗受体处的结合和/或活性且因此允许更受控制的中靶治疗效果(例如相对于野生型信号传导剂)的突变与基本上降低或消除另一个受体处的结合和/或活性且因此减少副作用(例如相对于野生型信号传导剂)的突变。
在一些实施方案中，结合或活性的实质性降低或消除基本上不能通过靶向部分(例如，针对FAP的靶向部分或本文所描述的任何其他靶向部分)或在包含于如本文所公开的基于Fc的嵌合蛋白复合物中后而恢复。在一些实施方案中，结合或活性的实质性降低或消除可通过靶向部分或在包含于如本文所公开的基于Fc的嵌合蛋白复合物中后而恢复。在一些实施方案中，基本上降低或消除第二受体处的结合或活性还可以防止另一个受体介导的不利效应。可选地或另外地，基本上降低或消除另一个受体处的结合或活性改善了治疗效果，因为治疗性嵌合蛋白的降低或消除的螯合远离治疗作用位点。举例来说，在一些实施方案中，这就回避了对高剂量的能补偿另一个受体处的损失的本发明的嵌合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物的需要。这种降低剂量的能力还提供了较低的副作用可能性。
在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂包含一个或多个突变，所述一个或多个突变致使所述信号传导剂对其受体中的一者或多者具有降低、基本上降低或消除的亲和力，例如结合(例如KD)和/或激活(例如，当所述经修饰的信号传导剂是其受体的激动剂时，可测量为例如KA和/或EC50)和/或抑制(例如，当所述经修饰的信号传导剂是其受体的拮抗剂时，可测量为例如Ki和/或1050)。在一些实施方案中，免疫调节剂受体处降低的亲和力允许减弱活性(包括激动或拮抗)。在此类实施方案中，相对于野生型信号传导剂，所述经修饰的信号传导剂对受体具有约1％、或约3％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％，或约10％-20％、约20％-40％、约50％、约40％-60％、约60％-80％、约80％-100％的亲和力。在一些实施方案中，相对于所述野生型信号传导剂，所述结合亲和力至少低约2倍、低约3倍、低约4倍、低约5倍、低约6倍、低约7倍、低约8倍、低约9倍、低至少约10倍、低至少约15倍、低至少约20倍、低至少约25倍、低至少约30倍、低至少约35倍、低至少约40倍、低至少约45倍、低至少约50倍、低至少约100倍、低至少约150倍，或低约10-50倍、低约50-100倍、低约100-150倍、低约150-200倍或低超过200倍。
在所述经修饰的信号传导剂具有降低一个受体处的结合且基本上降低或消除第二受体处的结合的突变的实施方案中，经修饰的信号传导剂对一个受体的结合亲和力的减弱或降低程度低于对另一个受体的亲和力的实质性降低或消除。在一些实施方案中，经修饰的信号传导剂对一个受体的结合亲和力的减弱或降低比对另一个受体的亲和力的实质性降低或消除低约1％、或约3％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，实质性降低或消除是指在结合亲和力和/或活性方面存在比减弱或降低更大程度的降低。
在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂包含一个或多个突变，所述一个或多个突变使所述信号传导剂的内源活性例如相对于所述野生型信号传导剂降至约75％、或约70％、或约60％、或约50％、或约40％、或约30％、或约25％、或约20％、或约10％、或约5％、或约3％、或约1％。
在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂包含一个或多个突变，所述一个或多个突变致使所述信号传导剂对其受体具有降低的亲和力，比所述一个或多个靶向部分对其一个或多个受体的结合亲和力更低。在一些实施方案中，这种结合亲和力差异存在于相同细胞上的信号传导剂/受体与靶向部分/受体之间。在一些实施方案中，这种结合亲和力差异允许所述信号传导剂(例如突变的信号传导剂)具有局部化中靶效应并且使构成在野生型信号传导剂情况下观察到的副作用的基础的脱靶效应最小化。在一些实施方案中，这种结合亲和力低至少约2倍、或至少约5倍、或至少约10倍、或至少约15倍、或低至少约25倍、或至少约50倍、或至少约100倍、或至少约150倍。
可以使用本领域中已知的方法来测量受体结合活性。举例来说，可以通过对结合数据进行斯卡查德图分析和计算机拟合(例如Scatchard,1949)或通过如Brecht等人(1993)所描述在流经条件下进行反射干涉光谱法来评定亲和力和/或结合活性，所有文献的全部内容特此以引用方式并入。
在各个实施方案中，所述另外的信号传导剂选自细胞因子、生长因子和激素的野生型或修饰型式。此类细胞因子、生长因子和激素的说明性实例包括但不限于淋巴因子、单核因子、传统多肽激素(诸如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素)；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素诸如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体生成激素(LH)；肝脏生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳激素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子-β；苗勒氏管抑制物；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整合素；促血小板生成素(TPO)；神经生长因子如NGF-α；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)诸如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和胰岛素样生长因子-II；骨诱导因子；干扰素诸如例如干扰素-α、干扰素-β和干扰素-γ(以及I型干扰素、II型干扰素和III型干扰素)、集落刺激因子(CSF)诸如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)，诸如例如IL-1β、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13和IL-18；肿瘤坏死因子诸如例如TNF-α或TNF-β；和其他多肽因子，包括例如LIF和kit配体(KL)。如本文所使用，细胞因子、生长因子和激素包括获自天然来源或者由重组的细菌、真核生物或哺乳动物细胞培养系统产生的蛋白质，以及天然序列细胞因子的生物活性等效物。
在一些实施方案中，所述另外的信号传导剂是选自但不限于转化生长因子(TGF)诸如(TGF-α和TGF-β)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子(诸如胰岛素样生长因子-I和胰岛素样生长因子-II)、成纤维细胞生长因子(FGF)、遗传调节蛋白(heregulin)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)的生长因子的野生型或修饰型式。
在一个实施方案中，所述生长因子是成纤维细胞生长因子(FGF)的野生型或修饰型式。说明性FGF包括但不限于FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、鼠FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22和FGF23。
在一个实施方案中，所述生长因子是转化生长因子(TGF)的野生型或修饰型式。说明性TGF包括但不限于TGF-α和TGF-β及其亚型，包括TGF-β的各种亚型，包括TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3。
在一些实施方案中，所述另外的信号传导剂是选自但不限于以下的激素的野生型或修饰型式：人绒毛膜促性腺激素、促性腺激素释放激素、雄激素、雌激素、促甲状腺激素、促卵泡激素、促黄体生成激素、催乳激素、生长激素、促肾上腺皮质激素、抗利尿激素、催产素、促甲状腺激素释放激素、生长激素释放激素、促肾上腺皮质激素释放激素、生长激素抑制素、多巴胺、褪黑激素、甲状腺素、降血钙素、甲状旁腺激素、糖皮质激素、盐皮质激素、肾上腺素、去甲肾上腺素、黄体酮、胰岛素、升糖素、支链淀粉、钙三醇、钙化醇、心房利钠肽、胃泌素、分泌素、胆囊收缩素、神经肽Y、饥饿素、PYY3-36、胰岛素样生长因子(IGF)、瘦素、促血小板生成素、红细胞生成素(EPO)和血管紧张素原。
在一些实施方案中，所述信号传导剂是免疫调节剂，例如白介素、干扰素和肿瘤坏死因子中的一者或多者。
在一些实施方案中，所述信号传导剂是野生型白介素或经修饰的白介素，包括例如IL-1；IL-1β；IL-2；IL-3；IL-4；IL-5；IL-6；IL-7；IL-8；IL-9；IL-10；IL-11；IL-12；IL-13；IL-14；IL-15；IL-16；IL-17；IL-18；IL-19；IL-20；IL-21；IL-22；IL-23；IL-24；IL-25；IL-26；IL-27；IL-28；IL-29；IL-30；IL-31；IL-32；IL-33；IL-35；IL-36或者它们的片段、变体、类似物或家族成员。白介素是由淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞合成的一组多功能细胞因子。已知的功能包括刺激免疫细胞(例如T辅助细胞、B细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞)的增殖、嗜中性粒细胞和T淋巴细胞的趋化性和/或干扰素的抑制。可以使用本领域中已知的测定法来测定白介素活性：Matthews等人,Lymphokines and Interferons:A PracticalApproach,Clemens等人编辑,IRL Press,Washington,D.C.1987,第221-225页；以及Orencole和Dinarello(1989)Cytokine 1,14-20。
在一些实施方案中，所述信号传导剂是野生型干扰素或干扰素诸如I型干扰素、II型干扰素和III型干扰素的经修饰型式。说明性干扰素包括例如干扰素-a-1、干扰素-a-2、干扰素-a-4、干扰素-a-5、干扰素-a-6、干扰素-a-7、干扰素-a-8、干扰素-a-10、干扰素-a-13、干扰素-a-14、干扰素-a-16、干扰素-a-17和干扰素-a-21、干扰素-β以及干扰素-γ、干扰素κ、干扰素ε、干扰素τ、干扰素δ、IFN-v和干扰素ω。
在一些实施方案中，所述信号传导剂是野生型肿瘤坏死因子(TNF)或者肿瘤坏死因子(TNF)或TNF家族中的蛋白质，包括但不限于TNF-α、TNF-β、LT-β、CD40L、CD27L、CD30L、FASL、4-1BBL、OX40L和TRAIL的经修饰型式。
本文所描述的野生型信号传导剂的氨基酸序列在本领域中是众所周知的。因此，在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂包含与本文所描述的信号传导剂的已知野生型氨基酸序列具有至少约60％、或至少约61％、或至少约62％、或至少约63％、或至少约64％、或至少约65％、或至少约66％、或至少约67％、或至少约68％、或至少约69％、或至少约70％、或至少约71％、或至少约72％、或至少约73％、或至少约74％、或至少约75％、或至少约76％、或至少约77％、或至少约78％、或至少约79％、或至少约80％、或至少约81％、或至少约82％、或至少约83％、至少约84％、或至少约85％、或至少约86％、或至少约87％、或至少约88％、或至少约89％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性(例如约60％、或约61％、或约62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％序列同一性)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂包含与本文所描述的信号传导剂的任何氨基酸序列具有至少约60％、或至少约61％、65％、或至少约66％、70％、或至少约71％、75％、或至少约76％、80％、或至少约81％、85％、或至少约86％、90％、或至少约91％、或至少约62％、或至少约67％、或至少约72％、或至少约77％、或至少约82％、或至少约87％、或至少约92％、或至少约63％、或至少约68％、或至少约73％、或至少约78％、或至少约83％、或至少约88％、或至少约93％、或至少约64％、或至少约69％、或至少约74％、或至少约79％、或至少约84％、或至少约89％、或至少约94％、或至少约或至少约或至少约或至少约或至少约或至少约或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性(例如约60％、或约61％、或约62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％序列同一性)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂包含具有一个或多个氨基酸突变的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸突变可以独立地选自取代、插入、缺失和截短。在一些实施方案中，所述氨基酸突变是氨基酸取代，并且可以包括如本文其他部分所描述的保守和/或非保守取代。在一些实施方案中，所述取代还可以包括如本文其他部分所描述的非经典氨基酸。
如本文所描述，所述经修饰的信号传导剂携带影响一个或多个受体处的亲和力和/或活性的突变。在一些实施方案中，存在对治疗受体，例如通过其介导期望的治疗效果(激动或拮抗)的受体的降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂携带基本上降低或消除在受体，例如通过其不介导期望的治疗效果(例如，由于结合的混杂性的结果)的受体处的亲和力和/或活性的突变。如本文所描述的任何经修饰的信号传导剂的受体，例如细胞因子、生长因子和激素之一都是本领域中已知的。
提供在受体处降低的亲和力和/或活性(例如激动性)的说明性突变见于WO 2013/107791和PCT/EP2017/061544(例如，关于干扰素)、WO 2015/007542(例如，关于白介素)和WO 2015/007903(例如，关于TNF)中，各文献的全部内容特此以引用方式并入。提供在受体处降低的亲和力和/或活性(例如拮抗性)的说明性突变见于WO2015/007520中，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。
在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂包含一个或多个突变，所述一个或多个突变致使所述信号传导剂对I型细胞因子受体、II型细胞因子受体、趋化因子受体、肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族中的受体中、TGF-β受体、免疫球蛋白(Ig)超家族中的受体和/或酪氨酸激酶超家族中的受体具有降低的亲和力和/或活性。
在一些实施方案中，所述信号传导剂的受体是I型细胞因子受体。I型细胞因子受体在本领域中是已知的，并且包括但不限于IL2(β亚单位)、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL9、IL11、IL12、GM-CSF、G-CSF、LIF、CNTF的受体，以及促血小板生成素(TPO)、催乳素和生长激素的受体。说明性I型细胞因子受体包括但不限于GM-CSF受体、G-CSF受体、LIF受体、CNTF受体、TPO受体和I型IL受体。
在一些实施方案中，所述信号传导剂的受体是II型细胞因子受体。II型细胞因子受体是由异源亚单位构成的多聚体受体，并且是主要用于干扰素的受体。此受体家族包括但不限于干扰素-a、干扰素-13和干扰素-y、IL10、IL22和组织因子的受体。说明性II型细胞因子受体包括但不限于IFN-a受体(例如IFNAR1和IFNAR2)、IFN-3受体、IFN-y受体(例如IFNGR1和IFNGR2)和II型IL受体。
在一些实施方案中，所述信号传导剂的受体是G蛋白偶联受体。趋化因子受体是具有七个跨膜结构并与G蛋白偶联以进行信号转导的G蛋白偶联受体。趋化因子受体包括但不限于CC趋化因子受体、CXC趋化因子受体、CX3C趋化因子受体和XC趋化因子受体(XCR1)。说明性趋化因子受体包括但不限于CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCRS、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR3B、CXCR4、CXCRS、CSCR6、CXCR7、XCR1和CX3CR1。
在一些实施方案中，所述信号传导剂的受体是TNFR家族成员。肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族成员共享由围绕CXXCXXC核心基序的三个二硫键形成的富半胱氨酸结构域(CRD)，从而形成细长分子。说明性肿瘤坏死因子受体家族成员包括：CDI 20a(TNFRSFIA)、CD120b(TNFRSFIB)、淋巴毒素β受体(LTBR，TNFRSF3)、CD 134(TNFRSF4)、CD40(CD40，TNFRSFS)、FAS(FAS，TNFRSF6)、TNFRSF6B(TNFRSF6B)、CD27(CD27，TNFRSF7)、CD30(TNFRSF8)、CD137(TNFRSF9)、TNFRSFIOA(TNFRSFIOA)、TNFRSFIOB、(TNFRSFIOB)、TNFRSFIOC(TNFRSFIOC)、TNFRSFIOD(TNFRSFIOD)、RANK(TNFRSFI IA)、骨保护素(TNFRSFI IB)、TNFRSF12A(TNFRSF12A)、TNFRSF13B(TNFRSF13B)、TNFRSF13C(TNFRSF13C)、TNFRSF14(TNFRSF14)、神经生长因子受体(NGFR，TNFRSF16)、TNFRSF17(TNFRSF17)、TNFRSF18(TNFRSF18)、TNFRSF19(TNFRSF19)、TNFRSF21(TNFRSF21)和TNFRSF25(TNFRSF25)。在一个实施方案中，所述TNFR家族成员是CD120a(TNFRSF1A)或TNF-R1。在另一个实施方案中，所述TNFR家族成员是CD 120b(TNFRSFIB)或TNF-R2。
在一些实施方案中，所述信号传导剂的受体是TGF-β受体。TGF-β受体是单程丝氨酸/苏氨酸激酶受体。TGF-β受体包括但不限于TGFBR1、TGFBR2和TGFBR3。
在一些实施方案中，所述信号传导剂的受体是Ig超家族受体。免疫球蛋白(Ig)超家族中的受体与免疫球蛋白享有结构同源性。Ig超家族中的受体包括但不限于白介素-1受体、CSF-1R、PDGFR(例如PDGFRA和PDGFRB)和SCFR。
在一些实施方案中，所述信号传导剂的受体是酪氨酸激酶超家族受体。所述酪氨酸激酶超家族中的受体在本领域中是众所周知的。大约有58种已知的受体酪氨酸激酶(RTK)，分为20个亚家族。所述酪氨酸激酶超家族中的受体包括但不限于FGF受体及其各种同种型，诸如FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4和FGFR5。
在一些实施方案中，所述野生型或经修饰的信号传导剂是干扰素α。在一些实施方案中，所述经修饰的IFN-α剂对IFN-α/β受体(IFNAR)，即IFNAR1和/或IFNAR2链具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的IFN-α剂对IFN-α/β受体(IFNAR)，即IFNAR1和/或IFNAR2链具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的IFN-α剂是经修饰的人IFN-α剂。
干扰素的突变形式对本领域技术人员是已知的。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂是具有氨基酸序列SEQ ID NO:176的等位基因形式IFN-α2a。
作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂是具有氨基酸序列SEQ ID NO:177的等位基因形式IFN-α2b，其与IFN-α2a的不同之处在于氨基酸位置23。
在一些实施方案中，经修饰的IFN-α2信号传导剂是人IFN-α2突变体(IFN-α2a或IFN-α2b)。在一些实施方案中，所述人IFN-α2突变体(IFN-α2a或IFN-α2b)在144-154位的一个或多个氨基酸，例如诸如氨基酸位置148、149和/或153处发生突变。在一些实施方案中，所述人IFN-α2突变体包含一个或多个选自L153A、R149A和M148A的突变。
在一些实施方案中，所述IFN-α2突变体对IFNAR1具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述IFN-α2突变体是人IFN-α2突变体，所述人IFN-α2突变体包含选自如W02010/030671中所描述的F64A、N65A、T69A、L80A、Y85A和Y89A的一个或多个突变，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。
在一些实施方案中，所述IFN-α2突变体是人IFN-α2突变体，所述人IFN-α2突变体包含选自如W02008/124086中所描述的K133A、R144A、R149A和L153A的一个或多个突变，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。
在一些实施方案中，所述IFN-α2突变体是人IFN-α2突变体，所述人IFN-α2突变体包含选自如W02015/007520和W02010/030671中所描述的R120E和R120E/K121E的一个或多个突变，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。
在一些实施方案中，所述IFN-α2突变体拮抗野生型IFN-α2活性。在一些实施方案中，所述突变IFN-α2对IFNAR1具有降低的亲和力和/或活性，而保留对IFNR2的亲和力和/或活性。
在一些实施方案中，人IFN-α2突变体包含(1)一个或多个选自R120E和R120E/K121E的突变，不希望受理论束缚，所述突变能产生拮抗效应；和(2)一个或多个选自K133A、R144A、R149A和L153A的突变，不希望受理论束缚，所述突变允许减弱例如IFNAR2处的效应。在一些实施方案中，所述人IFN-α2突变体包含R120E和L153A。
在一些实施方案中，所述人IFN-α2突变体包含一个或多个突变，所述一个或多个突变选自如WO 2013/059885中所公开的L15A、A19W、R22A、R23A、L26A、F27A、L30A、L30V、K31A、D32A、R33K、R33A、R33Q、H34A、D35A、Q40A、D114R、L117A、R120A、R125A、K134A、R144A、A145G、A145M、M148A、R149A、S152A、L153A和N156A，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。在一些实施方案中，所述人IFN-α2突变体包含如WO 2013/059885中所公开的突变H57Y、E58N、Q61S和/或L30A。在一些实施方案中，所述人IFN-α2突变体包含如WO 2013/059885中所公开的突变H57Y、E58N、Q61S和/或R33A。在一些实施方案中，所述人IFN-α2突变体包含如WO 2013/059885中所公开的突变H57Y、E58N、Q61S和/或M148A。在一些实施方案中，所述人IFN-α2突变体包含如WO 2013/059885中所公开的突变H57Y、E58N、Q61S和/或L153A。在一些实施方案中，所述人IFN-α2突变体包含如WO 2013/059885中所公开的突变N65A、L80A、Y85A和/或Y89A。在一些实施方案中，所述人IFN-α2突变体包含如WO 2013/059885中所公开的突变N65A、L80A、Y85A、Y89A和/或D114A。在一些实施方案中，所述人IFN-α2突变体包含突变R144X1、A145X2和R33A，其中X1选自A、S、T、Y、L和I，并且其中X2选自G、H、Y、K和D。在一些实施方案中，相对于氨基酸序列SEQ ID NO:176或177，所述突变人IFNα2具有一个或多个选自R33A、T106X3、R120E、R144X1A145X2、M148A、R149A和L153A的突变，其中X1选自A、S、T、Y、L和I，其中X2选自G、H、Y、K和D，并且其中X3选自A和E。
在一些实施方案中，所述信号传导剂是野生型干扰素α1或经修饰的干扰素α1。在一些实施方案中，本发明提供了一种嵌合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物，其包含野生型IFNα1。在各个实施方案中，所述野生型IFNα1包含以下氨基酸序列：
CDLPETHSLDNRRTLMLLAQMSRISPSSCLMDRHDFGFPQEEFDGNQFQKAPAISVLHEL
IQQIFNLFTTKDSSAAWDEDLLDKFCTELYQQLNDLEACVMQEERVGETPLMNADSILAV
KKYFRRITLYLTEKKYSPCAWEVVRAEIMRSLSLSTNLQERLRRKE(SEQ ID NO:1042)。
在各个实施方案中，本发明的嵌合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物包含IFNα1的经修饰型式，即IFNα1变体(包括IFNα1突变体)作为信号传导剂。在各个实施方案中，所述IFNα1变体涵盖所述干扰素的突变体、功能性衍生物、类似物、前体、同种型、剪接变体或片段。
在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1042，所述IFNα1干扰素经过修饰以在位置L15、A19、R23、S25、L30、D32、R33、H34、Q40、C86、D115、L118、K121、R126、E133、K134、K135、R145、A146、M149、R150、S153、L154和N157处的一个或多个氨基酸处具有突变。所述突变可任选地是疏水性突变，并且可以例如选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1042，所述IFNα1干扰素经过修饰以具有一个或多个选自以下的突变：L15A、A19W、R23A、S25A、L30A、L30V、D32A、R33K、R33A、R33Q、H34A、Q40A、C86S、C86A、D115R、L118A、K121A、K121E、R126A、R126E、E133A、K134A、K135A、R145A、R145D、R145E、R145G、R145H、R145I、R145K、R145L、R145N、R145Q、R145S、R145T、R145V、R145Y、A146D、A146E、A146G、A146H、A146I、A146K、A146L、A146M、A146N、A146Q、A146R、A146S、A146T、A146V、A146Y、M149A、M149V、R150A、S153A、L154A和N157A。在一些实施方案中，相对于SEQID NO:1042，所述IFNα1突变体包含一个或多个选自以下的突变：L30A/H58Y/E59N_Q62S、R33A/H58Y/E59N/Q62S、M149A/H58Y/E59N/Q62S、L154A/H58Y/E59N/Q62S、R145A/H58Y/E59N/Q62S、D115A/R121A、L118A/R121A、L118A/R121A/K122A、R121A/K122A和R121E/K122E。
在一些实施方案中，IFN-α1是包含一个或多个减少不希望的二硫键配对的突变，其中所述一个或多个突变例如位于SEQ ID NO:1042的氨基酸位置C1、C29、C86、C99或C139。在一些实施方案中，位置C86处的突变可以是例如C86S或C86A或C86Y。IFN-α1的这些C86突变体被称为基于还原半胱氨酸的聚集突变体。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1042，IFNα1变体包括位置C1、C86和C99处的突变。
在一个实施方案中，所述野生型或经修饰的信号传导剂是干扰素β。在此类实施方案中，所述经修饰的干扰素β剂对IFN-α/β受体(IFNAR)，即IFNAR1和/或IFNAR2链具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的干扰素β剂对IFN-α/β受体(IFNAR)，即IFNAR1和/或IFNAR2链具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。
在说明性实施方案中，所述经修饰的信号传导剂是IFN-β。在一些实施方案中，所述IFN-β涵盖IFN-β的功能性衍生物、类似物、前体、同种型、剪接变体或片段。在一些实施方案中，所述IFN-β涵盖来源于任何物种的IFN-β。在一个实施方案中，所述嵌合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物包含小鼠IFN-β的经修饰型式。在另一个实施方案中，所述嵌合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物包含人IFN-β的经修饰型式。人IFN-β是包含166个氨基酸残基的分子量为约22kDa的多肽。人IFN-β的氨基酸序列如SEQ ID NO:178所示。
在一些实施方案中，所述人IFN-β是呈人IFN-β的糖基化形式的IFN-β-la。在一些实施方案中，所述人IFN-β是呈人IFN-β的非糖基化形式的IFN-β-lb，它具有Met-1缺失和Cys-17至Ser突变。
在一些实施方案中，所述经修饰的IFN-β具有一个或多个突变，所述一个或多个突变降低了所述经修饰的IFN-β对IFNAR的IFNAR1亚单位的结合或亲和力。在一些实施方案中，所述经修饰的IFN-β在IFNAR1处具有降低的亲和力和/或活性。
在一些实施方案中，在IFNAR1处具有降低的亲和力和/或活性的经修饰的IFN-β是人IFN-β，并且在位置F67、R71、L88、Y92、195、N96、K123和R124处具有一个或多个突变。在一些实施方案中，所述一个或多个突变是选自F67G、F67S、R71A、L88G、L88S、Y92G、Y92S、195A、N96G、K123G和R124G的取代。在一些实施方案中，所述经修饰的人IFN-β包含F67G突变。在一些实施方案中，所述经修饰的人IFN-β包含K123G突变。在一些实施方案中，所述经修饰的人IFN-β包含F67G和R71A突变。在一些实施方案中，所述经修饰的人IFN-β包含L88G和Y92G突变。在一些实施方案中，所述经修饰的人IFN-β包含Y92G、195A和N96G突变。在一些实施方案中，所述经修饰的人IFN-β包含K123G和R124G突变。在一些实施方案中，所述经修饰的人IFN-β包含F67G、L88G和Y92G突变。在一些实施方案中，所述经修饰的人IFN-β包含F67S、L88S和Y92S突变。
在一些实施方案中，所述经修饰的IFN-β具有一个或多个突变，所述一个或多个突变降低了所述经修饰的IFN-β对IFNAR的IFNAR2亚单位的结合或亲和力。在一些实施方案中，所述经修饰的IFN-β在IFNAR2处具有降低的亲和力和/或活性。
在一些实施方案中，在IFNAR2处具有降低的亲和力和/或活性的经修饰的IFN-β是人IFN-β，并且在位置W22、R27、L32、R35、V148、L151、R152和Y155处具有一个或多个突变。在一些实施方案中，所述一个或多个突变是选自W22G、R27G、L32A、L32G、R35A、R35G、V148G、L151G、R152A、R152G和Y155G的取代。在一些实施方案中，所述经修饰的人IFN-β包含W22G突变。在一些实施方案中，所述经修饰的人IFN-β包含L32A突变。在一些实施方案中，所述经修饰的人IFN-β包含L32G突变。在一些实施方案中，所述经修饰的人IFN-β包含R35A突变。在一些实施方案中，所述经修饰的人IFN-β包含R35G突变。在一些实施方案中，所述经修饰的人IFN-β包含V148G突变。在一些实施方案中，所述经修饰的人IFN-β包含R152A突变。在一些实施方案中，所述经修饰的人IFN-β包含R152G突变。在一些实施方案中，所述经修饰的人IFN-β包含Y155G突变。在一些实施方案中，所述经修饰的人IFN-β包含W22G和R27G突变。在一些实施方案中，所述经修饰的人IFN-β包含L32A和R35A突变。在一些实施方案中，所述经修饰的人IFN-β包含L151G和R152A突变。在一些实施方案中，所述经修饰的人IFN-β包含V148G和R152A突变。
在一些实施方案中，所述经修饰的IFN-β具有以下突变中的一者或多者：R35A、R35T、E42K、M62I、G78S、A141Y、A142T、E149K和R152H。在一些实施方案中，所述经修饰的IFN-β具有以下突变中的一者或多者：R35A、R35T、E42K、M62I、G78S、A141Y、A142T、E149K和R152H，结合C175或MA。
在一些实施方案中，所述经修饰的IFN-β具有以下突变中的一者或多者：R35A、R35T、E42K、M62I、G78S、A141Y、A142T、E149K和R152H，结合本文所描述的任何其他IFN-β突变。
人IFN-β的晶体结构是已知的，并且描述于Karpusas等人,(1998)PNAS,94(22):1181311818中。具体而言，已显示人IFN-β的结构包括五个a螺旋(即A、B、C、D和E)和四个连接这些螺旋的环区(即AB、BC、CD和DE环)。在一些实施方案中，所述经修饰的IFN-β在A、B、C、D、E螺旋和/或AB、BC、CD和DE环中具有一个或多个突变，所述一个或多个突变降低了所述经修饰的IFN-β在治疗受体诸如IFNAR处的结合亲和力或活性。说明性突变描述于WO 2000/023114和US 20150011732中，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。
在一个说明性实施方案中，所述经修饰的IFN-β是在氨基酸位置15、16、18、19、22和/或23处包含丙氨酸取代的人IFN-β。在说明性实施方案中，所述经修饰的IFN-β是在氨基酸位置28-30、32和33处包含丙氨酸取代的人IFN-β。在说明性实施方案中，所述经修饰的IFN-β是在氨基酸位置36、37、39和42处包含丙氨酸取代的人IFN-β。在说明性实施方案中，所述经修饰的IFN-β是人IFN-β，所述人IFN-β在氨基酸位置64和67处包含丙氨酸取代并且在位置68处包含丝氨酸取代。在说明性实施方案中，所述经修饰的IFN-β是在氨基酸位置71-73处包含丙氨酸取代的人IFN-β。在说明性实施方案中，所述经修饰的IFN-β是在氨基酸位置92、96、99和100处包含丙氨酸取代的人IFN-β。在说明性实施方案中，所述经修饰的IFN-β是在氨基酸位置128、130、131和134处包含丙氨酸取代的人IFN-β。在说明性实施方案中，所述经修饰的IFN-β是在氨基酸位置149、153、156和159处包含丙氨酸取代的人IFN-β。在一些实施方案中，所述突变IFN-β包含SEQ ID NO:178和在W22处的突变，所述突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFN-β包含SEQ ID NO:178和在R27处的突变，其中所述突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFN-β包含SEQ ID NO:178和在W22处的突变，其中所述突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基；以及在R27处的突变，所述突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFN-β包含SEQ ID NO:178和在L32处的突变，所述突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFN-β包含SEQ ID NO:178和在R35处的突变，所述突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFN-β包含SEQ ID NO:178和在L32处的突变，所述突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基；以及在R35处的突变，所述突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFN-β包含SEQ ID NO:178和在F67处的突变，所述突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFN-β包含SEQ ID NO:178和在R71处的突变，所述突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFN-β包含SEQ ID NO:178和在F67处的突变，所述突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基；以及在R71处的突变，该突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFN-β包含SEQ ID NO:178和在L88处的突变，所述突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFN-β包含SEQ ID NO:178和在Y92处的突变，所述突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFN-β包含SEQ ID NO:178和在F67处的突变，所述突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基；以及在L88处的突变，所述突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基；以及在Y92处的突变，所述突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFN-β包含SEQ ID NO:178和在L88处的突变，所述突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基；以及在Y92处的突变，所述突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFN-β包含SEQ ID NO:178和在I95处的突变，所述突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基；以及在Y92处的突变，所述突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(1)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFN-β包含SEQ ID NO:178和在N96处的突变，该突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基；以及在Y92处的突变，该突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFN-β包含SEQ ID NO:178和在Y92处的突变，所述突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基；以及在195处的突变，所述突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基；以及在N96处的突变，所述突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFN-β包含SEQ ID NO:178和在K123处的突变，所述突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFN-β包含SEQ ID NO:178和在R124处的突变，所述突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFN-β包含SEQ ID NO:178和在K123处的突变，所述突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基；以及在R124处的突变，所述突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFN-β包含SEQ ID NO:178和在L151处的突变，所述突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFN-β包含SEQ ID NO:178和在R152处的突变，所述突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFN-β包含SEQ ID NO:178和在L151处的突变，所述突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基；以及在R152处的突变，所述突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFN-β包含SEQ ID NO:178和在V148处的突变，所述突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)和甲硫氨酸(M)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFN-β包含SEQ ID NO:178和在V148处的突变，所述突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基；以及在R152处的突变，所述突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，所述突变IFN-β包含SEQ ID NO:178和在Y155处的突变，所述突变是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)的脂族疏水性残基。
在一些实施方案中，本发明技术涉及一种嵌合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物，所述嵌合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物包含：(a)经修饰的IFN-β，所述经修饰的IFN-β具有氨基酸序列SEQ ID NO:178和在位置W22处的突变，其中所述突变是脂族疏水性残基；和(b)一个或多个靶向部分，所述一个或多个靶向部分包含特异性地结合至目标抗原或受体(例如FAP)的识别结构域，所述经修饰的IFN-β和所述一个或多个靶向部分任选地与一个或多个接头连接。在一些实施方案中，在位置W22处的突变是选自G、A、L、I、M和V的脂族疏水性残基。在一些实施方案中，在位置W22处的突变是G。
其他说明性IFN-β突变体提供在PCT/EP2017/061544中，所述文献的全部公开内容以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，所述信号传导剂是野生型或经修饰的干扰素γ。在此类实施方案中，所述经修饰的干扰素γ剂对干扰素γ受体(IFNGR)，即IFNGR1和IFNGR2链具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的干扰素γ剂对干扰素γ受体(IFNGR)，即IFNGR1和IFNGR2链具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。
举例来说，所述突变IFN-γ可以包括突变，作为非限制性实例为截短。在多个实施方案中，所述突变IFN-γ在C端处具有例如约5至约20个氨基酸残基、或约16个氨基酸残基、或约15个氨基酸残基、或约14个氨基酸残基、或约7个氨基酸残基、或约5个氨基酸残基的截短。在多个实施方案中，所述突变IFN-γ在位置Q1、V5、E9、K12、H19、S20、V22、A23、D24、N25、G26、T27、L30、K108、H111、E112、I114、Q115、A118、E119和K125处具有一个或多个突变。在多个实施方案中，所述突变IFN-γ具有具有一个或多个突变，所述一个或多个突变是选自V5E、S20E、V22A、A23G、A23F、D24G、G26Q、H111A、H111D、I114A、Q115A和A118G的取代。在多个实施方案中，所述突变IFN-γ包含V22A突变。在多个实施方案中，所述突变IFN-γ包含A23G突变。在多个实施方案中，所述突变IFN-γ包含D24G突变。在多个实施方案中，所述突变IFN-γ包含H111A突变或H111D突变。在多个实施方案中，所述突变IFN-γ包含I114A突变。在多个实施方案中，所述突变IFN-γ包含Q115A突变。在多个实施方案中，所述突变IFN-γ包含A118G突变。在多个实施方案中，所述突变IFN-γ包含A23G突变和D24G突变。在多个实施方案中，所述突变IFN-γ包含I114A突变和A118G突变。IFN-γ如以下SEQ ID NO:1043所示，并且所有突变均相对于SEQ ID NO:1043而言：
MKYTSYILAFQLCIVLGSLGCYCQDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEESDRKIMQSQIVSFYFKLFKNFKDDQSIQKSVETIKEDMNVKFFNSNKKKRDDFEKLTNYSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAAKTGKRKRSQMLFRGRRASQ(SEQ ID NO:1043)。
在一个实施方案中，所述野生型或经修饰的信号传导剂是共有干扰素。在一些实施方案中，所述共有干扰素包含氨基酸序列SEQ ID NO:179。
在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:179，所述共有干扰素经过修饰以在33和/或145-155位的一个或多个氨基酸(诸如氨基酸位置145、146、149、150和/或154)处具有突变。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:179，所述共有干扰素经过修饰以在33和/或145-155位的一个或多个氨基酸(诸如氨基酸位置145、146、149、150和/或154)处具有突变，所述取代任选地是疏水性的并且选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:179，所述共有干扰素突变体包含选自R33A、R145X1、A146X2、M149A、R150A和L154A的一个或多个突变，其中X1选自A、S、T、Y、L和I，并且其中X2选自G、H、Y、K和D。
在一个实施方案中，相对于SEQ ID NO:179，所述共有干扰素经过修饰以在氨基酸位置121(即，K121)处具有突变。在一个实施方案中，相对于SEQ ID NO:179，所述共有干扰素包含K121E突变。
在一个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂包含如美国专利号4,695,623、4,897,471、5,541,293和8,496,921中所公开的共有干扰素变体，所有这些文献的全部内容特此以引用方式并入。例如，所述共有干扰素变体可以包含如美国专利号4,695,623、4,897,471和5,541,293中所公开的IFN-CON2或IFN-CON3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述野生型或经修饰的信号传导剂是血管内皮生长因子(VEGF)。VEGF是强有力的生长因子，它在生理性和病理性血管生成中起主要作用，调控血管通透性，并且可以充当表达VEGF受体的细胞上的生长因子。除其他功能外，另外的功能还包括刺激巨噬细胞谱系和内皮细胞中的细胞迁移。VEGF生长因子家族中存在若干成员，以及至少三个受体(VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3)。VEGF家族的成员可以结合并激活不止一种VEGFR类型。例如，VEGF-A结合VEGFR-1和VEGFR-2，而VEGF-C结合VEGFR-2和VEGFR-3。VEGFR-1和VEGFR-2激活能调控血管生成，而VEGFR-3激活与淋巴管生成相关联。主要的促血管生成信号是由VEGFR-2激活产生的。据报道，VEGFR-1激活可能与血管生成中的负作用相关联。还已经报道，VEGFR-1信号传导对于经由骨髓来源的VEGFR-1阳性细胞(有助于在骨中形成转移前龛)的体内肿瘤进展是重要的。已经开发了若干种基于VEGF-A指导的/中和的治疗性抗体的疗法，这些疗法主要用于依赖血管生成的各种人类肿瘤的治疗。但这些疗法并非没有副作用。考虑到这些疗法作为一般的非细胞/组织特异性VEGFNEGFR相互作用抑制剂来起作用，这可能不足为奇。因此，将VEGF(例如VEGF-A)/NEGFR-2抑制限制于特定的靶细胞(例如肿瘤血管内皮细胞)是合乎需要的。
在一些实施方案中，所述VEGF是VEGF-A、VEGF-B、VEFG-C、VEGF-D或VEGF-E以及它们的同种型，包括VEGF-A的各种同种型，诸如VEGF121、VEGF121b、VEGF145、VEGF165、VEGF165b、VEGF189和VEGF206。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对VEGFR-1(Flt-1)和/或VEGFR-2(KDR/Flk-1)具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对VEGFR-1(Flt-1)和/或VEGFR-2(KDR/Flk-1)具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。在一个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对VEGFR-2(KDR/Flk-1)具有降低的亲和力和/或活性，并且/或者对VEGFR-1(Flt-1)具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。这样的实施方案可用于例如伤口愈合方法或与缺血相关的疾病(不希望受理论束缚，这些疾病受VEGFR-2对内皮细胞功能和血管生成的影响介导)的治疗中。在一些实施方案中，避免了结合至与癌症和促炎活性相关的VEGFR-1(Flt-1)。在一些实施方案中，VEGFR-1(Flt-1)充当诱饵受体，因此大幅降低或消除了在该受体处的亲和力，从而避免了治疗剂的螯合。在一个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对VEGFR-1(Flt-1)具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性，并且/或者对VEGFR-2(KDR/Flk-1)具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述VEGF是VEGF-C或VEGF-D。在此类实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对VEGFR-3具有降低的亲和力和/或活性。或者，所述经修饰的信号传导剂对VEGFR-3具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。
促血管生成疗法在各种疾病(例如缺血性心脏病、出血等)中也很重要，并且包括基于VEGF的疗法。VEGFR-2的激活具有促血管生成作用(作用于内皮细胞)。VEFGR-1的激活能刺激炎性细胞(包括例如巨噬细胞)迁移并导致炎症相关的高血管通透性。VEFGR-1的激活还可以促进骨髓相关的肿瘤龛形成。因此，在这种情况下，选择用于VEGFR-2激活的基于VEGF的治疗剂将是合乎需要的。另外，期望细胞特异性靶向例如内皮细胞。
在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对VEGFR-2具有降低的亲和力和/或活性(例如拮抗性)，并且/或者对VEGFR-1具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。举例来说，当经由与肿瘤内皮细胞标记物(例如PSMA等)结合的靶向部分靶向肿瘤血管内皮细胞时，这种构建体会特异性地抑制此类标记物阳性细胞上的VEGFR-2激活，而不会激活在途中和靶细胞上的VEGFR-1(如果活性被消除)，由此消除了对炎症反应的诱导。相较于VEGF-A中和疗法，这将为许多肿瘤类型提供更具选择性且更安全的抗血管生成疗法。
在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对VEGFR-2具有降低的亲和力和/或活性(例如激动性)，并且/或者对VEGFR-1具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，通过靶向血管内皮细胞，这样的构建体促进血管生成而不引起VEGFR-1相关的炎症反应诱导。因此，这样的构建体将具有靶向的促血管生成效应，并且基本上降低了由VEGFR-2以及VEGFR-1的全身性激活所引起的副作用的风险。
在一个说明性实施方案中，所述野生型或经修饰的信号传导剂是VEGF165(野生型)，所述VEGF165具有氨基酸序列SEQ ID NO:180。
在另一个说明性实施方案中，所述野生型或经修饰的信号传导剂是VEGF165b(野生型)，所述VEGF165b具有氨基酸序列SEQ ID NO:181。
在这些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂在氨基酸183处具有突变(例如，在183处的取代突变，例如183K、183R或183H)。不希望受理论束缚，据信此类突变可导致降低的受体结合亲和力。参见，例如，美国专利号9,078,860，所述专利的全部内容特此以引用方式并入。
在一个实施方案中，所述野生型或经修饰的信号传导剂是TNF-α。TNF是一种多效性细胞因子，它有许多种不同的功能，包括调控细胞生长、分化、细胞凋亡、肿瘤发生、病毒复制、自身免疫性、免疫细胞功能和迁移、炎症以及败血性休克。它结合至靶细胞上的两种独特的膜受体：TNFR1(p55)和TNFR2(p75)。TNFR1表现出非常广泛的表达模式，而TNFR2优先表达在淋巴细胞、Treg、内皮细胞、某些神经元、小胶质细胞、心肌细胞和间质干细胞的某些群体上。响应于受体激活而激活非常独特的生物学途径，但也存在一定的重叠。通常，不希望受理论束缚，TNFR1信号传导与细胞凋亡(细胞死亡)的诱导相关，而TNFR2信号传导与细胞存活信号的激活(例如，NFκB途径的激活)相关。
TNF的施用具有全身毒性，并且这主要是由于TNFR1配接。然而，应当注意，TNFR2的激活还与多种活性相关，同TNFR1一样，在开发基于TNF的治疗剂的情形下，对TNF靶向和活性的控制非常重要。
在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对TNFR1和/或TNFR2具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对TNFR1和/或TNFR2具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。TNFR1表达于大部分组织中，并且参与细胞死亡信号传导，而相形之下，TNFR2参与细胞存活信号传导。因此，在针对癌症治疗方法的实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对TNFR1具有降低的亲和力和/或活性并且/或者对TNFR2具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。在这些实施方案中，可以使所述嵌合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物靶向需要细胞凋亡的细胞，例如肿瘤细胞或肿瘤血管内皮细胞。在针对促进细胞存活的方法的实施方案中，举例来说，在用于治疗神经退行性病症的神经发生中，所述经修饰的信号传导剂对TNFR2具有降低的亲和力和/或活性并且/或者对TNFR1具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。换句话说，在一些实施方案中，本发明的嵌合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物包含允许有利于死亡或存活信号的经修饰的TNF-a剂。
在一些实施方案中，所述嵌合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物具有经修饰的TNF，所述经修饰的TNF对TNFR1具有降低的亲和力和/或活性并且/或者对TNFR2具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，与野生型TNF和/或仅携带促使对TNFR1具有降低的亲和力和/或活性的一个或多个突变的嵌合体或基于Fc的嵌合蛋白复合物相比，这种嵌合体或基于Fc的嵌合蛋白复合物是更有效的细胞凋亡诱导剂。在一些实施方案中，这种嵌合体或基于Fc的嵌合蛋白复合物可以用于诱导肿瘤细胞死亡或肿瘤血管内皮细胞死亡(例如，用于治疗癌症)。此外，在一些实施方案中，举例来说，这些嵌合体或基于Fc的嵌合蛋白复合物避免或减少经由TNFR2激活Treg细胞，因此进一步支持TNFR1介导的体内抗肿瘤活性。
在一些实施方案中，所述嵌合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物具有经修饰的TNF，所述经修饰的TNF对TNFR2具有降低的亲和力和/或活性并且/或者对TNFR1具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，这种嵌合体或基于Fc的嵌合蛋白复合物在可能是各种疾病设定，包括但不限于刺激神经发生下的特定治疗目标的一些细胞类型中是更有效的细胞存活激活剂。另外，此类偏好TNFR2的嵌合体或基于Fc的嵌合蛋白复合物还可以用于治疗自身免疫性疾病(例如克罗恩氏病、糖尿病、MS、结肠炎等和本文所描述的众多其他自身免疫性疾病)。在一些实施方案中，所述嵌合体或基于Fc的嵌合蛋白复合物靶向自身反应性T细胞。在一些实施方案中，所述嵌合体或基于Fc的嵌合蛋白复合物促进了Treg细胞激活和对细胞毒性T细胞的间接阻抑。
在一些实施方案中，所述嵌合体或基于Fc的嵌合蛋白复合物例如通过激活TNFR2和/或避免TNFR1而引起自身反应性T细胞的死亡(例如，对TNFR2具有降低的亲和力和/或活性并且/或者对TNFR1具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性的经修饰的TNF)。不希望受理论束缚，这些自身反应性T细胞让其细胞凋亡/存活信号例如被NFκB途径活性/信号传导变化改变。在一些实施方案中，所述嵌合体或基于Fc的嵌合蛋白复合物引起具有NFκB途径损伤或经修饰的自身反应性T细胞的死亡，所述损伤或修饰构成所述自身反应性T细胞的细胞死亡(细胞凋亡)/存活信号性质不平衡的基础，并且任选地改变了对某些诱导死亡的信号(例如，TNFR2激活)的易感性。
在一些实施方案中，基于TNFR2的嵌合体或基于Fc的嵌合蛋白复合物在诸多疾病中具有额外的治疗应用，所述疾病包括各种自身免疫性疾病、心脏病、脱髓鞘和神经退行性病症，以及感染性疾病等等。
在一个实施方案中，所述野生型TNF-α具有氨基酸序列SEQ ID NO:182。
在此类实施方案中，所述经修饰的TNF-α剂在一个或多个氨基酸位置29、31、32、84、85、86、87、88、89、145、146和147处具有突变，从而产生了具有降低的受体结合亲和力的经修饰的TNF-α。参见，例如，美国专利号7,993,636，所述专利的全部内容特此以引用方式并入。
在一些实施方案中，所述经修饰的人TNF-α部分在如例如WO/2015/007903中所描述的一个或多个氨基酸位置R32、N34、Q67、H73、L75、T77、S86、Y87、V91、I97、T105、P106、A109、P113、Y115、E127、N137、D143、A145和E146处具有突变，所述文献的全部内容特此以引用方式并入(编号根据人TNF序列，Genbank登记号BAG70306，版本BAG70306.1，GI:197692685)。在一些实施方案中，所述经修饰的人TNF-α部分具有选自L29S、R32G、R32W、N34G、Q67G、H73G、L75G、L75A、L75S、T77A、S86G、S86T、Y87Q、Y87L、Y87A、Y87F、Y87H、V91G、V91A、197A、197Q、197S、T105G、P106G、A109Y、P113G、Y115G、Y115A、E127G、N137G、D143N、A145G、A145R、A145T、E146D、E146K和S147D的取代突变。在一个实施方案中，所述人TNF-α部分具有选自Y87Q、Y87L、Y87A、Y87F和Y87H的突变。在另一个实施方案中，所述人TNF-α部分具有选自197A、197Q和197S的突变。在另一个实施方案中，所述人TNF-α部分具有选自Y115A和Y115G的突变。在一个实施方案中，所述人TNF-α部分具有E146K突变。在一个实施方案中，所述人TNF-α部分具有Y87H和E146K突变。在一个实施方案中，所述人TNF-α部分具有Y87H和A145R突变。在一个实施方案中，所述人TNF-α部分具有R32W和S86T突变。在一个实施方案中，所述人TNF-α部分具有R32W和E146K突变。在一个实施方案中，所述人TNF-α部分具有L29S和R32W突变。在一个实施方案中，所述人TNF-α部分具有D143N和A145R突变。在一个实施方案中，所述人TNF-α部分具有D143N和A145R突变。在一个实施方案中，所述人TNF-α部分具有A145T、E146D和S147D突变。在一个实施方案中，所述人TNF-α部分具有A145T和S147D突变。
在一些实施方案中，所述经修饰的TNF-α剂具有选自如WO 2008/124086中所描述的N39Y、S147Y和Y87H的一个或多个突变，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。
在一些实施方案中，所述经修饰的人TNF-α部分具有如PCT/IB2016/001668中所描述的提供受体选择性的突变，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。在一些实施方案中，TNF突变是TNF-R1选择性的。在一些实施方案中，TNF-R1选择性的TNF突变处在位置R32、S86和E146中的一者或多者处。在一些实施方案中，TNF-R1选择性的TNF突变是R32W、S86T和E146K中的一者或多者。在一些实施方案中，TNF-R1选择性的TNF突变是R32W、R32W/S86T、R32W/E146K和E146K中的一者或多者。在一些实施方案中，TNF突变是TNF-R2选择性的。在一些实施方案中，TNF-R2选择性的TNF突变处在位置A145、E146和S147中的一者或多者处。在一些实施方案中，TNF-R2选择性的TNF突变是A145T、A145R、E146D和S147D中的一者或多者。在一些实施方案中，TNF-R2选择性的TNF突变在A145R、A145T/S147D和A145T/E146D/S147D中的一者或多者。
在一些实施方案中，所述野生型或经修饰的信号传导剂是TNF-β。TNF-β与LT-β(LT-α1β2)形成同源三聚体或异源三聚体。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对TNFR1和/或TNFR2和/或疱疹病毒进入介体(HEVM)和/或LT-βR具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。
在一个实施方案中，所述野生型TNF-β具有氨基酸序列SEQ ID NO:183。
在此类实施方案中，所述经修饰的可溶性剂可以在106-113位的一个或多个氨基酸处包含突变，从而产生对TNFR2具有降低的受体结合亲和力的经修饰的TNF-β。在一个实施方案中，所述经修饰的可溶性剂在氨基酸位置106-113处具有一个或多个取代突变。在一些实施方案中，所述取代突变选自Q107E、Q107D、S106E、S106D、Q107R、Q107N、Q107E/S106E、Q107E/S106D、Q107D/S106E和Q107D/S106D。在另一个实施方案中，所述经修饰的可溶性剂在位置106-113处具有约1至约3个氨基酸的插入。
在一些实施方案中，所述经修饰的剂是TNF家族成员(例如TNF-α、TNF-β)，它可以是如WO 2015/007903中所描述的单链三聚体型式，所述文献的全部内容以引用的方式并入。
在一些实施方案中，所述经修饰的剂是TNF家族成员(例如TNF-α、TNF-β)，它在TNFR1处具有降低的亲和力和/或活性，即拮抗活性(例如天然拮抗活性或者由于一个或多个突变所致的拮抗活性，参见例如WO 2015/007520，所述文献的全部内容特此以引用方式并入)。在这些实施方案中，所述经修饰的剂是TNF家族成员(例如TNF-α、TNF-β)，它还任选地对TNFR2具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的剂是TNF家族成员(例如TNF-α、TNF-β)，它在TNFR2处具有降低的亲和力和/或活性，即拮抗活性(例如天然拮抗活性或者由于一个或多个突变所致的拮抗活性，参见例如WO 2015/007520，所述文献的全部内容特此以引用方式并入)。在这些实施方案中，所述经修饰的剂是TNF家族成员(例如TNF-α、TNF-β)，它还任选地对TNFR1具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。此类实施方案的构建体可用于例如以细胞特异性方式阻遏TNF应答的方法中。在一些实施方案中，所述拮抗性TNF家族成员(例如TNF-α、TNF-β)是如WO 2015/007903中所描述的单链三聚体型式。
在一些实施方案中，所述野生型或经修饰的信号传导剂是TRAIL。在一些实施方案中，所述经修饰的TRAIL剂对DR4(TRAIL-RI)和/或DR5(TRAIL-RII)和/或DcR1和/或DcR2具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的TRAIL剂对DR4(TRAIL-RI)和/或DR5(TRAIL-RII)和/或DcR1和/或DcR2具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。
在一个实施方案中，所述野生型TRAIL具有氨基酸序列SEQ ID NO:184。
在此类实施方案中，所述经修饰的TRAIL剂可以在氨基酸位置T127-R132、E144-R149、E155-H161、Y189-Y209、T214-1220、K224-A226、W231、E236-L239、E249-K251、T261-H264和H270-E271处包含突变(编号根据人序列，Genbank登记号NP_003801，版本10NP_003801.1，GI：4507593；参见上文)。
在一些实施方案中，所述经修饰的TRAIL剂可以包含一个或多个突变，所述一个或多个突变基本上降低了所述经修饰的TRAIL剂对TRAIL-R1的亲和力和/或活性。在此类实施方案中，所述经修饰的TRAIL剂可以特异性地结合TRIL-R2。说明性突变包括在一个或多个氨基酸位置Y189、R191、Q193、H264、1266和D267处的突变。举例来说，所述突变可以是Y189Q、R191K、Q193R、H264R、1266L和D267Q中的一者或多者。在一个实施方案中，所述经修饰的TRAIL剂包含突变Y189Q、R191K、Q193R、H264R、1266L和D267Q。
在一些实施方案中，所述经修饰的TRAIL剂可以包含一个或多个突变，所述一个或多个突变基本上降低了所述经修饰的TRAIL剂对TRAIL-R2的亲和力和/或活性。在此类实施方案中，所述经修饰的TRAIL剂可以特异性地结合TRIL-R1。说明性突变包括在一个或多个氨基酸位置G131、R149、S159、N199、K201和S215处的突变。举例来说，所述突变可以是G131R、R1491、S159R、N199R、K201H和S215D中的一者或多者。在一个实施方案中，所述经修饰的TRAIL剂包含突变G131R、R1491、S159R、N199R、K201H和S215D。另外的TRAIL突变描述于例如Trebing等人,(2014)Cell Death and Disease,5:e1035，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。
在一些实施方案中，所述野生型或经修饰的信号传导剂是TGFα。在此类实施方案中，所述经修饰的TGFα剂对表皮生长因子受体(EGFR)具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的TGFα剂对表皮生长因子受体(EGFR)具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。
在一些实施方案中，所述野生型或经修饰的信号传导剂是TGFβ。在此类实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对TGFBR1和/或TGFBR2具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对TGFBR1和/或TGFBR2具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂任选地对TGFBR3具有降低或基本上降低或消除的亲和力和/或活性，不希望受理论束缚，所述TGFBR3可以充当TGF-β受体的配体的储库。在一些实施方案中，相对于TGFBR2，TGFβ更倾向于TGFBR1，或者相对于TGFBR1，TGFβ更倾向于TGFBR2。相似地，不希望受理论束缚，LAP可以充当TGF-β受体的配体的储库。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对TGFBR1和/或TGFBR2具有降低的亲和力和/或活性，并且/或者对潜在型相关肽(LAP)具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，此类嵌合体或基于Fc的嵌合蛋白复合物可以用于卡-恩二氏病(Camurati-Engelmann disease)或与不适当的TGFβ信号传导相关的其他疾病。
在一些实施方案中，所述经修饰的剂是TGF家族成员(例如TGFα、TGFβ)，它在TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3中的一者或多者处具有降低的亲和力和/或活性，即拮抗活性(例如天然拮抗活性或者由一个或多个突变所致的拮抗活性，参见例如WO 2015/007520，所述文献的全部内容特此以引用方式并入本文)。在这些实施方案中，所述经修饰的剂是TGF家族成员(例如TGFα、TGFβ)，它还任选地在TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3中的一者或多者处具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。
在一些实施方案中，所述经修饰的剂是TGF家族成员(例如TGFα、TGFβ)，它在TGFBR1和/或TGFBR2处具有降低的亲和力和/或活性，即拮抗活性(例如天然拮抗活性或者由一个或多个突变所致的拮抗活性，参见例如WO 2015/007520，所述文献的全部内容特此以引用方式并入本文)。在这些实施方案中，所述经修饰的剂是TGF家族成员(例如TGFα、TGFβ)，它还任选地在TGFBR3处具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。
在一些实施方案中，所述野生型或经修饰的信号传导剂是白介素。在一个实施方案中，所述野生型或经修饰的信号传导剂是IL-1。在一些实施方案中，所述野生型或经修饰的信号传导剂是IL-1α或IL-1β。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IL-1R1和/或IL-1RAcP具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IL-1R1和/或IL-1RAcP具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。
在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IL-1R2具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IL-1R2具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。举例来说，在一些实施方案中，本发明的经修饰的IL-1β剂避免IL-1R2处的相互作用，并且因此基本上降低其作为治疗剂的引诱剂和/或接收剂的功能。
在一个实施方案中，所述野生型IL-1β具有氨基酸序列SEQ ID NO:185。
IL-1β是促炎性细胞因子和重要的免疫系统调控剂。它是CD4 T细胞应答的有效激活剂，能增加Th17细胞的比例以及产生IFNγ和IL-4的细胞的扩增。IL-1β还是CD8+T细胞的有效调控剂，从而增强抗原特异性CD8+T细胞扩增、分化、移行至外围和记忆。IL-1β受体包含IL-1R1和IL-1R2。结合至IL-1R1和经由IL-1R1进行信号传导构成了IL-1借以介导许多种其生物学(和病理学)活性的机制。IL1-R2可以起诱饵受体的作用，从而降低IL-1用于相互作用和经由IL-1R1进行信号传导的可用性。
在一些实施方案中，所述经修饰的IL-1β对IL-1R1具有降低的亲和力和/或活性(例如激动活性)。在一些实施方案中，所述经修饰的IL-1对IL-1R2具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。在此类实施方案中，存在可诱导的或可恢复的IL-1β/IL-1R1信号传导，并且防止了IL-R2处治疗性嵌合体的损失，并且因此减少了所需IL-1β的剂量(例如，相对于野生型或仅携带针对IL-R1的减毒突变的嵌合体)。此类构建体可用于例如治疗癌症，包括例如刺激免疫系统以建立抗癌应答的方法中。
在一些实施方案中，所述经修饰的IL-1β对IL-1R1具有降低的亲和力和/或活性(例如拮抗活性，例如天然拮抗活性或者由于一个或多个突变所致的拮抗活性，参见例如WO2015/007520，所述文献的全部内容特此以引用方式并入)。在一些实施方案中，所述经修饰的IL-1β对IL-1R2具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。在此类实施方案中，存在不可恢复的IL-1β/IL-1R1信号传导，并且防止了IL-R2处治疗性嵌合体的损失，并且因此减少了所需IL-1β的剂量(例如，相对于野生型或仅携带针对IL-R1的减毒突变的嵌合体)。此类构建体可用于例如治疗自身免疫性疾病，包括例如阻抑免疫系统的方法中。
在此类实施方案中，所述经修饰的信号传导剂具有氨基酸52-54缺失，这就产生了对I型IL-1R具有降低的结合亲和力并且具有降低的生物活性的经修饰的人IL-1β。参见例如WO 1994/000491，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。在一些实施方案中，所述经修饰的人IL-1β具有选自A117G/P118G、R120X、L122A、T125G/L126G、R127G、Q130X、Q131G、K132A、S137G/Q138Y、L145G、H146X、L145A/L147A、Q148X、Q148G/Q150G、Q150G/D151A、M152G、F162A、F162A/Q164E、F166A、Q164E/E167K、N169G/D170G、I172A、V174A、K208E、K209X、K209A/K210A、K219X、E221X、E221S/N224A、N224S/K225S、E244K、N245Q的一个或多个取代突变(其中X可以是任何氨基酸变化，例如非保守变化)，从而表现出降低的与IL-1R的结合，如例如WO 2015/007542和WO/2015/007536中所描述，所述文献的全部内容特此以引用方式并入(编号基于人IL-1β序列，Genbank登记号NP_000567，版本NP-000567.1，GI：10835145)。在一些实施方案中，所述经修饰的人IL-1β可以具有选自R120A、R120G、Q130A、Q130W、H146A、H146G、H146E、H146N、H146R、Q148E、Q148G、Q148L、K209A、K209D、K219S、K219Q、E221S和E221K的一个或多个突变。在一个实施方案中，所述经修饰的人IL-1β包含突变Q131G和Q148G。在一个实施方案中，所述经修饰的人IL-1β包含突变Q148G和K208E。在一个实施方案中，所述经修饰的人IL-1β包含突变R120G和Q131G。在一个实施方案中，所述经修饰的人IL-1β包含突变R120G和H146A。在一个实施方案中，所述经修饰的人IL-1β包含突变R120G和H146N。在一个实施方案中，所述经修饰的人IL-1β包含突变R120G和H146R。在一个实施方案中，所述经修饰的人IL-1β包含突变R120G和H146E。在一个实施方案中，所述经修饰的人IL-1β包含突变R120G和H146G。在一个实施方案中，所述经修饰的人IL-1β包含突变R120G和K208E。在一个实施方案中，所述经修饰的人IL-1β包含突变R120G、F162A和Q164E。
在一些实施方案中，所述野生型或经修饰的信号传导剂是IL-2。在此类实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IL-2Rα和/或IL-2Rβ和/或IL-2Rγ具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IL-2Rβ和/或IL-2Rγ具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IL-2Rα具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。此类实施方案可能有关于癌症的治疗，例如当所述经修饰的IL-2在IL-2Rβ和/或IL-2Rγ处具有激动性时。举例来说，本发明的构建体可能有利于减弱具有IL2受体β和γ的CD8+T细胞的激活(这可以提供抗肿瘤效应)，而不利于具有IL2受体α、β和γ的Treg(这可以提供免疫阻抑、促肿瘤效应)。此外，在一些实施方案中，偏好IL-2Rβ和/或IL-2Rγ超过IL-2Rα避免了诸多IL-2副作用，诸如肺水肿。而且，基于IL-2的嵌合体或基于Fc的嵌合蛋白复合物可以用于治疗自身免疫性疾病，例如当所述经修饰的IL-2在IL-2Rβ和/或IL-2Rγ处具有拮抗性(例如天然拮抗活性或者由于一个或多个突变所致的拮抗活性，参见例如WO 2015/007520，所述文献的全部内容特此以引用方式并入)时。举例来说，本发明的构建体可能有利于减弱对具有IL2受体β和γ的CD8+T细胞的抑制(并且因此阻遏免疫应答)，而不利于具有IL2受体α、β和γ的Treg。或者，在一些实施方案中，携带IL-2的嵌合体或基于Fc的嵌合蛋白复合物有利于Treg的激活，并且因此有利于免疫阻抑，而不利于CD8+T细胞的激活。举例来说，这些构建体可用于治疗疾病或将受益于免疫阻抑的疾病，例如自身免疫性疾病。
在一些实施方案中，所述嵌合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物具有如本文所描述的针对FAP+树突状细胞的靶向部分以及对IL-2Rβ和/或IL-2Rγ具有降低的亲和力和/或活性并且/或者对IL-2Rα具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性的经修饰的IL-2剂。在一些实施方案中，这些构建体提供靶向性FAP+树突状细胞活性，并且一般对Treg细胞无活性(或具有基本上降低的活性)。在一些实施方案中，此类构建体与野生型IL-2相比具有增强的免疫刺激效应(例如，不希望受理论束缚，通过不刺激Treg)，同时消除或降低了与IL-2相关的全身毒性。
在一些实施方案中，所述野生型IL-2具有氨基酸序列SEQ ID NO:186。
在此类实施方案中，所述经修饰的IL-2剂在氨基酸L72(L72G、L72A、L725、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72D、L72R或L72K)、F42(F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R或F42K)和Y45(Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R或Y45K)处具有一个或多个突变。不希望受理论束缚，认为与所述野生型IL-2相比，这些经修饰的IL-2剂对高亲和力IL-2受体具有降低的亲和力并且保留对中亲和力IL-2受体的亲和力。参见例如美国专利公布号2012/0244112，所述美国专利公布的全部内容特此以引用方式并入。
在一些实施方案中，所述经修饰的IL-2剂在氨基酸R38、F42、Y45和E62处具有一个或多个突变。举例来说，所述经修饰的IL-2剂可以包含R38A、F42A、Y45A和E62A中的一者或多者。在一些实施方案中，所述经修饰的IL-2剂可以在C125处包含突变。举例来说，所述突变可以是C125S。在此类实施方案中，所述经修饰的IL-2剂可以对IL-2Rα具有基本上降低的亲和力和/或活性，如例如在Carmenate等人(2013)The Journal of Immunology,190:6230-6238中所描述，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。在一些实施方案中，在R38、F42、Y45和/或E62处具有突变的所述经修饰的IL-2剂能够诱导效应细胞的扩增，所述效应细胞包括CD8+T细胞和NK细胞而不是Treg细胞。在一些实施方案中，在R38、F42、Y45和/或E62处具有突变的所述经修饰的IL-2剂相比野生型IL-2剂毒性更低。包含对IL-2Rα具有基本上降低的亲和力和/或活性的所述经修饰的IL-2剂的嵌合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物可以用于例如肿瘤学中。
在其他实施方案中，所述经修饰的IL-2剂可以对IL-2Rβ具有基本上降低的亲和力和/或活性，如在例如WO 2016/025385中所描述，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。在此类实施方案中，所述经修饰的IL-2剂可以诱导Treg细胞而不是效应细胞(诸如CD8+T细胞和NK细胞)的扩增。包含对IL-2Rβ具有基本上降低的亲和力和/或活性的所述经修饰的IL-2剂的嵌合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物可以例如用于治疗自身免疫性疾病中。在一些实施方案中，所述经修饰的IL-2剂可以在氨基酸N88、D20和/或A126处包含一个或多个突变。举例来说，所述经修饰的IL-2剂可以包含N88R、N881、N88G、D20H、Q126L和Q126F中的一者或多者。
在一些实施方案中，所述经修饰的IL-2剂可以在D109或C125处包含突变。举例来说，所述突变可以是D109C或C125S。在一些实施方案中，可以将在D109或C125处具有突变的经修饰的IL-2用于连接至PEG部分。
在一些实施方案中，所述野生型或经修饰的信号传导剂是IL-3。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IL-3受体具有降低的亲和力和/或活性，所述IL-3受体是与跟普通β(βc或CD131)亚单位配对的独特α链的异源二聚体。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IL-3受体具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性，所述IL-3受体是与跟普通β(βc或CD131)亚单位配对的独特α链的异源二聚体。
在一些实施方案中，所述野生型或经修饰的信号传导剂是IL-4。在此类实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对1型和/或2型IL-4受体具有降低的亲和力和/或活性。在此类实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对1型和/或2型IL-4受体具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。1型IL-4受体由具有普通γ链的IL-4Rα亚单位构成并且特异性地结合IL-4。2型IL-4受体包括与被称为IL-13Rα1的不同亚单位结合的IL-4Rα亚单位。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对2型IL-4受体具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。
在一些实施方案中，所述野生型IL-4具有氨基酸序列SEQ ID NO:187。
在此类实施方案中，所述经修饰的IL-4剂在氨基酸R121(R121A、R121D、R121E、R121F、R121H、R121I、R121K、R121N、R121P、R121T、R121W)、E122(E122F)、Y124(Y124A、Y124Q、Y124R、Y124S、Y124T)和S125(S125A)处具有一个或多个突变。不希望受理论束缚，认为这些经修饰的IL-4剂维持I型受体介导的活性，但是显著降低了其他受体介导的生物活性。参见例如美国专利号6,433,157，所述专利的全部内容特此以引用方式并入。
在一些实施方案中，所述野生型或经修饰的信号传导剂是IL-6。IL-6通过细胞表面I型细胞因子受体复合物进行信号传导，所述复合物包括配体结合IL-6R链(CD126)和信号转导组分gp130。IL-6还可以结合至IL-6R的可溶形式(sIL-6R)，后者是IL-6R的细胞外部分。sIL-6R/IL-6复合物可能参与神经突长出和神经元存活，并且因此可能在通过髓鞘再生进行的神经再生中非常重要。因此，在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IL-6R/gp130和/或sIL-6R具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IL-6R/gp130和/或sIL-6R具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。
在一些实施方案中，所述野生型IL-6具有氨基酸序列SEQ ID NO:188。
在此类实施方案中，所述经修饰的信号传导剂在氨基酸58、160、163、171或177处具有一个或多个突变。不希望受理论束缚，认为这些经修饰的IL-6剂表现出降低的对IL-6R-α的结合亲和力和降低的生物活性。参见例如WO 97/10338，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。
在一些实施方案中，所述野生型或经修饰的信号传导剂是IL-10。在此类实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IL-10受体1和IL-10受体2具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IL-10受体1和IL-10受体2具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。
在一些实施方案中，所述野生型或经修饰的信号传导剂是IL-11。在这种实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IL-11Rα和/或IL-11Rβ和/或gp130具有降低的亲和力和/或活性。在这种实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IL-11Rα和/或IL-11Rβ和/或gp130具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。
在一些实施方案中，所述野生型或经修饰的信号传导剂是IL-12。在这种实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IL-12Rβ1和/或IL-12Rβ2具有降低的亲和力和/或活性。在这种实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IL-12Rβ1和/或IL-12Rβ2具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。
在一些实施方案中，所述野生型或经修饰的信号传导剂是IL-13。在这种实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IL-4受体(IL-4Rα)和IL-13Rα1具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IL-4受体(IL-4Rα)或IL-13Rα1具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。
在一些实施方案中，所述野生型IL-13具有氨基酸序列SEQ ID NO:189。
在此类实施方案中，所述经修饰的IL-13剂在氨基酸13、16、17、66、69、99、102、104、105、106、107、108、109、112、113和114处具有一个或多个突变。不希望受理论束缚，认为这些经修饰的IL-13剂表现出降低的生物活性。参见例如WO 2002/018422，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。
在一个实施方案中，所述信号传导剂是野生型或经修饰的IL-15。在多个实施方案中，所述经修饰的IL-15对白介素15受体具有降低的亲和力和/或活性。
在一个实施方案中，所述野生型IL-15具有以下氨基酸序列：
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO:1044)。
在此类实施方案中，所述经修饰的IL-15剂相对于SEQ ID NO:1044在氨基酸S7、D8、K10、K11、E46、L47、V49、I50、D61、N65、L66、I67、I68、L69、N72、Q108处具有一个或多个突变。
在一些实施方案中，所述野生型或经修饰的信号传导剂是IL-18。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IL-18Rα和/或IL-18Rβ具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IL-18Rα和/或IL-18Rβ具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对II型IL-18Rα，即缺乏信号传导所需的TIR结构域的IL-18Rα同种型具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。
在一些实施方案中，所述野生型IL-18具有氨基酸序列SEQ ID NO:190。
在此类实施方案中，所述经修饰的IL-18剂可以在选自如WO/2015/007542中所描述的Y37-K44、R49-Q54、D59-R63、E67-C74、R80、M87-A97、N 27-K129、Q139-M149、K165-K171、R183和Q190-N191的氨基酸或氨基酸区域处包含一个或多个突变，所述文献的全部内容特此以引用方式并入(编号基于人IL-18序列，Genbank登记号AAV38697，版本AAV38697.1，GI：54696650)。
在一些实施方案中，所述野生型或经修饰的信号传导剂是IL-33。在这种实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对ST-2受体和IL-1RAcP具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对ST-2受体和IL-1RAcP具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。
在一些实施方案中，所述野生型IL-33具有氨基酸序列SEQ ID NO:191。
在此类实施方案中，所述经修饰的IL-33剂可以在选自如WO/2015/007542中所描述的1113-Y122、5127-E139、E144-D157、Y163-M183、E200、Q215、L220-C227和T260-E269的氨基酸或氨基酸区域处包含一个或多个突变，所述文献的全部内容特此以引用方式并入(编号基于人序列，Genbank登记号NP_254274，版本NP_254274.1，GI：15559209)。
在一些实施方案中，所述野生型或经修饰的信号传导剂是表皮生长因子(EGF)。EGF是有效生长因子家族的成员。成员包括EGF、HB-EGF，以及其他成员，诸如TGFα、双调蛋白、神经调节蛋白、上皮调节蛋白、β细胞蛋白。EGF家族受体包括EGFR(ErbB1)、ErbB2、ErbB3和ErbB4。这些受体可以充当同源二聚体和/或异源二聚体受体亚型。不同的EGF家族成员对各种受体亚型表现出不同的选择性。举例来说，EGF与ErbB1/ErbB1、ErbB1/ErbB2、ErbB4/ErbB2和其他一些异源二聚体亚型相关。HB-EGF具有相似的模式，但它也与ErbB4/4相关。积极或消极地调节EGF(EGF样)生长因子信号传导具有相当大的治疗意义。举例来说，在EGFR信号构成主要的促进生长信号的各种癌症的治疗中，抑制EGFR信号是有意义的。或者，在例如促进伤口愈合(急性和慢性)、口腔粘膜炎(各种癌症疗法，包括但不限于放射疗法的主要副作用)中，刺激EGFR信号传导具有治疗意义。
在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对ErbB1、ErbB2、ErbB3和/或ErbB4具有降低的亲和力和/或活性。此类实施方案可用于例如治疗伤口的方法中。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂结合至一个或多个ErbB1、ErbB2、ErbB3和ErbB4并拮抗这些受体的活性。在此类实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对ErbB1、ErbB2、ErbB3和/或ErbB4具有降低的亲和力和/或活性，这允许以减弱的方式拮抗这些受体的活性。此类实施方案可用于例如癌症的治疗中。在一个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对ErbB1具有降低的亲和力和/或活性。ErbB1是激酶抑制剂的治疗靶标-这些激酶抑制剂大多数具有副作用，因为它们的选择性不高(例如，吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)、阿法替尼(afatinib)、布加替尼(brigatinib)和艾克替尼(icotinib))。在一些实施方案中，与靶向EGF受体的其他药剂相比，减弱的拮抗性ErbB1信号传导更具中靶性并且具有更少的副作用。
在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对ErbB1具有降低的亲和力和/或活性(例如拮抗性，例如天然拮抗活性或者由于一个或多个突变所致的拮抗活性，参见例如WO2015/007520，所述文献的全部内容特此以引用方式并入)并且/或者对ErbB4或可能与其相互作用的其他亚型具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。通过经由靶向部分进行特异性靶向，将实现对ErbB1/ErbB1受体激活的细胞选择性阻抑(拮抗作用，例如天然拮抗活性或者由于一个或多个突变所致的拮抗活性，参见例如WO 2015/007520，所述文献的全部内容特此以引用方式并入)，而不牵涉可能与抑制相关副作用有关的其他受体亚型。因此，与在体内抑制所有细胞类型中的EGFR活性的EGFR激酶抑制剂相比，这种构建体将提供细胞选择性(例如，由于受体扩增、过度表达等原因而具有激活的EGFR信号传导的肿瘤细胞)抗EGFR(ErbB1)药物作用，且副作用减少。
在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对ErbB4和/或可能与其相互作用的其他亚型具有降低的亲和力和/或活性(例如激动性)。通过经由靶向部分靶向特定靶细胞，实现了ErbB1信号传导的选择性激活(例如上皮细胞)。在一些实施方案中，这种构建体可用于治疗伤口(促进愈合)且副作用减少，尤其可用于治疗慢性疾患和治疗剂局部施用以外的应用(例如全身性伤口愈合)。
在一个实施方案中，所述野生型或经修饰的信号传导剂是胰岛素或胰岛素类似物。在一些实施方案中，所述经修饰的胰岛素或胰岛素类似物对胰岛素受体和/或IGF1或IGF2受体具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的胰岛素或胰岛素类似物对胰岛素受体和/或IGF1或IGF2受体具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。胰岛素受体处减弱的应答允许控制糖尿病、肥胖症、代谢紊乱等，而直接远离IGF1或IGF2受体则避免了前癌的影响。
在一个实施方案中，所述野生型或经修饰的信号传导剂是胰岛素样生长因子I或胰岛素样生长因子II(IGF-1或IGF-2)。在一个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂是IGF-1。在这种实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对胰岛素受体和/或IGF1受体具有降低的亲和力和/或活性。在一个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂可以结合至IGF1受体并且拮抗该受体的活性。在这种实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IGF1受体具有降低的亲和力和/或活性，这允许以减弱的方式拮抗该受体的活性。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对胰岛素受体和/或IGF1受体具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对IGF2受体具有降低的亲和力和/或活性，这允许以减弱的方式拮抗该受体的活性。在一个实施方案中，所述经修饰的信号传导剂对胰岛素受体具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性，并且因此不干扰胰岛素信号传导。在一些实施方案中，这适用于癌症治疗。在一些实施方案中，本发明的剂可以防止IR同种型A引起对癌症治疗的抗性。
在一个实施方案中，所述野生型或经修饰的信号传导剂是EPO。在各个实施方案中，所述经修饰的EPO剂相对于本文所描述的基于野生型EPO或其他EPO的剂对EPO受体(EPOR)受体和/或肝配蛋白受体(EphR)具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，所述经修饰的EPO剂对EPO受体(EPOR)受体和/或Eph受体(EphR)具有基本上降低或消除的亲和力和/或活性。说明性EPO受体包括但不限于EPOR同源二聚体或EPOR/CD131异源二聚体。还包括β-共用受体(βcR)作为EPO受体。说明性Eph受体包括但不限于EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHA9、EPHA10、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5和EPHB6。在一些实施方案中，所述经修饰的EPO蛋白包含一个或多个突变，所述一个或多个突变致使所述EPO蛋白对包含一种或多种不同的EPO受体或Eph受体的受体(例如异源二聚体、异源三聚体等，包括但不限于：EPOR-EPHB4、EPOR-βcR-EPOR)具有降低的亲和力。还提供了欧洲专利公布号2492355的受体，包括但不限于NEPOR，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。
预计人EPO蛋白的结构包含四螺旋束，包括螺旋A、螺旋B、螺旋C和螺旋D。在各个实施方案中，所述经修饰的EPO蛋白包含位于EPO蛋白的对生物活性重要的四个区域，即氨基酸残基10-20、44-51、96-108和142-156中的一者或多者突变。在一些实施方案中，所述一个或多个突变位于残基11-15、44-51、100-108和147-151处。这些残基局限于螺旋A (Val11、Arg14和Tyr15)、螺旋C(Ser100、Arg103、Ser104和Leu108)、螺旋D(Asn147、Arg150、Gly151和Leu155)以及A/B连接环(残基42-51)。在一些实施方案中，所述经修饰的EPO蛋白在氨基酸41-52之间以及氨基酸147、150、151和155的残基处包含突变。不希望受理论束缚，据信这些残基的突变对受体结合与体外生物活性都具有实质性影响。在一些实施方案中，所述经修饰的EPO蛋白在残基11、14、15、100、103、104和108处包含突变。不希望受理论束缚，据信这些残基的突变对受体结合活性具有中度影响，并且对体外生物活性具有大得多的影响。说明性取代包括但不限于以下中的一者或多者：Val11Ser、Arg14Ala、Arg14Gln、Tyr15lle、Pro42Asn、Thr44lle、Lys45Asp、Val46Ala、Tyr51Phe、Ser100Glu、Ser100Thr、Arg103Ala、Ser104lle、Ser104Ala、Leu108Lys、Asn147Lys、Arg150Ala、Gly151Ala和Leu155Ala。
在一些实施方案中，所述经修饰的EPO蛋白包含影响生物活性而不影响结合的突变，例如Eliot等人Mapping of the Active Site of Recombinant HumanErythropoietin 1997年1月15日；Blood:89(2)中列出的那些突变，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。
在一些实施方案中，所述经修饰的EPO蛋白包含涉及EPO蛋白中参与受体接触的表面残基的一个或多个突变。不希望受理论束缚，据信这些表面残基的突变不太可能影响蛋白质折叠，从而保留一定的生物活性。可以突变的说明性表面残基包括但不限于残基147和150。在说明性实施方案中，所述突变是取代，包括N147A、N147K、R150A和R150E中的一者或多者。
在一些实施方案中，所述经修饰的EPO蛋白包含在残基N59、E62、L67和L70处的一个或多个突变以及影响二硫键形成的一个或多个突变。不希望受理论束缚，据信这些突变影响折叠和/或预计处在被包埋的位置上，并且因此间接地影响生物活性。
在一个实施方案中，所述经修饰的EPO蛋白包含K20E取代，所述取代显著减少受体结合。参见例如Elliott等人,(1997)Blood,89:493-502，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。
可以并入本发明的嵌合EPO蛋白中的其他EPO突变公开于例如以下文献中：Elliott等人,(1997)Blood,89:493-502，所述文献的全部内容特此以引用方式并入；和Taylor等人,(2010)PEDS,23(4):251-260，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。
在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物具有(i)针对FAP的靶向部分和(ii)针对肿瘤细胞的靶向部分，以及本文所描述的野生型或经修饰或突变的信号传导剂中的任一种。在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物具有针对树突状细胞上的FAP的靶向部分和针对肿瘤细胞上的PD-L1或PD-L2的第二靶向部分。
在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物具有(i)针对FAP的靶向部分和(ii)针对检查点抑制剂标记物的靶向部分，以及本文所描述的野生型或经修饰或突变的干扰素中的任一种。在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物具有针对树突状细胞上的FAP的靶向部分和针对PD-1的第二靶向部分。
在一些实施方案中，所述信号传导剂是毒素或有毒的酶。在一些实施方案中，所述毒素或有毒的酶来源于植物和细菌。说明性的毒素或有毒的酶包括但不限于白喉毒素、假单胞菌毒素、炭疽毒素、核糖体灭活蛋白(RIP)诸如篦麻毒素和肥皂草素、葫莲根毒素、相思子毒素、白树毒素和美洲商陆抗病毒蛋白。另外的毒素包括Mathew等人,(2009)Cancer Sci100(8):1359-65中所公开的那些，全部公开内容特此以引用方式并入。在此类实施方案中，本发明技术的嵌合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物可以用于以细胞类型特异性方式诱导细胞死亡。在此类实施方案中，所述毒素可以经过修饰，例如突变以降低所述毒素的亲和力和/或活性以便减弱效应，如针对本文的其他信号传导剂所描述。
Fc结构域
片段可结晶结构域(Fc结构域)是抗体中的与位于免疫系统所涉细胞(例如B淋巴细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞)的细胞表面上的Fc受体相互作用的尾部区域。在IgG、IgA和IgD抗体同种型中，Fc结构域由两个相同的蛋白质片段组成，这些蛋白质片段来源于抗体两条重链的第二和第三恒定结构域。在IgM和IgE抗体同种型中，Fc结构域在每条多肽链中包含三个重链恒定结构域(CH结构域2-4)。
在一些实施方案中，本发明技术的基于Fc的嵌合蛋白复合物包含Fc结构域。在一些实施方案中，所述Fc结构域选自IgG、IgA、IgD、IgM或IgE。在一些实施方案中，所述Fc结构域选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
在一些实施方案中，所述Fc结构域选自人IgG、IgA、IgD、IgM或IgE。在一些实施方案中，所述Fc结构域选自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
在一些实施方案中，所述基于Fc的嵌合蛋白复合物的Fc结构域包含IgG的CH2和CH3区。在一些实施方案中，所述IgG是人IgG。在一些实施方案中，所述人IgG选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
在一些实施方案中，所述Fc结构域包含一个或多个突变。在一些实施方案中，所述Fc结构域的一个或多个突变减少或消除了Fc结构域的效应功能。在一些实施方案中，所述突变的Fc结构域对靶受体具有降低的亲和力或结合。作为实例，在一些实施方案中，所述Fc结构域的突变减少或消除了Fc结构域与FcγR的结合。在一些实施方案中，FcγR选自FcγRI；FcγRIIa、131R/R；FcγRIIa、131H/H、FcγRIIb；和FcγRIII。在一些实施方案中，所述Fc结构域的突变减少或消除了与补体蛋白(诸如例如C1q)的结合。在一些实施方案中，所述Fc结构域的突变减少或消除了与FcγR和补体蛋白(诸如例如C1q)两者的结合。
在一些实施方案中，所述Fc结构域包含LALA突变以减少或消除Fc结构域的效应功能。作为实例，在一些实施方案中，LALA突变包括人IgG(例如IgG1)中的L234A和L235A取代(其中编号是基于根据EU公约(PNAS，Edelman等人,1969；63(1)78-85)对人IgG1的CH2残基的常用编号)。
在一些实施方案中，人IgG的Fc结构域在L234、L235、K322、D265、P329和P331中的一者或多者处包含突变，以减少或消除Fc结构域的效应功能。作为实例，在一些实施方案中，所述突变选自L234A、L234F、L235A、L235E、L235Q、K322A、K322Q、D265A、P329G、P329A、P331G和P331S。
在一些实施方案中，所述Fc结构域包含FALA突变以减少或消除Fc结构域的效应功能。作为实例，在一些实施方案中，所述FALA突变包括人IgG4中的F234A和L235A取代。
在一些实施方案中，人IgG4的Fc结构域在F234、L235、K322、D265和P329中的一者或多者处包含突变，以减少或消除Fc结构域的效应功能。作为实例，在一些实施方案中，所述突变选自F234A、L235A、L235E、L235Q、K322A、K322Q、D265A、P329G和P329A。
在一些实施方案中，所述Fc结构域的一个或多个突变使Fc结构域中的铰链区稳定化。作为实例，在一些实施方案中，所述Fc结构域在人IgG的S228处包含突变以使铰链区稳定化。在一些实施方案中，所述突变是S228P。
在一些实施方案中，所述Fc结构域的一个或多个突变促进Fc结构域的链配对。在一些实施方案中，通过离子配对(亦称带电对、离子键或带电残基对)促进链配对。
在一些实施方案中，所述Fc结构域在IgG的以下氨基酸残基中的一者或多者处包含突变以促进离子配对：D356、E357、L368、K370、K392、D399和K409。
作为实例，在一些实施方案中，人IgG Fc结构域包含表1中的突变组合之一以促进离子配对。
在一些实施方案中，链配对经由旋钮入孔洞突变促成。在一些实施方案中，所述Fc结构域包含一个或多个突变，以实现Fc结构域中的旋钮入孔洞相互作用。在一些实施方案中，将第一Fc链工程化以表达“旋钮”，并且将第二Fc链工程化以表达互补的“孔洞”。作为实例，在一些实施方案中，人IgG Fc结构域包含表2的突变，以实现旋钮入孔洞相互作用。
在一些实施方案中，本发明技术的基于Fc的嵌合蛋白复合物中的Fc结构域包含以上公开的突变的任何组合。作为实例，在一些实施方案中，所述Fc结构域包含促进离子配对和/或旋钮入孔洞相互作用的突变。作为实例，在一些实施方案中，所述Fc结构域包含具有以下一种或多种特性的突变：促进离子配对，诱导旋钮入孔洞相互作用，减少或消除Fc结构域的效应功能，以及引起Fc稳定化(例如，在铰链处)。
作为实例，在一些实施方案中，人IgG Fc结构域包含表3中公开的突变，所述突变促进Fc结构域中的离子配对和/或促进旋钮入孔洞相互作用。
作为实例，在一些实施方案中，人IgG Fc结构域包含表4中公开的突变，所述突变促进Fc结构域的离子配对，促进旋钮入孔洞相互作用或它们的组合。在多个实施方案中，表4的“链1”和“链2”可以互换(例如，链1可以具有Y407T，并且链2可以具有T366Y)。
作为实例，在一些实施方案中，人IgG Fc结构域包含表5中公开的突变，所述突变减少或消除了Fc结构域中的FcγR和/或补体结合。在多个实施方案中，两条链中都有表5的突变。
在一些实施方案中，本发明技术的基于Fc的嵌合蛋白复合物中的Fc结构域是同源二聚体，即，所述嵌合蛋白复合物中的Fc结构域包含两个相同的蛋白质片段。
在一些实施方案中，本发明技术的基于Fc的嵌合蛋白复合物中的Fc结构域是异源二聚体，即，所述Fc结构域包含两个不同的蛋白质片段。
在一些实施方案中，使用本文所描述的离子配对和/或旋钮入孔洞突变来工程化异源二聚体Fc结构域。在一些实施方案中，异源二聚体的基于Fc的嵌合蛋白复合物具有反式取向/构型。在反式取向/构型中，在多个实施方案中，靶向部分和信号传导剂未见于本发明的基于Fc的嵌合蛋白复合物的同一多肽链上。
在一些实施方案中，使用本文所描述的离子配对和/或旋钮入孔洞突变来工程化异源二聚体Fc结构域。在一些实施方案中，异源二聚体的基于Fc的嵌合蛋白复合物具有反式取向。
在反式取向中，在多个实施方案中，靶向部分和信号传导剂未见于本发明的基于Fc的嵌合蛋白复合物的同一多肽链上。在顺式取向中，在多个实施方案中，靶向部分和信号传导剂见于所述基于Fc的嵌合蛋白复合物的独立多肽链上。在顺式取向中，在多个实施方案中，靶向部分和信号传导剂见于所述基于Fc的嵌合蛋白复合物的同一多肽链上。
在一些实施方案中，在本文所描述的异源二聚体蛋白复合物中存在超过一个靶向部分时，一个靶向部分可以处于反式取向(相对于信号传导剂)，而另一靶向部分可以处于顺式取向(相对于信号传导剂)。在一些实施方案中，信号传导剂和靶标部分在Fc结构域的相同末端/侧(N末端或C末端)上。在一些实施方案中，信号传导剂和靶向部分在Fc结构域的不同侧/末端(N端和C端)上。
在一些实施方案中，在本文所描述的异源二聚体蛋白复合物中存在超过一个靶向部分时，所述靶向部分可见于异源二聚体蛋白复合物中的同一Fc链上或两条不同的Fc链上(在后一种情况下，所述靶向部分由于在不同的Fc链上，所以相对于彼此是反式的)。在一些实施方案中，在同一Fc链上存在超过一个靶向部分时，所述靶向部分可以在Fc链的同一或不同侧/末端(N端或/和C端)上。
在一些实施方案中，在本文所描述的异源二聚体蛋白复合物中存在超过一个信号传导剂时，所述信号传导剂可见于异源二聚体蛋白复合物中的同一Fc链上或两条不同的Fc链上(在后一种情况下，所述信号传导剂由于在不同的Fc链上，所以相对于彼此是反式的)。在一些实施方案中，在同一Fc链上存在超过一个信号传导剂时，所述信号传导剂可以在Fc链的同一或不同侧/末端(N端或/和C端)上。
在一些实施方案中，在本文所描述的异源二聚体蛋白复合物中存在超过一个信号传导剂时，一个信号传导剂可以处于反式取向(如相对于靶向部分)，而另一信号传导剂可以处于顺式取向(如相对于靶向部分)。
在一些实施方案中，所述Fc结构域包括野生型人IgG1的核心铰链区或从其开始，所述核心铰链区包含序列Cys-Pro-Pro-Cys。在一些实施方案中，所述Fc结构域还包括上铰链或其部分(例如，DKTHTCPPC；参见WO 2009053368)、EPKSCDKTHTCPPC或EPKSSDKTHTCPPC；参见Lo等人,Protein Engineering第11卷第6期第495-500页,1998))。
基于Fc的嵌合蛋白复合物
本发明技术的基于Fc的嵌合蛋白复合物包含至少一个本文所公开的Fc结构域、至少一个本文所公开的信号传导剂(SA)和至少一个本文所公开的靶向部分(TM)。
本发明的基于Fc的嵌合蛋白复合物可以涵盖两种融合蛋白的复合物，每一融合蛋白包含Fc结构域。在一些实施方案中，所述基于Fc的嵌合蛋白复合物是同源二聚体的。
在一些实施方案中，所述基于Fc的嵌合蛋白复合物是异源二聚体的。在一些实施方案中，所述异源二聚体的基于Fc的嵌合蛋白复合物具有反式取向/构型。在一些实施方案中，所述异源二聚体的基于Fc的嵌合蛋白复合物具有顺式取向/构型。在一些实施方案中，所述异源二聚体的基于Fc的嵌合蛋白复合物在单个多肽上不包含信号传导剂和靶向部分。
在一些实施方案中，所述基于Fc的嵌合蛋白相对于缺乏Fc的嵌合蛋白或不是异源二聚体复合物的嵌合蛋白具有改善的体内半衰期。在一些实施方案中，所述基于Fc的嵌合蛋白相对于缺乏Fc的嵌合蛋白或不是异源二聚体复合物的嵌合蛋白具有改善的溶解性、稳定性和其他药理特性。
异源二聚体的基于Fc的嵌合蛋白复合物由两种不同的多肽组成。在本文所描述的实施方案中，靶向结构域与信号传导剂位于不同的多肽上，因此，蛋白质仅含有一个靶向结构域拷贝，并且也只能制备一个信号传导剂拷贝(这提供了一种构型，其中对所期望特性的潜在干扰可以得到控制)。此外，在多个实施方案中，仅一个靶向结构域(例如VHH)可以避免细胞表面上抗原的交联(在一些情况下这可能引发不良作用)。此外，在多个实施方案中，一个信号传导剂可以减轻分子“拥挤”和对依赖于靶向结构域的亲合力介导的效应功能恢复的潜在干扰。此外，在多个实施方案中，异源二聚体的基于Fc的嵌合蛋白复合物可以具有两个靶向部分，并且这些靶向部分可以被置于两个不同的多肽上。举例来说，在多个实施方案中，可以掩盖两个靶向部分(例如VHH)的C端，以避免潜在的自身抗体或预先存在的抗体(例如VHH自身抗体或预先存在的抗体)。此外，在多个实施方案中，例如在不同多肽上具有靶向结构域而非信号传导剂(例如野生型信号传导剂)的异源二聚体的基于Fc的嵌合蛋白复合物，可能有利于两种细胞类型(例如肿瘤细胞和免疫细胞)的“交联”。此外，在多个实施方案中，异源二聚体的基于Fc的嵌合蛋白复合物可以具有两个信号传导剂，每个信号传导剂位于不同的多肽上以允许更复杂的效应应答。
此外，在多个实施方案中，例如在不同多肽上具有靶向结构域而非信号传导剂的异源二聚体的基于Fc的嵌合蛋白复合物，以实践的方式提供了靶向部分和信号传导剂的组合多样性。例如，在多个实施方案中，具有本文所描述的任何靶向部分的多肽可以与具有本文所描述的任何信号传导剂的多肽“现成”组合，以允许在单个基于Fc的嵌合蛋白复合物中快速产生靶向部分和信号传导剂的各种组合。
在一些实施方案中，所述基于Fc的嵌合蛋白复合物包含一个或多个接头。在一些实施方案中，所述基于Fc的嵌合蛋白复合物包含连接Fc结构域、一个或多个信号传导剂和一个或多个靶向部分的接头。在一些实施方案中，所述基于Fc的嵌合蛋白复合物包含连接各信号传导剂和靶向部分(或者在存在超过一个靶向部分时将信号传导剂连接至所述靶向部分之一)的接头。在一些实施方案中，所述基于Fc的嵌合蛋白复合物包含将各信号传导剂连接至Fc结构域的接头。在一些实施方案中，所述基于Fc的嵌合蛋白复合物包含将各靶向部分连接至Fc结构域的接头。在一些实施方案中，所述基于Fc的嵌合蛋白复合物包含将靶向部分连接至另一靶向部分的接头。在一些实施方案中，所述基于Fc的嵌合蛋白复合物包含将信号传导剂连接至另一信号传导剂的接头。
在一些实施方案中，所述基于Fc的嵌合蛋白复合物包含两个或更多个靶向部分。在此类实施方案中，所述靶向部分可以是相同的靶向部分或者它们可以是不同的靶向部分。
在一些实施方案中，所述基于Fc的嵌合蛋白复合物包含两个或更多个信号传导剂。在此类实施方案中，所述信号传导剂可以是相同的靶向部分或者它们可以是不同的靶向部分。
作为实例，在一些实施方案中，所述基于Fc的嵌合蛋白复合物包含Fc结构域、至少两个信号传导剂(SA)和至少两个靶向部分(TM)，其中所述Fc结构域、信号传导剂和靶向部分选自本文所公开的Fc结构域、信号传导剂和靶向部分中的任一者。在一些实施方案中，所述Fc结构域是同源二聚体的。
在各个实施方案中，所述基于Fc的嵌合蛋白复合物采取图5A-图5F的示意图中的任一者的形式。在各个实施方案中，所述基于Fc的嵌合蛋白复合物采取图6A-图6H的示意图中的任一者的形式。在各个实施方案中，所述基于Fc的嵌合蛋白复合物采取图7A-图7H的示意图中的任一者的形式。在各个实施方案中，所述基于Fc的嵌合蛋白复合物采取图8A-图8D的示意图中的任一者的形式。在各个实施方案中，所述基于Fc的嵌合蛋白复合物采取图9A-图9F的示意图中的任一者的形式。在各个实施方案中，所述基于Fc的嵌合蛋白复合物采取图10A-图10J的示意图中的任一者的形式。在各个实施方案中，所述基于Fc的嵌合蛋白复合物采取图11A-图11D的示意图中的任一者的形式。在各个实施方案中，所述基于Fc的嵌合蛋白复合物采取图12A-图12F的示意图中的任一者的形式。在各个实施方案中，所述基于Fc的嵌合蛋白复合物采取图13A-图13J的示意图中的任一者的形式。在各个实施方案中，所述基于Fc的嵌合蛋白复合物采取图14A-图14F的示意图中的任一者的形式。在各个实施方案中，所述基于Fc的嵌合蛋白复合物采取图15A-图15L的示意图中的任一者的形式。在各个实施方案中，所述基于Fc的嵌合蛋白复合物采取图16A-图16L的示意图中的任一者的形式。在各个实施方案中，所述基于Fc的嵌合蛋白复合物采取图17A-图17F的示意图中的任一者的形式。在各个实施方案中，所述基于Fc的嵌合蛋白复合物采取图18A-图18L的示意图中的任一者的形式。在各个实施方案中，所述基于Fc的嵌合蛋白复合物采取图19A-图19L的示意图中的任一者的形式。在各个实施方案中，所述基于Fc的嵌合蛋白复合物采取图20A-图20J的示意图中的任一者的形式。在各个实施方案中，所述基于Fc的嵌合蛋白复合物采取图21A-图21J的示意图中的任一者的形式。在各个实施方案中，所述基于Fc的嵌合蛋白复合物采取图22A-图22F的示意图中的任一者的形式。在各个实施方案中，所述基于Fc的嵌合蛋白复合物采取图23A-图23F的示意图中的任一者的形式。
在一些实施方案中，所述信号传导剂连接至所述靶向部分并且所述靶向部分连接至Fc结构域的相同末端(参见图5A-图5F)。在一些实施方案中，所述Fc结构域是同源二聚体的。
在一些实施方案中，所述信号传导剂和所述靶向部分连接至Fc结构域，其中靶向部分和信号传导剂连接在相同末端上(参见图5A-图5F)。在一些实施方案中，所述Fc结构域是同源二聚体的。
在一些实施方案中，所述靶向部分连接至信号传导剂并且所述信号传导剂连接至Fc结构域的相同末端(参见图5A-图5F)。在一些实施方案中，所述Fc结构域是同源二聚体的。
在一些实施方案中，同源二聚体的基于Fc的嵌合蛋白复合物具有两个或更多个靶向部分。在一些实施方案中，存在四个靶向部分和两个信号传导剂，所述靶向部分连接至Fc结构域，并且所述信号传导剂连接至靶向部分的相同末端(参见图6A-图6H)。在一些实施方案中，所述Fc结构域是同源二聚体的。在一些实施方案中，在存在四个靶向部分和两个信号传导剂的情况下，两个靶向部分连接至Fc结构域，并且两个靶向部分连接至信号传导剂，所述信号传导剂连接至Fc结构域的相同末端(参见图6A-图6H)。在一些实施方案中，所述Fc结构域是同源二聚体的。在一些实施方案中，在存在四个靶向部分和两个信号传导剂的情况下，两个靶向部分彼此连接，并且每对中的一个靶向部分连接至Fc结构域的相同末端，并且信号传导剂连接至Fc结构域的相同末端(参见图6A-图6H)。在一些实施方案中，所述Fc结构域是同源二聚体的。在一些实施方案中，在存在四个靶向部分和两个信号传导剂的情况下，两个靶向部分彼此连接，其中每对中的一个靶向部分连接至信号传导剂，而该对中的另一个靶向部分连接至Fc结构域，其中连接至Fc结构域的靶向部分连接在相同末端上(参见图6A-图6H)。在一些实施方案中，所述Fc结构域是同源二聚体的。
在一些实施方案中，同源二聚体的基于Fc的嵌合蛋白复合物具有两个或更多个信号传导剂。在一些实施方案中，在存在四个信号传导剂和两个靶向部分的情况下，两个信号传导剂彼此连接，并且该对中的一个信号传导剂连接至Fc结构域的相同末端，并且所述靶向部分连接至Fc结构域的相同末端(参见图7A-图7H)。在一些实施方案中，所述Fc结构域是同源二聚体的。在一些实施方案中，在存在四个信号传导剂和两个靶向部分的情况下，两个信号传导剂连接至Fc结构域的相同末端，并且所述信号传导剂中的两个各自连接至靶向部分，其中所述靶向部分连接至Fc结构域的相同末端(参见图7A-图7H)。在一些实施方案中，所述Fc结构域是同源二聚体的。在一些实施方案中，在存在四个信号传导剂和两个靶向部分的情况下，两个信号传导剂彼此连接，并且该对中的一个信号传导剂连接至靶向部分，并且所述靶向部分连接至Fc结构域的相同末端(参见图7A-图7H)。在一些实施方案中，所述Fc结构域是同源二聚体的。
作为实例，在一些实施方案中，所述基于Fc的嵌合蛋白复合物包含Fc结构域，其中所述Fc结构域包含一个或多个离子配对突变和/或一个或多个旋钮入孔洞突变；至少一个信号传导剂；以及至少一个靶向部分，其中所述离子配对基序和/或旋钮入孔洞基序、信号传导剂和靶向基团选自本文所公开的离子配对基团和/或旋钮入孔洞基序、信号传导剂和靶向部分中的任一者。在一些实施方案中，所述Fc结构域是异源二聚体的。在一些实施方案中，所述Fc结构域包含减少或消除其效应功能的突变。
在一些实施方案中，所述信号传导剂连接至所述靶向部分，所述靶向部分连接至所述Fc结构域(参见图14A-图14F和图17A-图17F)。在一些实施方案中，所述靶向部分连接至所述信号传导剂，所述信号传导剂连接至所述Fc结构域(参见图14A-图14F和图17A-图17F)。
在一些实施方案中，所述Fc结构域是异源二聚体的。在一些实施方案中，所述Fc结构域包含减少或消除其效应功能的突变。
在一些实施方案中，所述信号传导剂和所述靶向部分连接至所述Fc结构域(参见图8A-图8D、图11A-图11D、图14A-图14F和图17A-图17F)。在一些实施方案中，所述靶向部分和所述信号传导剂连接至不同Fc链的相同末端(参见图8A-图8D和图11A-图11D)。在一些实施方案中，所述靶向部分和所述信号传导剂连接至不同Fc链的不同末端(参见图8A-图8D和图11A-图11D)。在一些实施方案中，所述靶向部分和所述信号传导剂连接至相同的Fc链(参见图14A-图14F和图17A-图17F)。在一些实施方案中，所述Fc结构域是异源二聚体的。在一些实施方案中，所述Fc结构域包含减少或消除其效应功能的突变。
在一些实施方案中，在存在一个信号传导剂和两个靶向部分的情况下，所述信号传导剂连接至Fc结构域，并且两个靶向部分可以：1)彼此连接，其中一个靶向部分连接至Fc结构域；或者2)各自连接至Fc结构域(参见图9A-图9F、图12A-图12F、图15A-图15L、图18A-图18L、图20A-图20J和图21A-图21J)。在一些实施方案中，靶向部分连接在一个Fc链上，而信号传导剂在另一Fc链上(参见图9A-图9F和图12A-图12F)。在一些实施方案中，成对的靶向部分和信号传导剂连接至相同的Fc链(参见图15A-图15L和图18A-图18L)。在一些实施方案中，一个靶向部分连接至Fc结构域，另一个靶向部分连接至信号传导剂，并且成对的靶向部分连接至Fc结构域(参见图15A-图15L、图18A-图18L、图20A-图20J和图21A-图21J)。在一些实施方案中，不成对的靶向部分和成对的靶向部分连接至相同的Fc链(参见图15A-图15L和图18A-图18L)。在一些实施方案中，不成对的靶向部分和成对的靶向部分连接至不同的Fc链(参见图20A-图20J和图21A-图21J)。在一些实施方案中，不成对的靶向部分和成对的靶向部分连接在相同的末端上(参见图20A-图20J和图21A-图21J)。在一些实施方案中，所述Fc结构域是异源二聚体的。在一些实施方案中，所述Fc结构域包含减少或消除其效应功能的突变。
在一些实施方案中，在存在一个信号传导剂和两个靶向部分的情况下，靶向部分连接至信号传导剂，所述信号传导剂连接至Fc结构域，并且不成对的靶向部分连接至Fc结构域(参见图15A-图15L、图18A-图18L、图20A-图20J和图21A-图21J)。在一些实施方案中，成对的信号传导剂和不成对的靶向部分连接至相同的Fc链(参见图15A-图15L和图18A-图18L)。在一些实施方案中，成对的信号传导剂和不成对的靶向部分连接至不同的Fc链(参见图20A-图20J和图21A-图21J)。在一些实施方案中，成对的信号传导剂和不成对的靶向部分连接在相同的末端上(参见图20A-图20J和图21A-图21J)。在一些实施方案中，所述Fc结构域是异源二聚体的。在一些实施方案中，所述Fc结构域包含减少或消除其效应功能的突变。
在一些实施方案中，在存在一个信号传导剂和两个靶向部分的情况下，靶向部分连接在一起，并且信号传导剂连接至所述成对的靶向部分中的一个，其中未连接至信号传导剂的靶向部分连接至Fc结构域(参见图15A-图15L和图18A-图18L)。在一些实施方案中，所述Fc结构域是异源二聚体的。在一些实施方案中，所述Fc结构域包含减少或消除其效应功能的突变。
在一些实施方案中，在存在一个信号传导剂和两个靶向部分的情况下，靶向部分连接在一起，并且信号传导剂连接至所述成对的靶向部分中的一个，其中信号传导剂连接至Fc结构域(参见图15A-图15L和图18A-图18L)。在一些实施方案中，所述Fc结构域是异源二聚体的。在一些实施方案中，所述Fc结构域包含减少或消除其效应功能的突变。
在一些实施方案中，在存在一个信号传导剂和两个靶向部分的情况下，靶向部分均连接至信号传导剂，其中靶向部分中的一个连接至Fc结构域(参见图15A-图15L和图18A-图18L)。在一些实施方案中，所述Fc结构域是异源二聚体的。在一些实施方案中，所述Fc结构域包含减少或消除其效应功能的突变。
在一些实施方案中，在存在一个信号传导剂和两个靶向部分的情况下，靶向部分和信号传导剂连接至Fc结构域(参见图20A-图20J和图21A-图21J)。在一些实施方案中，靶向部分连接在末端上(参见图20A-图20J和图21A-图21J)。在一些实施方案中，所述Fc结构域是异源二聚体的。在一些实施方案中，所述Fc结构域包含减少或消除其效应功能的突变。
在一些实施方案中，在存在两个信号传导剂和一个靶向部分的情况下，信号传导剂连接至Fc结构域的相同末端，并且靶向部分连接至Fc结构域(参见图10A-图10J和图13A-图13J)。在一些实施方案中，信号传导剂连接至同一Fc链上的Fc结构域，而靶向部分连接在另一Fc链上(参见图22A-图22F和图23A-图23F)。在一些实施方案中，所述Fc结构域是异源二聚体的。在一些实施方案中，所述Fc结构域包含减少或消除其效应功能的突变。
在一些实施方案中，在存在两个信号传导剂和一个靶向部分的情况下，信号传导剂连接至靶向部分，所述靶向部分连接至Fc结构域，另一信号传导剂连接至Fc结构域(参见图10A-图10J、图13A-图13J、图16A-图16L和图19A-图19L)。在一些实施方案中，靶向部分和不成对的信号传导剂连接至不同的Fc链(参见图10A-图10J和图13A-图13J)。在一些实施方案中，靶向部分和不成对的信号传导剂连接至不同Fc链的相同末端(参见图10A-图10J和图13A-图13J)。在一些实施方案中，靶向部分和不成对的信号传导剂连接至不同Fc链的不同末端(参见图10A-图10J和图13A-图13J)。在一些实施方案中，靶向部分和不成对的信号传导剂连接至相同的Fc链(参见图16A-图16L和图19A-图19L)。在一些实施方案中，所述Fc结构域是异源二聚体的。在一些实施方案中，所述Fc结构域包含减少或消除其效应功能的突变。
在一些实施方案中，在存在两个信号传导剂和一个靶向部分的情况下，靶向部分连接至信号传导剂，所述信号传导剂连接至Fc结构域，并且另一个信号传导剂连接至Fc结构域(参见图10A-图10J和图13A-图13J)。在一些实施方案中，成对的信号传导剂和不成对的信号传导剂连接至不同的Fc链(参见图10A-图10J和图13A-图13J)。在一些实施方案中，成对的信号传导剂和不成对的信号传导剂连接至不同Fc链的相同末端(参见图10A-图10J和图13A-图13J)。在一些实施方案中，成对的信号传导剂和不成对的信号传导剂连接至不同Fc链的不同末端(参见图10A-图10J和图13A-图13J)。在一些实施方案中，所述Fc结构域是异源二聚体的。在一些实施方案中，所述Fc结构域包含减少或消除其效应功能的突变。
在一些实施方案中，在存在两个信号传导剂和一个靶向部分的情况下，信号传导剂连接在一起，并且靶向部分连接至成对的信号传导剂中的一个，其中靶向部分连接至Fc结构域(参见图16A-图16L和图19A-图19L)。在一些实施方案中，所述Fc结构域是异源二聚体的。在一些实施方案中，所述Fc结构域包含减少或消除其效应功能的突变。
在一些实施方案中，在存在两个信号传导剂和一个靶向部分的情况下，信号传导剂连接在一起，并且所述信号传导剂中的一个连接至Fc结构域，并且靶向部分连接至Fc结构域(参见图16A-图16L、图19A-图19L、图22A-图22F和图23A-图23F)。在一些实施方案中，成对的信号传导剂和靶向部分连接至相同的Fc链(参见图16A-图16L和图19A-图19L)。在一些实施方案中，成对的信号传导剂和靶向部分连接至不同的Fc链(参见图22A-图22F和图23A-图23F)。在一些实施方案中，成对的信号传导剂和靶向部分连接至不同Fc链的相同末端(参见图22A-图22F和图23A-图23F)。在一些实施方案中，所述Fc结构域是异源二聚体的。在一些实施方案中，所述Fc结构域包含减少或消除其效应功能的突变。
在一些实施方案中，在存在两个信号传导剂和一个靶向部分的情况下，信号传导剂均连接至靶向部分，其中所述信号传导剂中的一个连接至Fc结构域(参见图16A-图16L和图19A-图19L)。在一些实施方案中，所述Fc结构域是异源二聚体的。在一些实施方案中，所述Fc结构域包含减少或消除其效应功能的突变。
在一些实施方案中，在存在两个信号传导剂和一个靶向部分的情况下，信号传导剂连接在一起，并且所述信号传导剂中的一个连接至靶向部分，并且另一个信号传导剂连接至Fc结构域(参见图16A-图16L和图19A-图19L)。
在一些实施方案中，在存在两个信号传导剂和一个靶向部分的情况下，每个信号传导剂连接至Fc结构域，并且靶向部分连接至所述信号传导剂中的一个(参见图16A-图16L和图19A-图19L)。在一些实施方案中，信号传导剂连接至相同的Fc链(参见图16A-图16L和图19A-图19L)。
在一些实施方案中，靶向部分或信号传导剂连接至包含CH2和CH3结构域中的一者或两者和任选地铰链区的Fc结构域。举例来说，编码作为单个核苷酸序列连接至Fc结构域的靶向部分、信号传导剂或它们的组合的载体可用于制备此类多肽。
具有信号传导剂的多特异性嵌合体和融合物
在一些实施方案中，本发明技术的FAP结合剂是具有一个或多个如本文所描述的信号传导剂和/或一个或多个另外的靶向部分的嵌合体或融合物或基于Fc的嵌合蛋白复合物的一部分。因此，本发明技术提供了包含一个或多个信号传导剂和针对FAP的靶向部分和/或一个或多个另外的靶向部分的嵌合或融合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物。
在一些实施方案中，本发明技术的FAP结合剂是多特异性的，即所述FAP结合剂包含两个或更多个靶向部分，所述靶向部分具有识别并结合两个或更多个靶标(例如抗原或受体或表位)的识别结构域。在此类实施方案中，本发明技术的FAP结合剂可以包含两个或更多个靶向部分，所述靶向部分具有识别并结合相同抗原上或不同抗原上的两个或更多个表位的识别结构域。在一些实施方案中，此类多特异性FAP结合剂表现出诸多有利性质，诸如增加的亲合力和/或提高的选择性。在一个实施方案中，本发明技术的FAP结合剂包含两个靶向部分并且是双特异性的，即结合并识别相同抗原上或不同抗原上的两个表位。
在一些实施方案中，本发明技术的多特异性FAP结合剂包含两个或更多个靶向部分，各靶向部分是如本文所描述的抗体或抗体衍生物。在一个实施方案中，本发明技术的多特异性FAP结合剂包含至少一个包含针对FAP的抗原识别结构域的VHH和一个包含针对肿瘤抗原的抗原识别结构域的抗体或抗体衍生物。
在一些实施方案中，本发明的多特异性FAP结合剂具有靶向不同抗原或受体的两个或更多个靶向部分，并且一个靶向部分可以减弱其抗原或受体，例如所述靶向部分以低亲和力或亲合力结合其抗原或受体(包括例如以比其他靶向部分对其抗原或受体具有的亲和力或亲合力低的亲和力或亲合力，举例来说，结合亲和力之间的差异可以是约10倍、或25倍、或50倍、或100倍、或300倍、或500倍、或1000倍、或5000倍；举例来说，较低亲和力或亲合力靶向部分能以中至高nM或低至中pM范围内的KD结合其抗原或受体，而较高亲和力或亲合力靶向部分能以中至高pM或低至中nM范围内的KD结合其抗原或受体)。举例来说，在一些实施方案中，本发明的多特异性FAP结合剂包含减毒的靶向部分，所述减毒的靶向部分针对混杂抗原或受体，从而可以改善对目标细胞的靶向(例如经由其他靶向部分)并且防止多个类型的细胞，包括疗法未靶向的那些细胞的效应(例如通过以比这些实施方案中提供的亲和力更高的亲和力结合混杂抗原或受体)。
可以使用本领域中已知的方法来构建本发明技术的多特异性FAP结合剂，参见例如美国专利号9,067,991、美国专利公布号20110262348和WO 2004/041862，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。在一个说明性实施方案中，可以通过化学交联，例如通过如Blattler等人,Biochemistry 24,1517-1524和EP294703所描述使氨基酸残基与有机衍生化剂反应来构建本发明技术的包含两个或更多个靶向部分的多特异性FAP结合剂，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。在另一个说明性实施方案中，通过基因融合，即构建包括个别靶向部分的多肽的单多肽来构建包含两个或更多个靶向部分的多特异性FAP结合剂。举例来说，可以形成单多肽构建体，所述构建体编码具有针对FAP的抗原识别结构域的第一VHH和具有针对肿瘤抗原的抗原识别结构域的第二抗体或抗体衍生物。PCT专利申请WO96/34103中公开了一种用于产生二价或多价VHH多肽构建体的方法，所述专利申请的全部内容特此以引用方式并入。在另一个说明性实施方案中，可以通过使用接头来构建本发明技术的多特异性FAP结合剂。举例来说，具有针对FAP的抗原识别结构域的第一VHH的羧基端可以连接至具有针对肿瘤抗原的抗原识别结构域的第二抗体或抗体衍生物的氨基端(或反之亦然)。本文描述了可以使用的说明性接头。在一些实施方案中，本发明技术的多特异性FAP结合剂的组分没有使用接头而直接与彼此连接。
在一些实施方案中，本发明技术的多特异性FAP结合剂识别并结合至FAP和在一个或多个免疫细胞上发现的一个或多个抗原，所述免疫细胞可以包括但不限于巨核细胞、血小板、红细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、T淋巴细胞(例如，细胞毒性T淋巴细胞、T辅助细胞、自然杀伤T细胞)、B淋巴细胞、浆细胞、树突状细胞或它们的子集。在一些实施方案中，所述FAP结合剂特异性地结合至目标抗原并且有效地直接或间接地募集一个或多个免疫细胞。
在一些实施方案中，本发明技术的多特异性FAP结合剂识别并结合至FAP和在肿瘤细胞上发现的一个或多个抗原。在这些实施方案中，本发明的FAP结合剂可以将免疫细胞直接或间接地募集至肿瘤细胞或肿瘤微环境。在一些实施方案中，本发明的FAP结合剂可以将免疫细胞，例如可以杀死和/或阻抑肿瘤细胞的免疫细胞(例如CTL)直接或间接地募集至作用位点(作为非限制性实例，诸如肿瘤微环境)。
在一些实施方案中，本发明的FAP结合剂能够或可用于涉及改变有利于肿瘤的免疫攻击的免疫细胞平衡的方法中。举例来说，本发明的FAP结合剂可以改变临床重要部位处的免疫细胞比率，从而有利于可以杀死和/或阻抑肿瘤的细胞(例如T细胞、细胞毒性T淋巴细胞、T辅助细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、抗肿瘤巨噬细胞(例如M1巨噬细胞)、嗜中性粒细胞、B细胞、树突状细胞或它们的子集，并且对抗保护肿瘤的细胞(例如骨髓来源的阻抑细胞(MDSC)、调控T细胞(Treg)、肿瘤相关嗜中性粒细胞(TAN)、M2巨噬细胞、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)或它们的子集)。在一些实施方案中，本发明的FAP结合剂能够增加效应T细胞与调控T细胞的比率。
在一些实施方案中，本发明技术的多特异性FAP结合剂包含具有特异性地结合至与肿瘤细胞相关的抗原的抗原识别结构域的靶向部分。在一些实施方案中，所述靶向部分直接或间接地募集肿瘤细胞。举例来说，在一些实施方案中，将肿瘤细胞募集至可以杀死和/或阻抑肿瘤细胞的一个或多个效应细胞(例如本文所描述的免疫细胞)。在一些实施方案中，所述靶向部分例如通过与它们各自的在肿瘤和FAP阳性免疫细胞(例如树突状细胞)上的抗原相互作用的两个靶向部分直接或间接地将T细胞募集至肿瘤细胞。
肿瘤细胞或癌细胞是指细胞或组织的不受控制的生长和/或细胞存活时间的异常增加和/或对干扰身体器官和系统的正常功能的细胞凋亡的抑制。举例来说，肿瘤细胞包括良性和恶性癌症、息肉、增生以及休眠肿瘤或微转移。说明性肿瘤细胞包括但不限于以下的细胞：基底细胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑和中枢神经系统癌症；乳腺癌；腹膜癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠和直肠癌；结缔组织癌；消化系统癌症；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头颈癌；胃癌(包括胃肠癌)；成胶质细胞瘤；肝癌；肝细胞瘤；上皮内赘瘤；肾脏癌或肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)；黑素瘤；骨髓瘤；成神经细胞瘤；口腔癌(唇、舌、口和咽)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；成视网膜细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌症；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫或子宫内膜癌；泌尿系统癌症；外阴癌；淋巴瘤，包括霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤，以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞性(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级成免疫细胞性NHL；高级成淋巴细胞性NHL；高级小非核裂细胞NHL；巨大肿块性NHL(bulky disease NHL)；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom's Macroglobulinemia)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性成淋巴细胞性白血病(ALL)；毛细胞性白血病；慢性成髓细胞性白血病；以及其他癌瘤和肉瘤；和移植后淋巴组织增生性病症(PTLD)，以及与斑痣性错构瘤相关的异常血管增生、水肿(例如，与脑肿瘤相关的水肿)和梅格斯氏综合征(Meigs’syndrome)。
肿瘤细胞或癌细胞还包括但不限于癌瘤，例如各种亚型，包括例如腺癌、基底细胞癌、鳞状细胞癌和移行细胞癌)、肉瘤(包括例如骨和软组织)、白血病(包括例如急性骨髓性、急性成淋巴细胞性、慢性骨髓性、慢性淋巴细胞性和毛细胞)、淋巴瘤和骨髓瘤(包括例如霍奇金氏和非霍奇金氏淋巴瘤、轻链、非分泌性、MGUS和浆细胞瘤)和中枢神经系统癌症(包括例如脑(例如神经胶质瘤(例如星形细胞瘤、寡枝神经胶质瘤和室管膜瘤)、脑膜瘤、垂体腺瘤和神经瘤和脊髓肿瘤(例如脑膜瘤和纤维神经瘤)。
说明性肿瘤抗原包括但不限于MART-1/Melan-A、gp100、二肽基肽酶IV(DPPIV)、腺苷脱氨酶结合蛋白(ADAbp)、亲环蛋白b、结肠直肠相关抗原(CRC)-0017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)及其免疫原性表位CAP-1和CAP-2、etv6、am11、前列腺特异性抗原(PSA)及其免疫原性表位PSA-1、PSA-2和PSA-3、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、T细胞受体/CD3-ζ链、MAGE家族肿瘤抗原(例如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-Al2、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-05)、GAGE家族肿瘤抗原(例如GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9)、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪氨酸酶、p53、MUC家族、HER2/neu、p21ras、RCAS1、a-胎儿球蛋白、E-钙粘蛋白、a-连锁蛋白、3-连锁蛋白和y-连锁蛋白、p120ctn、gp100Pme1117、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、腺瘤性结肠息肉病蛋白(APC)、胞衬蛋白、连接蛋白37、Ig独特型、p15、gp75、GM2和GD2神经节苷脂、病毒产物诸如人乳头状瘤病毒蛋白、Smad家族肿瘤抗原、Imp-1、NA、EBV编码的核抗原(EBNA)-1、脑糖原磷酸化酶、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1CT-7、c-erbB-2、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD37、CD56、CD70、CD74、CD138、AGS16、MUC1、GPNMB、Ep-CAM、PD-L1、PD-L2、PMSA和BCMA (TNFRSF17)。在一些实施方案中，所述FAP结合剂包含结合这些肿瘤抗原中的一者或多者的靶向部分。
在一些实施方案中，本发明的多特异性FAP结合剂识别并结合至FAP以及在肿瘤细胞上的抗原。在一些实施方案中，所述多特异性FAP结合剂直接或间接地将CTL募集至所述肿瘤细胞或肿瘤微环境。
在一些实施方案中，本发明的多特异性FAP结合剂具有靶向两种不同的细胞(例如，以形成突触)或相同的细胞(例如，以得到更浓的信号传导剂效果)的靶向部分。
在一些实施方案中，本发明技术的多特异性FAP结合剂包含具有特异性地结合至与T细胞相关的靶标(例如抗原、受体)的抗原识别结构域的靶向部分。在一些实施方案中，所述靶向部分直接或间接地募集T细胞。在一个实施方案中，所述抗原识别结构域特异性地结合至效应T细胞。在一些实施方案中，所述抗原识别结构域直接或间接地募集效应T细胞，例如，在一些实施方案中，募集至治疗部位(例如，具有一个或多个疾病细胞或者为了治疗效果而加以调节的细胞的位置)。说明性效应T细胞包括细胞毒性T细胞(例如αβTCR、CD3+、CD8+、CD45R0+)；CD4+效应T细胞(例如αβTCR、CD3+、CD4+、CCR7+、CD62L高、IL-7R/CD127+)；CD8+效应T细胞(例如αβTCR、CD3+、CD8+、CCR7+、CD62L高、IL-7R/CD127+)；效应记忆T细胞(例如CD62L低、CD44+、TCR、CD3+、IL-7R/CD127+、IL-15R+、CCR7低)；中枢记忆T细胞(例如CCR7+、CD62L+、CD27+；或CCR7高、CD44+、CD62L高、TCR、CD3+、IL-7R/CD127+、IL-15R+)；CD62L+效应T细胞；CD8+效应记忆T细胞(TEM)，包括早期效应记忆T细胞(CD27+CD62L-)和晚期效应记忆T细胞(CD27-CD62L-)(分别是TemE和TemL)；CD127(+)CD25(低/-)效应T细胞；CD127(-)CD25(-)效应T细胞；CD8+干细胞记忆效应细胞(TSCM)(例如CD44(低)CD62L(高)CD122(高)sca(+))；TH1效应T细胞(例如CXCR3+、CXCR6+和CCR5+；或αβTCR、CD3+、CD4+、IL-12R+、IFNγR+、CXCR3+)、TH2效应T细胞(例如CCR3’、CCR4’和CCR8+；或αβTCR、CD3+、CD4+、IL-4R+、IL-33R+、CCR4+、IL-17RB+、CRTH2+)；TH9效应T细胞(例如αβTCR、CD3+、CD4+)；TH17效应T细胞(例如αβTCR、CD3+、CD4+、IL-23R+、CCR6+、IL-1R+)；CD4+CD45RO+CCR7+效应T细胞、ICOS+效应T细胞；CD4+CD45RO+CCR7(-)效应T细胞；和分泌IL-2、IL-4和/或IFN-γ的效应T细胞。
说明性目标T细胞抗原包括例如(并且在适当时包括细胞外结构域)：CD8、CD3、SLAMF4、IL-2Rα、4-1BB/TNFRSF9、IL-2Rβ、ALCAM、B7-1、IL-4R、B7-H3、BLAME/SLAMFS、CEACAM1、IL-6R、CCR3、IL-7Rα、CCR4、CXCRI/IL-S RA、CCR5、CCR6、IL-10Rα、CCR 7、IL-10Rβ、CCRS、IL-12Rβ1、CCR9、IL-12Rβ2、CD2、IL-13Rα1、IL-13、CD3、CD4、ILT2/CDS5j、I LT3/CDS5k、ILT4/CDS5d、ILT5/CDS5a、鲁特格林(lutegrin)a 4/CD49d、CDS、整合素a E/CD103、CD6、整合素αM/CD 11b、CDS、整合素αX/CD11c、整合素β2/CDIS、KIR/CD15S、CD27/TNFRSF7、KIR2DL1、CD2S、KIR2DL3、CD30/TNFRSFS、KIR2DL4/CD15Sd、CD31/PECAM-1、KIR2DS4、CD40配体/TNFSF5、LAG-3、CD43、LAIR1、CD45、LAIR2、CDS3、白三烯B4-R1、CDS4/SLAMF5、NCAM-L1、CD94、NKG2A、CD97、NKG2C、CD229/SLAMF3、NKG2D、CD2F-10/SLAMF9、NT-4、CD69、NTB-A/SLAMF6、普通γ链/IL-2Rγ、骨调素、CRACC/SLAMF7、PD-1、CRTAM、PSGL-1、CTLA-4、RANK/TNFRSF11A、CX3CR1、CX3CL1、L-选择素、CXCR3、SIRPβ1、CXCR4、SLAM、CXCR6、TCCR/WSX-1、DNAM-1、促胸腺生成素、EMMPRIN/CD147、TIM-1、EphB6、TIM-2、Fas/TNFRSF6、TIM-3、Fas配体/TNFSF6、TIM-4、Fcy RIII/CD16、TIM-6、TNFR1/TNFRSF1A、粒溶素、TNF RIII/TNFRSF1B、TRAIL RI/TNFRSFIOA、ICAM-1/CD54、TRAIL R2/TNFRSF10B、ICAM-2/CD102、TRAILR3/TNFRSF10C、IFN-γR1、TRAILR4/TNFRSF10D、IFN-γR2、TSLP、IL-1R1和TSLP R。在一些实施方案中，所述FAP结合剂包含结合这些说明性T细胞抗原中的一者或多者的靶向部分。
在一些实施方案中，本发明技术的多特异性FAP结合剂包含针对CD8的靶向部分，所述靶向部分是包含具有四个“框架区”或FR和三个“互补决定区”或CDR的单个氨基酸链的VHH。如本文所使用，“框架区”或“FR”是指可变结构域中位于CDR之间的区域。如本文所使用，“互补决定区”或“CDR”是指VHH中含有能够特异性地结合至抗原性靶标的氨基酸序列的可变区。
在一些实施方案中，本发明技术的多特异性FAP结合剂包含针对CD8的VHH，所述VHH具有包含至少一个CD8 CDR1、CD8 CDR2和/或CD8 CDR3序列的可变结构域。
在一些实施方案中，所述CD8 CDR1序列选自SEQ ID NO:192或SEQ ID NO:193。
在一些实施方案中，所述CD8 CDR2序列选自SEQ ID NO:194或SEQ ID NO:195。
在一些实施方案中，所述CD8 CDR3序列选自SEQ ID NO:196或SEQ ID NO:197或SEQ ID NO:198。
在一些实施方案中，所述CD8靶向部分包含选自以下序列的氨基酸序列：R3HCD27(SEQ ID NO:199)；或R3HCD129(SEQ ID NO:200)；或R2HCD26(SEQ ID NO:201)。
在一些实施方案中，所述CD8靶向部分包含具有可变结构域的VHH，所述可变结构域包含如下文所描述的至少一个CD8 CDR1、CD8 CDR2和/或CD8 CDR3序列。
在一些实施方案中，所述CD8 CDR1序列选自SEQ ID NO:202至SEQ ID NO:270。
在一些实施方案中，所述CD8 CDR2序列选自SEQ ID NO:271至SEQ ID NO:339。
在一些实施方案中，所述CD8 CDR3序列选自SEQ ID NO:340至SEQ ID NO:408。
在一些实施方案中，所述CD8靶向部分包含选自以下序列的氨基酸序列：1CDA 7(SEQ ID NO:409)；或1CDA 12(SEQ ID NO:410)；或1CDA 14(SEQ ID NO:411)；或1CDA 15(SEQ ID NO:412)；或1CDA 17(SEQ ID NO:413)；或1CDA 18(SEQ ID NO:414)；或1CDA 19(SEQ ID NO:415)；或1CDA 24(SEQ ID NO:416)；或1CDA 26(SEQ ID NO:417)；或1CDA 28(SEQ ID NO:418)；或1CDA 37(SEQ ID NO:419)；或1CDA 43(SEQ ID NO:420)；或1CDA 45(SEQ ID NO:421)；或1CDA 47(SEQ ID NO:422)；或1CDA 48(SEQ ID NO:423)；或1CDA 58(SEQ ID NO:424)；或1CDA 65(SEQ ID NO:425)；或1CDA 68(SEQ ID NO:426)；或1CDA 73(SEQ ID NO:427)；或1CDA 75(SEQ ID NO:428)；或1CDA 86(SEQ ID NO:429)；或1CDA 87(SEQ ID NO:430)；或1CDA 88(SEQ ID NO:431)；或1CDA 89(SEQ ID NO:432)；或1CDA 92(SEQ ID NO:433)；或1CDA 93(SEQ ID NO:434)；或2CDA 1(SEQ ID NO:435)；或2CDA 5(SEQID NO:436)；或2CDA 22(SEQ ID NO:437)；或2CDA 28(SEQ ID NO:438)；或2CDA 62(SEQ IDNO:439)；或2CDA 68(SEQ ID NO:440)；或2CDA 73(SEQ ID NO:441)；或2CDA 74(SEQ IDNO:442)；或2CDA 75(SEQ ID NO:443)；或2CDA 77(SEQ ID NO:444)；或2CDA 81(SEQ IDNO:445)；或2CDA 87(SEQ ID NO:446)；或2CDA 88(SEQ ID NO:447)；或2CDA 89(SEQ IDNO:448)；或2CDA 91(SEQ ID NO:449)；或2CDA 92(SEQ ID NO:450)；或2CDA 93(SEQ IDNO:451)；或2CDA 94(SEQ ID NO:452)；或2CDA 95(SEQ ID NO:453)；或3CDA 3(SEQ ID NO:454)；或3CDA 8(SEQ ID NO:455)；或3CDA 11(SEQ ID NO:456)；或3CDA 18(SEQ ID NO:457)；或3CDA 19(SEQ ID NO:458)；或3CDA 21(SEQ ID NO:459)；或3CDA 24(SEQ ID NO:460)；或3CDA 28(SEQ ID NO:461)；或3CDA 29(SEQ ID NO:462)；或3CDA 31(SEQ ID NO:463)；或3CDA 32(SEQ ID NO:464)；或3CDA 33(SEQ ID NO:465)；或3CDA 37(SEQ ID NO:466)；或3CDA 40(SEQ ID NO:467)；或3CDA 41(SEQ ID NO:468)；或3CDA 48(SEQ ID NO:469)；或3CDA 57(SEQ ID NO:470)；或3CDA 65(SEQ ID NO:471)；或3CDA 70(SEQ ID NO:472)；或3CDA 73(SEQ ID NO:473)；或3CDA 83(SEQ ID NO:474)；或3CDA 86(SEQ ID NO:475)；或3CDA 88(SEQ ID NO:476)；或3CDA 90(SEQ ID NO:477)。
在各个说明性实施方案中，所述CD8靶向部分包含选自以上任一序列的氨基酸序列，而没有末端组氨酸标签序列(即，HHHHHH；SEQ ID NO:43)。
在一些实施方案中，所述CD8靶向部分包含在美国专利公布号2014/0271462中所描述的氨基酸序列，所述专利公布的全部内容以引用方式并入。在一些实施方案中，所述CD8靶向部分包含在美国专利公布号2014/0271462的表0.1、表0.2、表0.3和/或图1A-图121中所描述的氨基酸序列，所述专利公布的全部内容以引用方式并入。在一些实施方案中，所述CD8靶向部分包含SEQ ID NO:478或479的HCDR1和/或SEQ ID NO:478或479的HCDR2和/或SEQ ID NO:478或479的HCDR3，和/或SEQ ID NO:480的LCDR1和/或SEQ ID NO:480的LCDR2和/或SEQ ID NO:480的LCDR3。
在一些实施方案中，本发明技术设想使用如本文所描述的针对CD8的靶向部分的任何天然或合成的类似物、突变体、变体、等位基因、同系物和直系同源物(本文中统称为“类似物”)。在一些实施方案中，所述针对CD8的靶向部分的氨基酸序列还包括氨基酸类似物、氨基酸衍生物或其他非经典氨基酸。
在一些实施方案中，本发明技术的多特异性FAP结合剂包含具有特异性地结合至与B细胞相关的靶标(例如抗原、受体)的抗原识别结构域的靶向部分。在一些实施方案中，所述靶向部分直接或间接地募集B细胞，例如，募集至治疗部位(例如，具有一个或多个疾病细胞或者为了治疗效果而加以调节的细胞的位置)。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，所述B细胞抗原包括例如CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD38、CD39、CD40、CD70、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CD78、CD79a/b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD89、CD98、CD126、CD127、CDw130、CD138、CDw150和B细胞成熟抗原(BCMA)。在一些实施方案中，所述FAP结合剂包含结合以上公开的B细胞抗原中的一者或多者的靶向部分。
在一些实施方案中，本发明技术的多特异性FAP结合剂包含具有特异性地结合至与自然杀伤细胞相关的靶标(例如抗原、受体)的抗原识别结构域的靶向部分。在一些实施方案中，所述靶向部分直接或间接地募集自然杀伤细胞，例如募集至治疗部位(例如，具有一个或多个疾病细胞或者为了治疗效果而加以调节的细胞的位置)。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，所述自然杀伤细胞抗原包括例如TIGIT、2B4/SLAMF4、KIR2DS4、CD155/PVR、KIR3DL1、CD94、LMIR1/CD300A、CD69、LMIR2/CD300c、CRACC/SLAMF7、LMIR3/CD300LF、Kidα、DNAM-1、LMIR5/CD300LB、Fc-εRII、LMIR6/CD300LE、Fc-y RI/CD64、MICA、Fc-y RIIB/CD32b、MICB、Fc-y RIIC/CD32c、MULT-1、Fc-y RIIA/CD32a、结合素-2/CD112、Fc-yRIII/CD16、NKG2A、FcRH1/IRTA5、NKG2C、FcRH2/IRTA4、NKG2D、FcRH4/IRTA1、NKp30、FcRH5/IRTA2、NKp44、Fc-受体样蛋白3/CD16-2、NKp46/NCR1、NKp80/KLRF1、NTB-A/SLAMF6、Rae-1、Rae-1a、Rae-1p、Rae-1δ、H60、Rae-1ε、ILT2/CD85j、Rae-1y、ILT3/CD85k、TREM-1、ILT4/CD85d、TREM-2、ILT5/CD85a、TREM-3、KIR/CD158、TREML1/TLT-1、KIR2DL1、ULBP-1、KIR2DL3、ULBP-2、KIR2DL4/CD158d和ULBP-3。在一些实施方案中，所述FAP结合剂包含结合以上公开的NK细胞抗原中的一者或多者的靶向部分。
在一些实施方案中，所述靶向部分识别和/或结合FMS样酪氨酸激酶3(Flt3)或者是Flt3的天然配体，诸如FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)或其截短区域(例如，其能够结合Flt3)。在一些实施方案中，所述靶向部分是Flt3L的细胞外结构域。在一些实施方案中，所述靶向部分包含Flt3L结构域，其中所述Flt3L结构域是单链二聚体，任选地其中一个Flt3L结构域经由一个或多个接头连接至另一Flt3L结构域，其中所述接头是柔性接头。
在一些实施方案中，本发明技术的多特异性FAP结合剂包含具有特异性地结合至与巨噬细胞/单核细胞相关的靶标(例如抗原、受体)的抗原识别结构域的靶向部分。在一些实施方案中，所述靶向部分直接或间接地募集巨噬细胞/单核细胞，例如募集至治疗部位(例如，具有一个或多个疾病细胞或者为了治疗效果而加以调节的细胞的位置)。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，所述巨噬细胞/单核细胞抗原包括例如SIRP1a、B7-1/CD80、ILT4/CD85d、B7-H1、ILT5/CD85a、普通3链、整合素a 4/CD49d、BLAME/SLAMF8、整合素aX/CDllc、CCL6/C10、整合素3 2/CD18、CD155/PVR、整合素3 3/CD61、CD31/PECAM-1、胶乳素、CD36/SR-B3、白三烯B4 R1、CD40/TNFRSF5、LIMPIIISR-B2、CD43、LMIR1/CD300A、CD45、LMIR2/CD300c、CD68、LMIR3/CD300LF、CD84/SLAMF5、LMIR5/CD300LB、CD97、LMIR6/CD300LE、CD163、LRP-1、CD2F-10/SLAMF9、MARCO、CRACC/SLAMF7、MD-1、ECF-L、MD-2、EMMPRIN/CD147、MGL2、内皮素/CD105、骨激活素/GPNMB、Fc-y RI/CD64、骨调素、Fc-y RIIB/CD32b、PD-L2、Fc-y RIIC/CD32c、Siglec-3/CD33、Fc-y RIIA/CD32a、SIGNR1/CD209、Fc-y RIII/CD16、SLAM、GM-CSF R a、TCCR/WSX-1、ICAM-2/CD102、TLR3、IFN-yRI、TLR4、IFN-γR2、TREM-I、IL-I RII、TREM-2、ILT2/CD85j、TREM-3、ILT3/CD85k、TREML1/TLT-1、2B4/SLAMF 4、IL-10R a、ALCAM、IL-10R p、氨基肽酶N/ANPEP、ILT2/CD85j、普通3链、ILT3/CD85k、Clq R1/CD93、ILT4/CD85d、CCR1、ILT5/CD85a、CCR2、CD206、整合素a 4/CD49d、CCR5、整合素a M/CDII b、CCR8、整合素a X/CDllc、CD155/PVR、整合素3 2/CD18、CD14、整合素133/CD61、CD36/SR-B3、LAIR1、CD43、LAIR2、CD45、白三烯B4-R1、CD68、LIMPIIISR-B2、CD84/SLAMFS、LMIR1/CD300A、CD97、LMIR2/CD300c、CD163、LMIR3/CD300LF、凝血因子III/组织因子、LMIR5/CD300LB、CX3CR1、CX3CL1、LMIR6/CD300LE、CXCR4、LRP-1、CXCR6、M-CSF R、DEP-1/CD148、MD-1、DNAM-1、MD-2、EMMPRIN/CD147、MMR、内皮素/CD105、NCAM-L1、Fc-y RI/CD64、PSGL-1、Fc-yRIIIICD16、RP105、G-CSF R、L-选择素、GM-CSF Ra、Siglec-3/CD33、HVEM/TNFRSF14、SLAM、ICAM-1/CD54、TCCR/WSX-1、ICAM-2/CD102、TREM-I、IL-6R、TREM-2、CXCRI/IL-8RA、TREM-3和TREMLITTLT-1。在一些实施方案中，所述FAP结合剂包含结合以上公开的巨噬细胞/单核细胞抗原中的一者或多者的靶向部分。
在一些实施方案中，本发明技术的多特异性FAP结合剂包含具有特异性地结合至与树突状细胞相关的靶标(例如抗原、受体)的抗原识别结构域的靶向部分。在一些实施方案中，所述靶向部分直接或间接地募集树突状细胞，例如，募集至治疗部位(例如，具有一个或多个疾病细胞或者为了治疗效果而加以调节的细胞的位置)。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，所述树突状细胞(DC)抗原包括例如FAP、XCR1、RANK、CD36/SRB3、LOX-1/SR-EI、CD68、MARCO、CD163、SR-A1/MSR、CD5L、SREC-1、CL-PI/C0LEC12、SREC-II、LIMPIIISRB2、RP105、TLR4、TLR1、TLR5、TLR2、TLR6、TLR3、TLR9、4-IBB配体/TNFSF9、IL-12/IL-23p40、4-氨基-1,8-萘二甲酰胺、ILT2/CD85j、CCL21/6Ckine、ILT3/CD85k、8-氧代基-dG、ILT4/CD85d、8D6A、ILT5/CD85a、A2B5、鲁特格林a 4/CD49d、Aag、整合素p 2/CD18、AMICA、朗格汉斯蛋白(Langerin)、B7-2/CD86、白三烯B4 RI、B7-H3、LMIR1/CD300A、BLAME/SLAMF8、LMIR2/CD300c、Clq R1/CD93、LMIR3/CD300LF、CCR6、LMIR5/CD300LB CCR7、LMIR6/CD300LE、CD40/TNFRSF5、MAG/Siglec-4-a、CD43、MCAM、CD45、MD-1、CD68、MD-2、CD83、MDL-1/CLEC5A、CD84/SLAMF5、MMR、CD97、NCAMLI、CD2F-10/SLAMF9、骨激活素GPNMB、Chern 23、PD-L2、CLEC-1、RP105、CLEC-2、CLEC-8、Siglec-2/CD22、CRACC/SLAMF7、Siglec-3/CD33、DC-SIGN、DEC-205、Siglec-5、DC-SIGNR/CD299、Siglec-6、DCAR、Siglec-7、DCIR/CLEC4A、Siglec-9、DEC-205、Siglec-10、Dectin-1/CLEC7A、Siglec-F、Dectin-2/CLEC6A、SIGNR1/CD209、DEP-1/CD148、SIGNR4、DLEC、SLAM、EMMPRIN/CD147、TCCR/WSX-1、Fc-y R1/CD64、TLR3、Fc-y RIIB/CD32b、TREM-1、Fc-y RIIC/CD32c、TREM-2、Fc-y RIIA/CD32a、TREM-3、Fc-y RIII/CD16、TREML1/TLT-1、ICAM-2/CD102、DEC205和辣椒素R1。在一些实施方案中，所述FAP结合剂包含结合以上公开的DC抗原中的一者或多者的靶向部分。
在一些实施方案中，本发明的嵌合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物包含靶向部分，所述靶向部分包含与本文公开的序列中的任一者具有至少60％同一性的氨基酸序列。举例来说，在一些实施方案中，所述嵌合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物包含靶向部分，所述靶向部分包含与本文公开的序列中的任一者具有至少约60％、至少约61％、至少约62％、至少约63％、至少约64％、至少约65％、至少约66％、至少约67％、至少约68％、至少约69％、至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或100％同一性(例如，与本文公开的序列中的任一者具有约60％、或约61％、或约62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、约99％或约100％序列同一性)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明技术的多特异性FAP结合剂包含具有特异性地结合至选自但不限于巨核细胞、血小板、红细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的免疫细胞上的靶标(例如抗原、受体)的抗原识别结构域的靶向部分。在一些实施方案中，所述抗原识别结构域直接或间接地募集巨核细胞、血小板、红细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞，例如募集至治疗部位(例如，具有一个或多个疾病细胞或者为了治疗效果而加以调节的细胞的位置)。
在一些实施方案中，本发明技术的多特异性FAP结合剂包含具有特异性地结合至与巨核细胞和/或血小板相关的靶标(例如抗原、受体)的抗原识别结构域的靶向部分。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，所述巨核细胞和/或血小板细胞抗原包括例如GP11b/111a、GP1b、vWF、PF4和TSP。在一些实施方案中，所述FAP结合剂包含结合以上公开的巨核细胞和/或血小板抗原中的一者或多者的靶向部分。
在一些实施方案中，本发明技术的多特异性FAP结合剂包含具有特异性地结合至与红细胞相关的靶标(例如抗原、受体)的抗原识别结构域的靶向部分。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，所述红细胞抗原包括例如CD34、CD36、CD38、CD41a(血小板糖蛋白11b/111a)、CD41b(GPllb)、CD71(转铁蛋白受体)、CD105、血型糖蛋白A、血型糖蛋白C、c-kit、HLA-DR、H2(MHC-I1)和恒河猴抗原。在一些实施方案中，所述FAP结合剂包含结合以上公开的红细胞抗原中的一者或多者的靶向部分。
在一些实施方案中，本发明技术的多特异性FAP结合剂包含具有特异性地结合至与肥大细胞相关的靶标(例如抗原、受体)的抗原识别结构域的靶向部分。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，所述肥大细胞抗原包括例如SCFR/CD117、Fca、CD2、CD25、CD35、CD88、CD203c、C5R1、CMAI、FCERIA、FCER2、TPSABI。在一些实施方案中，所述FAP结合剂包含结合以上公开的肥大细胞抗原中的一者或多者的靶向部分。
在一些实施方案中，本发明技术的多特异性FAP结合剂包含具有特异性地结合至与嗜碱性粒细胞相关的靶标(例如抗原、受体)的抗原识别结构域的靶向部分。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，所述嗜碱性粒细胞抗原包括例如Fca、CD203c、CD123、CD13、CD107a、CD107b和CD164。在一些实施方案中，所述FAP结合剂包含结合以上公开的嗜碱性粒细胞抗原中的一者或多者的靶向部分。
在一些实施方案中，本发明技术的多特异性FAP结合剂包含具有特异性地结合至与嗜中性粒细胞相关的靶标(例如抗原、受体)的抗原识别结构域的靶向部分。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，所述嗜中性粒细胞抗原包括例如7D5、CD10/CALLA、CD13、CD16(FcRlll)、CD18蛋白(LFA-1、CR3和p150、95)、CD45、CD67和CD177。在一些实施方案中，所述FAP结合剂包含结合以上公开的嗜中性粒细胞抗原中的一者或多者的靶向部分。
在一些实施方案中，本发明技术的多特异性FAP结合剂包含具有特异性地结合至与嗜酸性粒细胞相关的靶标(例如抗原、受体)的抗原识别结构域的靶向部分。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，所述嗜酸性粒细胞抗原包括例如CD35、CD44和CD69。在一些实施方案中，所述FAP结合剂包含结合以上公开的嗜酸性粒细胞抗原中的一者或多者的靶向部分。
在一些实施方案中，本发明技术的多特异性FAP结合剂包含具有特异性地结合至本领域技术人员已知的任何适当抗原或受体或细胞表面标记物的抗原识别结构域的靶向部分。在一些实施方案中，所述抗原或细胞表面标记物是组织特异性标记物。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，所述组织特异性标记物包括但不限于内皮细胞表面标记物(诸如例如ACE、CD14、CD34、CDH5、ENG、ICAM2、MCAM、NOS3、PECAMI、PROCR、SELE、SELP、TEK、THBD、VCAMI、VWF)；平滑肌细胞表面标记物(诸如例如ACTA2、MYHIO、MYHI 1、MYH9、MYOCD)；成纤维细胞(基质)细胞表面标记物(诸如例如ALCAM、CD34、COLIAI、COL1A2、COL3A1、FAP、PH-4)；上皮细胞表面标记物(诸如例如CDID、K61RS2、KRTIO、KRT13、KRT17、KRT18、KRT19、KRT4、KRT5、KRT8、MUCI、TACSTDI)；新生血管标记物(诸如例如CD13、TFNA、α-vβ-3(av33)、E-选择素)；以及脂肪细胞表面标记物(诸如例如ADIPOQ、FABP4和RETN)。在一些实施方案中，所述FAP结合剂包含结合以上公开的抗原中的一者或多者的靶向部分。
在一些实施方案中，本发明技术的多特异性FAP结合剂包含具有特异性地结合至T细胞上表达的检查点标记物的抗原识别结构域的靶向部分。在一些实施方案中，所述检查点标记物是选自PD-1、CD28、CTLA4、ICOS、BTLA、KIR、LAG3、CD137、OX40、CD27、CD4OL、TIM3和A2aR的一种或多种检查点标记物。
在一些实施方案中，本发明技术的多特异性FAP结合剂包含具有特异性地结合至检查点标记物的抗原识别结构域的靶向部分。在一些实施方案中，所述检查点标记物是选自PD-1/PD-L1或PD-L2、CD28/CD80或CD86、CTLA4/CD80或CD86、ICOS/ICOSL或B7RP1、BTLA/HVEM、KIR、LAG3、CD137/CD137L、OX40/OX4OL、CD27、CD4OL、TIM3/Ga19和A2aR的一种或多种检查点标记物。
作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，本发明的多特异性FAP结合剂包含(i)针对CD8的靶向部分；(ii)针对T细胞上表达的检查点标记物的靶向部分，所述检查点标记物是例如PD-1、CD28、CTLA4、ICOS、BTLA、KIR、LAG3、CD137、0X40、Cd27、CD4OL、TIM3和A2aR中的一者或多者；和/或(iii)针对肿瘤细胞的靶向部分，以及本文所描述的经修饰的(例如突变的)信号传导剂中的任一种。
在一些实施方案中，本发明的多特异性FAP结合剂具有一个或多个针对PD-1的靶向部分。在一些实施方案中，所述FAP结合剂具有一个或多个选择性地结合PD-1多肽的靶向部分。在一些实施方案中，所述FAP结合剂包含一个或多个选择性地结合PD-1多肽的抗体、抗体衍生物或形式、肽或多肽或融合蛋白。
在一些实施方案中，本发明技术的多特异性FAP结合剂包含针对PD-1的VHH，所述VHH具有包含至少一个PD-1CDR1、PD-1CDR2和/或PD-1CDR3序列的可变结构域。
在一些实施方案中，所述PD-1CDR1序列选自SEQ ID NO:481至SEQ ID NO:494。
在一些实施方案中，所述PD-1CDR2序列选自SEQ ID NO:495至SEQ ID NO:508。
在一些实施方案中，所述PD-1CDR3序列选自SEQ ID NO:509至SEQ ID NO:521。
在各个说明性实施方案中，所述PD-1靶向部分包含选自以下序列的氨基酸序列：2PD23：(SEQ ID NO:522)；或2PD26：(SEQ ID NO:523)；或2PD90：(SEQ ID NO:524)；或2PD-106：(SEQ ID NO:525)；或2PD-16：(SEQ ID NO:526)；或2PD71：(SEQ ID NO:527)；或2PD-152：(SEQ ID NO:528)；或2PD-12：(SEQ ID NO:529)；或3PD55：(SEQ ID NO:530)；或3PD82：(SEQ ID NO:531)；或2PD8：(SEQ ID NO:532)；或2PD27：(SEQ ID NO:533)；或2PD82：(SEQID NO:534)；或
3PD36：(SEQ ID NO:535)。
在各个说明性实施方案中，所述PD-1靶向部分包含选自以上任一者的氨基酸序列，而没有末端组氨酸标签序列(即，没有HHHHHH；SEQ ID NO:43)。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含抗PD-1抗体喷罗珠单抗(pembrolizumab)(又名MK-3475、)或其片段。在一些实施方案中，所述靶向部分是喷罗珠单抗和其他人源化抗PD-1抗体中的一者或多者，它们公开于Hamid等人(2013)New EnglandJournal of Medicine 369(2):134-44、US 8,354,509和WO 2009/114335，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，用于本文提供的方法中的喷罗珠单抗或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列(SEQ ID NO:536)的重链和/或含有氨基酸序列(SEQ ID NO:537)的轻链。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含抗PD-1抗体纳武单抗(nivolumab)(又名BMS-936558、MDX-1106、ONO-4538、)或其片段。在一些实施方案中，所述靶向部分是纳武单抗(克隆5C4)和其他特异性地结合至PD-1的人单克隆抗体中的一者或多者，它们公开于US 8,008,449和WO 2006/121168中，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，用于本文提供的方法中的纳武单抗或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列(SEQ ID NO:538)的重链和/或含有氨基酸序列(SEQ IDNO:539)的轻链。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含抗PD-1抗体皮地利珠单抗(pidilizumab)(又名CT-011、hBAT或hBAT-1)或其片段。在一些实施方案中，皮地利珠单抗和其他人源化抗PD-I单克隆抗体选自公开于以下文献中的皮地利珠单抗和其他人源化抗PD-I单克隆抗体：US 2008/0025980和WO 2009/101611，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，用于本文提供的方法中的抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含一个或多个轻链可变区，所述一个或多个轻链可变区包含选自US 2008/0025980中公开的以下序列的氨基酸序列：(SEQ ID NO:540)；(SEQ ID NO:541)；(SEQ IDNO:542)；和(SEQ ID NO:543)；和/或重链，所述重链包含选自US 2008/0025980中公开的以下序列的氨基酸序列：(SEQ ID NO:544)；(SEQ ID NO:545)；(SEQ ID NO:546)；(SEQ IDNO:547)；和(SEQ ID NO:548)。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含含有(SEQ ID NO:549)的轻链和含有(SEQID NO:550)的重链。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含AMP-514(又名MEDI-0680)。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含PD-L2-Fc融合蛋白AMP-224或其片段，其公开于WO 2010/027827和WO 2011/066342中，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。在一些实施方案中，所述靶向部分包含(SEQ ID NO:551)和/或含有(SEQ ID NO:552)的B7-DC融合蛋白。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含肽AUNP 12或US 2011/0318373或US 8,907,053中公开的任何其他肽。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，所述靶向部分包含以下的AUNP 12序列：
SNTSESFK(SNTSESF)FRVTQLAPKAQIKE—NH2(SEQ ID NO:553)
(即，US 2011/0318373的化合物8)。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含US 2014/0044738中公开的抗PD-1抗体1E3或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，用于本文提供的方法中的1E3或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列(SEQ IDNO:554)的重链可变区和/或含有氨基酸序列(SEQ ID NO:555)的轻链可变区。
在一个实施方案中，所述靶向部分包含US 2014/0044738中公开的抗PD-1抗体1E8或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，用于本文提供的方法中的1E8或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列(SEQ IDNO:556)的重链可变区和/或含有氨基酸序列(SEQ ID NO:557)的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含US 2014/0044738中公开的抗PD-1抗体1H3或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，用于本文提供的方法中的1H3或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列(SEQ IDNO:558)的重链可变区；
和/或含有氨基酸序列(SEQ ID NO:559)的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含US 8,907,065和WO 2008/071447中公开的针对PD-1的VHH，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，针对PD-1的VHH包含US 8,907,065中公开的以下序列中的一者或多者：(SEQ ID NO:560)；(SEQ ID NO:561)；(SEQ ID NO:562)；(SEQ ID NO:563)；或(SEQ ID NO:564)。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含US 2011/0271358和WO 2010/036959中公开的抗PD-1抗体或其片段中的任一者，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，用于本文提供的方法中的抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链包含一个或多个选自US 2011/0271358中的以下序列的氨基酸序列：(SEQID NO:565)；(SEQ ID NO:566)；(SEQ ID NO:567)；(SEQ ID NO:568)；或(SEQ ID NO:569)；和/或轻链，所述轻链包含一个或多个选自US 2011/0271358中的以下序列的氨基酸序列：(SEQ ID NO:570)；(SEQ ID NO:571)；(SEQ ID NO:572)；或(SEQ ID NO:573)。
在一些实施方案中，本发明的多特异性FAP结合剂包含一个或多个选自TSR-042(Tesaro,Inc.)、REGN2810(Regeneron Pharmaceu ticals,Inc.)、PDR001(NovartisPharmaceuticals)和BGB-A317(BeiG ene Ltd.)的针对PD-1的抗体或其抗体片段。
在一些实施方案中，本发明的多特异性FAP结合剂具有一个或多个针对PD-L1的靶向部分。在一些实施方案中，所述FAP结合剂具有一个或多个选择性结合PD-L1多肽的靶向部分。在一些实施方案中，所述FAP结合剂包含一个或多个选择性地结合PD-L1多肽的抗体、抗体衍生物或形式、肽或多肽或者融合蛋白。
在一些实施方案中，本发明技术的多特异性FAP结合剂包含针对PD-L1的VHH，所述VHH具有包含至少一个PD-L1 CDR1、PD-L1CDR2和/或PD-L1 CDR3序列的可变结构域。
在一些实施方案中，所述PD-L1 CDR1序列选自SEQ ID NO:574至SEQ ID NO:604。
在一些实施方案中，所述PD-L1 CDR2序列选自SEQ ID NO:605至SEQ ID NO:635。
在一些实施方案中，所述PD-L1 CDR3序列选自SEQ ID NO:636至SEQ ID NO:666。
在一些实施方案中，所述PD-L1靶向部分包含选自以下序列的氨基酸序列：2LIG2：(SEQ ID NO:667)；或2LIG3：(SEQ ID NO:668)；或2LIG16：(SEQ ID NO:669)；或2LIG22：(SEQ ID NO:670)；或2LIG27：(SEQ ID NO:671)；或2LIG29：(SEQ ID NO:672)；或2LIG30：(SEQ ID NO:673)；或2LIG34：(SEQ ID NO:674)；或2LIG35：(SEQ ID NO:675)；或2LIG48：(SEQ ID NO:676)；或2LIG65：(SEQ ID NO:677)；或2LIG85：(SEQ ID NO:678)；或2LIG86：(SEQ ID NO:679)；或2LIG89：(SEQ ID NO:680)；或2LIG97：(SEQ ID NO:681)；或2LIG99：(SEQ ID NO:682)；或2LIG109：(SEQ ID NO:683)；或2LIG127：(SEQ ID NO:684)；或2LIG139：(SEQ ID NO:685)；或2LIG176：(SEQ ID NO:686)；或2LIG189：(SEQ ID NO:687)；或3LIG3：(SEQ ID NO:688)；或3LIG7：(SEQ ID NO:689)；或3LIG8：(SEQ ID NO:690)；或3LIG9：(SEQ ID NO:691)；或3LIG18：(SEQ ID NO:692)；或3LIG20：(SEQ ID NO:693)；或3LIG28：(SEQ ID NO:694)；或3LIG29：(SEQ ID NO:695)；或3LIG30：(SEQ ID NO:696)；或3LIG33：(SEQ ID NO:697)。
在一些实施方案中，所述PD-L1靶向部分包含选自以上任一序列的氨基酸序列，而没有末端组氨酸标签序列(即，HHHHHH；SEQ ID NO:43)。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含抗PD-L1抗体MED14736(又名度伐鲁单抗(durvalumab))或其片段。MED14736对PD-L1具有选择性，并且阻断PD-L1与PD-1和CD80受体的结合。在一些实施方案中，用于本文提供的方法中的MED14736及其抗原结合片段包含重链和轻链或重链可变区和轻链可变区。MED14736的序列公开于WO/2016/06272中，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，用于本文提供的方法中的MED14736或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列(SEQ ID NO:698)的重链和/或含有氨基酸序列(SEQ ID NO:699)的轻链。
在一些实施方案中，用于本文提供的方法中的MED14736或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列(SEQ ID NO:885)的重链可变区和/或含有氨基酸序列(SEQ ID NO:886)的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含抗PD-L1抗体阿特朱单抗(atezolizumab)(又名MPDL3280A、RG7446)或其片段。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，用于本文提供的方法中的阿特朱单抗或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列(SEQ ID NO:887)的重链和/或含有氨基酸序列(SEQ ID NO:888)的轻链。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含抗PD-L1抗体阿维鲁单抗(avelumab)(又名MSB0010718C)或其片段。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，用于本文提供的方法中的阿维鲁单抗或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列(SEQ ID NO:889)的重链和/或含有氨基酸序列(SEQ ID NO:890)的轻链。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含US 2013/0309250和WO 2007/005874中公开的抗PD-L1抗体BMS-936559(又名12A4、MDX-1105)或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，用于本文提供的方法中的BMS-936559或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列(SEQ ID NO:891)的重链可变区和/或含有氨基酸序列(SEQ ID NO:892)的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含US 2013/0309250和WO 2007/005874中所公开的抗PD-L1抗体3G10或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，用于本文提供的方法中的3G10或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列(SEQ ID NO:893)的重链可变区和/或含有氨基酸序列(SEQ ID NO:894)的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含US 2013/0309250和WO 2007/005874中所公开的抗PD-L1抗体10A5或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，用于本文提供的方法中的10A5或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列(SEQ ID NO:895)的重链可变区和/或含有氨基酸序列(SEQ ID NO:896)的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含US 2013/0309250和WO 2007/005874中所公开的抗PD-L1抗体5F8或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，用于本文提供的方法中的5F8或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列(SEQ ID NO:897)的重链可变区和/或含有氨基酸序列(SEQ ID NO:898)的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含US 2013/0309250和WO 2007/005874中所公开的抗PD-L1抗体10H10或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，用于本文提供的方法中的10H10或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列(SEQ ID NO:899)的重链可变区和/或含有氨基酸序列(SEQ ID NO:900)的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含US 2013/0309250和WO 2007/005874中所公开的抗PD-L1抗体1B12或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，用于本文提供的方法中的1B12或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列(SEQ ID NO:901)的重链可变区和/或含有氨基酸序列(SEQ ID NO:902)的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含US 2013/0309250和WO 2007/005874中所公开的抗PD-L1抗体7H1或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，用于本文提供的方法中的7H1或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列(SEQ ID NO:903)的重链可变区和/或含有氨基酸序列(SEQ ID NO:904)的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含US 2013/0309250和WO 2007/005874中所公开的抗PD-L1抗体11E6或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，用于本文提供的方法中的11E6或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列(SEQ ID NO:905)的重链可变区和/或含有氨基酸序列(SEQ ID NO:906)的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含US 2013/0309250和WO 2007/005874中所公开的抗PD-L1抗体12B7或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，用于本文提供的方法中的12B7或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列(SEQ ID NO:907)的重链可变区和/或含有氨基酸序列(SEQ ID NO:908)的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含US 2013/0309250和WO 2007/005874中所公开的抗PD-L1抗体13G4或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，用于本文提供的方法中的13G4或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列(SEQ ID NO:909)的重链可变区和/或含有氨基酸序列(SEQ ID NO:910)的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含US 2014/0044738中公开的抗PD-L1抗体1E12或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，用于本文提供的方法中的1E12或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列(SEQ ID NO:911)的重链可变区；
和/或含有氨基酸序列(SEQ ID NO:912)的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含US 2014/0044738中公开的抗PD-L1抗体1F4或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，用于本文提供的方法中的1F4或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列(SEQ ID NO:913)的重链可变区和/或含有氨基酸序列(SEQ ID NO:914)的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含US 2014/0044738中公开的抗PD-L1抗体2G11或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，用于本文提供的方法中的2G11或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列(SEQ ID NO:700)的重链可变区和/或含有氨基酸序列(SEQ ID NO:701)的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含US 2014/0044738中公开的抗PD-L1抗体3B6或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，用于本文提供的方法中的3B6或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列(SEQ ID NO:702)的重链可变区；
和/或含有氨基酸序列(SEQ ID NO:703)的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含US 2014/0044738和WO 2012/145493中公开的抗PD-L1抗体3D10或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，用于本文提供的方法中的3D10或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列(SEQ ID NO:704)的重链可变区和/或含有氨基酸序列(SEQ ID NO:705)的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含US 2011/0271358和WO 2010/036959中公开的抗PD-L1抗体中的任一者，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，用于本文提供的方法中的抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链包含一个或多个选自US 2011/0271358中的以下序列的氨基酸序列：(SEQ ID NO:706)；(SEQ ID NO:707)；(SEQ ID NO:708)；(SEQ ID NO:709)；或(SEQ ID NO:710)；和/或轻链，所述轻链包含一个或多个选自US 2011/0271358中的以下序列的氨基酸序列：(SEQID NO:711)；(SEQ ID NO:712)；(SEQ ID NO:713)；或(SEQ ID NO:714)。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含WO 2011/066389、US 8,779,108和US2014/0356353中公开的抗PD-L1抗体2.7A4或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，用于本文提供的方法中的2.7A4或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列(SEQ ID NO:715)的重链可变区和/或含有氨基酸序列(SEQ ID NO:716)的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含WO 2011/066389、US 8,779,108和US2014/0356353中公开的抗PD-L1抗体2.9D10或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，用于本文提供的方法中的2.9D10或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列(SEQ ID NO:717)的重链可变区和/或含有氨基酸序列(SEQ ID NO:718)的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含WO 2011/066389、US 8,779,108和US2014/0356353中公开的抗PD-L1抗体2.14H9或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，用于本文提供的方法中的2.14H9或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列(SEQ ID NO:719)的重链可变区和/或含有氨基酸序列(SEQ ID NO:720)的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含WO 2011/066389、US 8,779,108和US2014/0356353中公开的抗PD-L1抗体2.20A8或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，用于本文提供的方法中的2.20A8或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列(SEQ ID NO:721)的重链可变区和/或含有氨基酸序列(SEQ ID NO:722)的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含WO 2011/066389、US 8,779,108和US2014/0356353中公开的抗PD-L1抗体3.15G8或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，用于本文提供的方法中的3.15G8或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列(SEQ ID NO:723)的重链可变区和/或含有氨基酸序列(SEQ ID NO:724)的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含WO 2011/066389、US 8,779,108和US2014/0356353中公开的抗PD-L1抗体3.18G1或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，用于本文提供的方法中的3.18G1或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列(SEQ ID NO:725)的重链可变区和/或含有氨基酸序列(SEQ ID NO:726)的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含WO 2011/066389、US 8,779,108和US2014/0356353中公开的抗PD-L1抗体2.7A4OPT或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，用于本文提供的方法中的2.7A4OPT或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列(SEQ ID NO:727)的重链可变区和/或含有氨基酸序列(SEQ ID NO:728)的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含如WO 2011/066389、US 8,779,108和US2014/0356353中公开的抗PD-L1抗体2.14H90PT或其片段，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，用于本文提供的方法中的2.14H90PT或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列(SEQ ID NO:729)的重链可变区和/或含有氨基酸序列(SEQ ID NO:730)的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含WO 2016/061142中公开的抗PD-L1抗体中的任一者，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，用于本文提供的方法中的抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链包含一个或多个选自WO 2016/061142中的以下序列的氨基酸序列：(SEQ ID NO:731)；(SEQ ID NO:732)；(SEQ ID NO:733)；(SEQ ID NO:734)；(SEQ ID NO:735)；(SEQ ID NO:736)；(SEQ IDNO:737)；(SEQ ID NO:738)；或(SEQ ID NO:739)；和/或轻链，所述轻链包含一个或多个选自WO 2016/061142中的以下序列的氨基酸序列：(SEQ ID NO:740)；(SEQ ID NO:741)；(SEQID NO:742)；(SEQ ID NO:743)；(SEQ ID NO:744)；(SEQ ID NO:745)；(SEQ ID NO:746)；(SEQ ID NO:747)；或(SEQ ID NO:748)。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含WO 2016/022630中公开的抗PD-L1抗体中的任一者，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，用于本文提供的方法中的抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链包含一个或多个选自WO 2016/022630中的以下序列的氨基酸序列：(SEQ ID NO:749)；(SEQ ID NO:750)；(SEQ ID NO:751)；(SEQ ID NO:752)；(SEQ ID NO:753)；(SEQ ID NO:754)；(SEQ IDNO:755)；(SEQ ID NO:756)；(SEQ ID NO:757)；(SEQ ID NO:758)；(SEQ ID NO:759)；(SEQID NO:760)；和/或轻链，所述轻链包含一个或多个选自WO2016/022630中的以下序列的氨基酸序列：(SEQ ID NO:761)；(SEQ ID NO:762)；(SEQ ID NO:763)；(SEQ ID NO:764)；(SEQID NO:765)；(SEQ ID NO:766)；(SEQ ID NO:767)；(SEQ ID NO:768)；(SEQ ID NO:769)；(SEQ ID NO:770)；(SEQ ID NO:771)；和(SEQ ID NO:772)。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含WO 2015/112900中公开的抗PD-L1抗体中的任一者，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，用于本文提供的方法中的抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链包含一个或多个选自WO 2015/112900中的以下序列的氨基酸序列：(SEQ ID NO:773)；(SEQ ID NO:774)；(SEQ ID NO:775)；或(SEQ ID NO:776)；和/或轻链，所述轻链包含一个或多个选自WO2015/112900中的以下序列的氨基酸序列：(SEQ ID NO:777)；(SEQ ID NO:778)；(SEQ IDNO:779)；(SEQ ID NO:780)；(SEQ ID NO:781)；(SEQ ID NO:782)；(SEQ ID NO:783)；(SEQID NO:784)；或(SEQ ID NO:785)。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含WO 2010/077634和US 8,217,149中公开的抗PD-L1抗体中的任一者，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，用于本文提供的方法中的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包含含有氨基酸序列(SEQ ID NO:786)的重链区和/或含有氨基酸序列(SEQ ID NO:787)的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含可获自如US 20120039906中所公开的可在CNCM寄存编号CNCM 1-4122、CNCM 1-4080和CNCM 1-4081下获取的杂交瘤的抗PD-L1抗体中的任一者，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含US 8,907,065和WO 2008/071447中公开的针对PD-L1的VHH，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，针对PD-L1的VHH包含US 8,907,065中的以下序列中的一者或多者：(SEQ ID NO:788)；(SEQ ID NO:789)；(SEQ ID NO:790)；(SEQ ID NO:791)；(SEQ ID NO:792)；和(SEQ ID NO:793)。
在一些实施方案中，本发明的多特异性FAP结合剂具有一个或多个针对PD-L2的靶向部分。在一些实施方案中，所述FAP结合剂具有一个或多个选择性结合PD-L2多肽的靶向部分。在一些实施方案中，所述FAP结合剂包含一个或多个选择性地结合PD-L2多肽的抗体、抗体衍生物或形式、肽或多肽或者融合蛋白。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含US 8,907,065和WO 2008/071447中公开的针对PD-L2的VHH，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，针对PD-1的VHH包含US 8,907,065中的以下序列中的一者或多者：(SEQID NO:794)；(SEQ ID NO:795)；(SEQ ID NO:796)；(SEQ ID NO:797)；(SEQ ID NO:798)；(SEQ ID NO:799)；和(SEQ ID NO:800)。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含如US2011/0271358和W02010/036959中所公开的抗PD-L2抗体中的任一者，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，用于本文提供的方法中的抗体或其抗原结合片段包含重链，所述重链包含一个或多个选自US 2011/0271358中的以下序列的氨基酸序列：(SEQ ID NO:801)；(SEQ ID NO:802)；(SEQ ID NO:803)；(SEQ ID NO:804)；或(SEQ ID NO:805)；和/或轻链，所述轻链包含一个或多个选自US 2011/0271358中的以下序列的氨基酸序列：(SEQID NO:806)；(SEQ ID NO:807)；(SEQ ID NO:808)；或(SEQ ID NO:809)。
在一些实施方案中，本发明技术的靶向部分包含与本文公开的序列中的任一者具有至少约60％、至少约61％、至少约62％、至少约63％、至少约64％、至少约65％、至少约66％、至少约67％、至少约68％、至少约69％、至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或100％同一性(例如，与本文公开的序列中的任一者具有约60％、或约61％、或约62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、约99％或约100％序列同一性)的靶向PD-1、PD-L1和/或PD-L2的序列。
在一些实施方案中，本发明技术的靶向部分可以包含如本文所公开的靶向PD-1、PD-L1和/或PD-L2的重链、轻链、重链可变区、轻链可变区、互补性决定区(CDR)和框架区序列的任何组合。
在一些实施方案中，所述靶向部分是选择性地结合或靶向PD-1、PD-L1和/或PD-L2的一种或多种抗体、抗体衍生物或形式、肽或多肽或者融合蛋白，它们公开于以下文献中：WO 2011/066389、US 2008/0025980、US 2013/0034559、US 8,779,108、US 2014/0356353、US 8,609,089、US 2010/028330、US 2012/0114649、WO 2010/027827、WO 2011,/066342、US8,907,065、WO 2016/062722、WO 2009/101611、W02010/027827、WO 2011/066342、WO 2007/005874、WO 2001/014556、US2011/0271358、WO 2010/036959、WO 2010/077634、US 8,217,149、US 2012/0039906、WO 2012/145493、US 2011/0318373、美国专利号8,779,108、US20140044738、WO 2009/089149、WO 2007/00587、WO 2016061142、WO 2016,02263、WO 2010/077634和WO 2015/112900，所述文献的全部公开内容特此以引用方式并入。
在一些实施方案中，本发明技术的多特异性FAP结合剂包含具有特异性地结合至例如树突状细胞上的XCR1的抗原识别结构域的靶向部分。在一些实施方案中，本发明技术的多特异性FAP结合剂包含具有包含XCL1的全部或部分的抗原识别结构域的靶向部分。
在一些实施方案中，所述多特异性FAP结合剂存在具有特异性地结合至作为非细胞结构的一部分的靶标(例如抗原、受体)的识别结构域的靶向部分。在一些实施方案中，所述抗原或受体不是完整细胞或细胞结构的组成组分。在一些实施方案中，所述抗原或受体是细胞外抗原或受体。在一些实施方案中，所述靶标是非蛋白质非细胞标记物，包括但不限于核酸，包括DNA或RNA，诸如例如从坏死的肿瘤细胞或细胞外沉积物诸如胆固醇释放的DNA。
在一些实施方案中，目标靶标(例如抗原、受体)是基质或细胞外基质(ECM)的非细胞组分的一部分或与所述非细胞组分相关的标记物。如本文所使用，基质是指组织或器官的连接和支撑构架。基质可以包括细胞诸如成纤维细胞/成肌纤维细胞、神经胶质、上皮、脂肪、免疫、血管、平滑肌和免疫细胞以及细胞外基质(ECM)和细胞外分子的汇集。在一些实施方案中，目标靶标(例如抗原、受体)是基质诸如细胞外基质和细胞外分子的非细胞组分的一部分。如本文所使用，ECM是指所有组织和器官内存在的非细胞组分。ECM是由生物化学上独特的组分，包括但不限于蛋白质、糖蛋白、蛋白聚糖和多糖的大集合构成。ECM的这些组分通常由相邻的细胞产生并且经由胞吐作用分泌至ECM中。一旦分泌后，ECM组分便往往聚集而形成复杂的巨分子网状结构。在一些实施方案中，本发明技术的嵌合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物包含识别位于ECM的任何组分上的靶标(例如抗原或受体或非蛋白质分子)的靶向部分。ECM的说明性组分包括但不限于蛋白聚糖、非蛋白聚糖多糖、纤维和其他ECM蛋白质或ECM非蛋白质，例如多糖和/或脂质，或ECM相关分子(例如蛋白质或非蛋白质，例如多糖、核酸和/或脂质)。
在一些实施方案中，所述靶向部分识别ECM蛋白聚糖上的靶标(例如抗原、受体)。蛋白聚糖是糖基化的蛋白质。碱性蛋白聚糖单元包括具有一个或多个共价连接的糖胺聚糖(GAG)链的核心蛋白质。蛋白聚糖具有净负电荷，由此吸引带正电的钠离子(Na+)，后者经由渗透作用吸引水分子，从而保持ECM和驻留细胞含水。蛋白聚糖还可能有助于捕获和存储ECM内的生长因子。本发明技术的嵌合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物可以靶向的说明性蛋白聚糖包括但不限于硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素和硫酸角质素。在一个实施方案中，所述靶向部分识别非蛋白聚糖多糖诸如透明质酸上的靶标(例如抗原、受体)。
在一些实施方案中，所述靶向部分识别ECM纤维上的靶标(例如抗原、受体)。ECM纤维包括胶原蛋白纤维和弹性蛋白纤维。在一些实施方案中，所述靶向部分识别胶原蛋白或胶原蛋白纤维上的一个或多个表位。胶原蛋白是ECM中最丰富的蛋白质。胶原蛋白呈纤维状蛋白形式存在于ECM中并且提供结构支撑以驻留细胞。在一个或多个实施方案中，所述靶向部分识别并且结合至ECM内存在的各种类型的胶原蛋白，包括但不限于纤维状胶原蛋白(I型、II型、Ill型、V型、XI型)、间杂有三螺旋的原纤维相关的胶原蛋白(facit collagen)(IX型、XII型、XIV型)、短链胶原蛋白(VIII型、X型)、基底膜胶原蛋白(IV型)和/或VI型、VII型或XIII型胶原蛋白。弹性蛋白纤维给组织提供弹性，允许它们在需要时拉伸然后回到它们的原始状态。在一些实施方案中，所述靶向部分识别弹性蛋白或弹性蛋白纤维上的一个或多个表位。
在一些实施方案中，所述靶向部分识别一种或多种ECM蛋白质，包括但不限于肌腱蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白、层粘连蛋白(laminin)或巢蛋白(nidogen)/内联蛋白(entactin)。
在一些实施方案中，所述靶向部分识别并结合至肌腱蛋白。肌腱蛋白(TN)家族的糖蛋白包括至少四个成员，即肌腱蛋白C、肌腱蛋白R、肌腱蛋白X和肌腱蛋白W。肌腱蛋白的一级结构包括若干个普通基序，所述基序按顺序处于同一连续序列中：氨基端七价重复序列、表皮生长因子(EGF)样重复序列、纤连蛋白III型结构域重复序列和羧基端纤维蛋白原样球形结构域。每一个蛋白质成员与EGF样重复序列和纤连蛋白III型重复序列的数目和特性的典型变异相关。同种型变体还特别相对于肌腱蛋白C存在。已知肌腱蛋白C的超过27种剪接变体和/或同种型。在特定实施方案中，所述靶向部分识别并结合至肌腱蛋白CA1。类似地，肌腱蛋白R还具有不同的剪接变体和同种型。肌腱蛋白R通常呈二聚体或三聚体形式存在。肌腱蛋白X是肌腱蛋白家族中最大的成员，并且已知呈三聚体形式存在。肌腱蛋白W呈三聚体形式存在。在一些实施方案中，所述靶向部分识别肌腱蛋白上的一个或多个表位。在一些实施方案中，所述靶向部分识别肌腱蛋白的单体和/或二聚体和/或三聚体和/或六聚体形式。
在一个实施方案中，所述靶向部分识别并结合至纤连蛋白。纤连蛋白是连接细胞与ECM中的胶原蛋白纤维，从而允许细胞移动通过ECM的糖蛋白。在结合至整合素后，纤连蛋白展开从而形成功能二聚体。在一些实施方案中，所述靶向部分识别纤连蛋白的单体和/或二聚体形式。在一些实施方案中，所述靶向部分识别纤连蛋白上的一个或多个表位。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，所述靶向部分识别纤连蛋白细胞外结构域A(EDA)或纤连蛋白细胞外结构域B(EDB)。EDA水平升高与各种疾病和病症相关，所述疾病和病症包括牛皮癣、类风湿性关节炎、糖尿病和癌症。在一些实施方案中，所述靶向部分识别含有EDA同种型的纤连蛋白，并且可以用于使所述嵌合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物靶向病变细胞，包括癌细胞。在一些实施方案中，所述靶向部分识别含有EDB同种型的纤连蛋白。在一些实施方案中，此类靶向部分可以用于使所述嵌合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物靶向肿瘤细胞，包括肿瘤新生血管。
在一些实施方案中，所述靶向部分识别并结合至纤维蛋白。纤维蛋白是ECM的基质网状结构中经常发现的另一种蛋白质物质。纤维蛋白是由于纤维蛋白原上引起纤维蛋白聚合的蛋白酶凝血酶的作用而形成。在一些实施方案中，所述靶向部分识别纤维蛋白上的一个或多个表位。在一些实施方案中，所述靶向部分识别纤维蛋白的单体以及聚合形式。
在一些实施方案中，所述靶向部分识别并结合至层粘连蛋白。层粘连蛋白是基底层的主要组分，所述基底层是细胞和器官的蛋白质网状结构的基础。层粘连蛋白是含有a链、3链和y链的异源三聚体蛋白。在一些实施方案中，所述靶向部分识别层粘连蛋白上的一个或多个表位。在一些实施方案中，所述靶向部分识别层粘连蛋白的单体、二聚体以及三聚体形式。
在一些实施方案中，所述靶向部分识别并结合至巢蛋白或内联蛋白。巢蛋白/内联蛋白是高度保守的硫酸化糖蛋白家族。它们组成了基底膜的主要结构组分，并且功能是连接基底膜中的层粘连蛋白与胶原蛋白IV网状结构。这个家族的成员包括巢蛋白-1和巢蛋白-2。在一些实施方案中，所述靶向部分识别巢蛋白-1和/或巢蛋白-2上的表位。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含识别本文所描述的靶标中的任一者上存在的表位的抗原识别结构域。在一些实施方案中，所述抗原识别结构域识别所述蛋白质上存在的一个或多个线性表位。如本文所使用，线性表位是指所述蛋白质上存在的任何连续氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗原识别结构域识别所述蛋白质上存在的一个或多个构象表位。如本文所使用，构象表位是指形成具有能够被抗原识别结构域识别的特征和/或形状和/或三级结构的三维表面的一个或多个氨基酸区段(可能是不连续的)。
在一些实施方案中，所述靶向部分结合至本文所描述的任一者的全长和/或成熟形式和/或同种型和/或剪接变体和/或片段和/或任何其他天然存在的或合成的类似物、变体或突变体。在一些实施方案中，所述靶向部分可以结合至本文所描述的蛋白质的任何形式，包括单体、二聚体、三聚体、四聚体、异源二聚体、多聚体和缔合形式。在一些实施方案中，所述靶向部分可以结合至本文所描述的蛋白质的任何翻译修饰后的形式，诸如糖基化和/或磷酸化形式。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含识别细胞外分子诸如DNA的抗原识别结构域。在一些实施方案中，所述靶向部分包含识别DNA的抗原识别结构域。在一些实施方案中，所述DNA从坏死或凋亡的肿瘤细胞或其他病变细胞脱落至细胞外间隙中。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含识别一个或多个与动脉粥样硬化斑块相关的非细胞结构的抗原识别结构域。已知两种类型的动脉粥样硬化斑块。纤维脂质(纤维脂肪)斑块的特征是载满脂质的细胞积聚在动脉内膜下面。内皮下面有覆盖所述斑块的动脉粥样化核心的纤维帽。所述核心包括具有升高的组织胆固醇和胆固醇酯含量的载满脂质的细胞(巨噬细胞和平滑肌细胞)、纤维蛋白、蛋白聚糖、胶原蛋白、弹性蛋白和细胞碎屑。在晚期斑块中，所述斑块的中心核心通常含有细胞外胆固醇沉积物(从死细胞释放)，所述细胞外胆固醇沉积物形成具有中空针样裂缝的胆固醇晶体的区域。在所述斑块外围是较年轻的泡沫状细胞和毛细管。纤维性斑块还局部化在内膜下、在动脉壁内，从而引起壁变厚和膨胀，并且有时引起内腔的多斑局部化变窄与一定程度的肌肉层萎缩。纤维性斑块含有胶原蛋白纤维(嗜酸性)，使钙(嗜苏木精性)和载满脂质的细胞沉淀。在一些实施方案中，所述靶向部分识别并结合至这些斑块的一种或多种非细胞组分，诸如纤维蛋白、蛋白聚糖、胶原蛋白、弹性蛋白、细胞碎屑和钙或其他无机沉积物或沉淀物。在一些实施方案中，所述细胞碎屑是从死细胞释放的核酸，例如DNA或RNA。
在一些实施方案中，所述靶向部分包含识别与神经退行性疾病相关的脑斑块中发现的一个或多个非细胞结构的抗原识别结构域。在一些实施方案中，所述靶向部分识别并结合至位于阿尔茨海默氏病患者脑中发现的淀粉样斑块中的一个或多个非细胞结构。举例来说，所述靶向部分可以识别并且结合至作为淀粉样斑块的主要组分的肽淀粉样β。在一些实施方案中，所述靶向部分识别并结合至位于亨廷顿氏病患者中发现的脑斑块中的一个或多个非细胞结构。在一些实施方案中，所述靶向部分识别并结合至与其他神经退行性或肌肉骨骼疾病诸如路易体痴呆和包涵体肌炎相关的斑块中发现的一个或多个非细胞结构。
接头和官能团
在一些实施方案中，所述FAP结合剂可以包括一个或多个官能团、残基或部分。在一些实施方案中，所述一个或多个官能团、残基或部分连接或基因融合至本文所描述的信号传导剂或靶向部分中的任一者。在一些实施方案中，此类官能团、残基或部分赋予本发明技术的FAP结合剂以一种或多种所期望的性质或功能性。此类官能团和用于将它们引入至FAP结合剂中的技术的实例在本领域中是已知的，举例来说，参见Remington'sPharmaceutical Sciences,第16版,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.(1980)。
在一些实施方案中，所述FAP结合剂可以通过与另一种剂缀合和/或融合以延长半衰期或以其他方式改善药效学和药物动力学性质。在一些实施方案中，所述FAP结合剂可以与PEG、XTEN(例如呈rPEG形式)、聚唾液酸(POLYXEN)、白蛋白(例如，人血清白蛋白或HAS)、弹性蛋白样蛋白(ELP)、PAS、HAP、GLK、CTP、转铁蛋白等等中的一者或多者融合或缀合。在一些实施方案中，个别嵌合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物中的每一者与BioDrugs(2015)29:215-239中所描述的剂中的一者或多者融合，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。
在一些实施方案中，所述官能团、残基或部分包含合适的药理学上可接受的聚合物，诸如聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物(诸如甲氧基聚(乙二醇)或mPEG)。在一些实施方案中，PEG部分的连接增加半衰期和/或降低FAP结合蛋白的免疫原性。一般来说，可以使用聚乙二醇化的任何合适的形式，诸如本领域中用于抗体和抗体片段的聚乙二醇化(包括但不限于单结构域抗体，诸如VHH)；参见例如Chapman,Nat.Biotechnol.,54,531-545(2002)；Veronese和Harris,Adv.Drug Deliv.Rev.54,453-456(2003)；Harris和Chess,Nat.Rev.Drug.Discov.,2,(2003)和W004060965，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。用于蛋白质的聚乙二醇化的各种试剂还可以得自市面，例如，得自美国的NektarTherapeutics。在一些实施方案中，使用定点聚乙二醇化，具体而言，经由半胱氨酸残基(参见例如Yang等人,Protein Engineering,16,10,761-770(2003)，所述文献的全部内容特此以引用方式并入)。举例来说，出于这个目的，PEG可以连接至本发明技术的FAP结合剂中天然存在的半胱氨酸残基。在一些实施方案中，本发明技术的FAP结合剂经过修饰以便适当地引入一个或多个供连接PEG用的半胱氨酸残基，或者包含一个或多个供连接PEG用的半胱氨酸残基的氨基酸序列可以使用本领域中已知的技术融合至所述FAP结合剂的氨基和/或羧基端。
在一些实施方案中，所述官能团、残基或部分包含N连接或O连接的糖基化。在一些实施方案中，引入所述N连接或O连接的糖基化作为共翻译和/或翻译后修饰的一部分。
在一些实施方案中，所述官能团、残基或部分包含一个或多个可检测标记或其他信号产生基团或部分。合适的标记和适用于连接、使用和检测它们的技术在本领域中是已知的，并且包括但不限于荧光标记(诸如荧光素、异硫氰酸酯、罗丹明、藻红素、藻青素、别藻蓝素、邻苯二甲醛以及荧光胺和荧光金属诸如Eu或其他镧系金属)、磷光标记、化学发光标记或生物发光标记(诸如鲁米那(luminal)、异鲁米诺(isoluminol)、热性吖啶酯(theromatic acridinium ester)、咪唑、吖啶盐、草酸酯、二氧杂环丁烷或GFP以及它们的类似物)、放射性同位素、金属、金属螯合物或金属阳离子或者特别适用于体内、体外或原位诊断和成像的其他金属或金属阳离子，以及发色团和酶(诸如苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-V-类固醇异构酶、酵母乙醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、生物素亲和素过氧化物酶、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、尿素酶、催化酶、葡萄糖-VI-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰化胆碱脂酶)。其他合适的标记包括可以使用NMR或ESR光谱加以检测的部分。本发明技术的此类标记的VHH和多肽可以例如用于体外、体内或原位测定(包括本身已知的免疫测定，诸如ELISA，RIA、EIA和其他“夹心测定”等)以及体内诊断和成像目的，取决于对具体标记的选择。
在一些实施方案中，所述官能团、残基或部分包含连接或基因融合至所述FAP结合剂的标签。在一些实施方案中，所述FAP结合剂可以包括单个标签或多个标签。举例来说，所述标签是不抑制或防止FAP结合剂与FAP或任何其他目标抗原诸如肿瘤抗原的结合的肽、糖或DNA分子。在一些实施方案中，所述标签是至少约：三个至五个氨基酸长、五个至八个氨基酸长、八个至十二个氨基酸长、十二个至十五个氨基酸长或十五个至二十个氨基酸长。说明性标签描述于诸如美国专利公布号US2013/0058962。在一些实施方案中，所述标签是亲和力标签，诸如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和组氨酸(His)标签。在一个实施方案中，所述FAP结合剂包含His标签。
在一些实施方案中，所述官能团、残基或部分包含螯合基团，例如，以螯合金属或金属阳离子之一。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，所述螯合基团是二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。
在一些实施方案中，所述官能团、残基或部分包含作为特异性结合对，诸如生物素-(链霉)亲和素结合对的一个部分的官能团。这种官能团可以用来连接本发明技术的FAP结合剂与跟所述结合对的另一半结合(即，通过形成结合对)的另一个蛋白质、多肽或化学化合物。举例来说，在一些实施方案中，本发明技术的FAP结合剂可以缀合至生物素，并且连接至与亲和素或链霉亲和素缀合的另一个蛋白质、多肽、化合物或载体。举例来说，这种缀合的FAP结合剂可以用作例如诊断系统中的报告基因，其中可检测信号产生剂缀合至亲和素或链霉亲和素。此类结合对还可以例如用于使FAP结合剂结合至载体，包括适用于药物目的的载体。一个非限制性实例是Cao和Suresh,Journal of Drug Targeting,8,4,257(2000)所描述的脂质体制剂。此类结合对还可以用于连接治疗活性剂与本发明技术的FAP结合剂。
在一些实施方案中，本发明的FAP结合剂任选地包含一个或多个接头。在一些实施方案中，所述FAP结合剂包括连接各结合区和/或靶向部分的接头。在一些实施方案中，所述FAP结合剂包括连接各信号传导剂和靶向部分(或者在存在超过一个靶向部分时将信号传导剂连接至所述靶向部分之一)的接头。在一些实施方案中，所述接头可以用于连接如本文所描述的各种官能团、残基或部分与FAP结合剂。在一些实施方案中，所述接头是不影响或降低结合区和结合蛋白的稳定性、取向、结合、中和和/或清除率特征的单个氨基酸或多个氨基酸。在一些实施方案中，所述接头选自肽、蛋白质、糖或核酸。
在一些实施方案中，本发明的FAP结合剂包含连接所述靶向部分和所述信号传导剂的接头。在其他实施方案中，所述基于Fc的嵌合蛋白复合物包含将靶向部分连接至Fc结构域的接头或将信号传导部分连接至Fc结构域的接头。在一些实施方案中，本发明的嵌合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物包含处于所述信号传导剂内的接头(例如，在单链TNF的情况下，所述嵌合蛋白可以包含两个接头以产生三聚体)。
本发明技术设想多种接头序列的用途。在一些实施方案中，所述接头可以来源于天然存在的多结构域蛋白或者是如例如以下文献中所描述的经验接头：Chichili等人,(2013),Protein Sci.22(2):153-167；Chen等人,(2013),Adv Drug Deliv Rev.65(10):1357-1369，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。在一些实施方案中，可以使用接头设计数据库和计算机程序，诸如以下文献中所描述的那些来设计所述接头：Chen等人,(2013),Adv Drug Deliv Rev.65(10):1357-1369和Crasto等人,(2000),Protein Eng.13(5):309-312，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。在一些实施方案中，所述接头可以是功能性的。举例来说但不限于，所述接头可以发挥功能以改善本发明的FAP结合剂的折叠和/或稳定性，改善表达，改善药物动力学，并且/或者改善生物活性。
在一些实施方案中，所述接头是多肽。在一些实施方案中，所述接头少于约100个氨基酸长。举例来说，在一些实施方案中，所述接头是少于约100、约95、约90、约85、约80、约75、约70、约65、约60、约55、约50、约45、约40、约35、约30、约25、约20、约19、约18、约17、约16、约15、约14、约13、约12、约11、约10、约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3、或约2个氨基酸长。在一些实施方案中，所述接头是多肽。在一些实施方案中，所述接头超过约100个氨基酸长。举例来说，在一些实施方案中，所述接头是超过约100、约95、约90、约85、约80、约75、约70、约65、约60、约55、约50、约45、约40、约35、约30、约25、约20、约19、约18、约17、约16、约15、约14、约13、约12、约11、约10、约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3、或约2个氨基酸长。在一些实施方案中，所述接头是柔性的。在另一个实施方案中，所述接头是刚性的。
在一些实施方案中，所述接头长度允许靶向部分和信号传导剂与其受体的有效结合。举例来说，在一些实施方案中，所述接头长度允许所述靶向部分中的一个和所述信号传导剂与相同细胞上的受体的有效结合以及另一个靶向部分与另一个细胞的有效结合。本文其他部分提供了说明性细胞对。
在一些实施方案中，所述接头长度至少等于所述靶向部分中的一个和所述信号传导剂与相同细胞上的受体的结合位点之间的最小距离。在一些实施方案中，所述接头长度是所述靶向部分中的一个和所述信号传导剂与相同细胞上的受体的结合位点之间的最小距离的至少两倍、或三倍、或四倍、或五倍、或十倍、或二十倍、或25倍、或50倍、或一百倍、或更多倍。
在一些实施方案中，一个接头将两个靶向部分彼此连接并且这种接头具有较短长度，而一个接头连接靶向部分和信号传导剂，这种接头比连接两个靶向部分的接头更长。举例来说，在一些实施方案中，连接两个靶向部分的接头与连接靶向部分和信号传导剂的接头之间的氨基酸长度差异可以是约100、约95、约90、约85、约80、约75、约70、约65、约60、约55、约50、约45、约40、约35、约30、约25、约20、约19、约18、约17、约16、约15、约14、约13、约12、约11、约10、约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3、或约2个氨基酸。在一些实施方案中，所述接头是柔性的。在另一个实施方案中，所述接头是刚性的。
在一些实施方案中，所述接头基本上由甘氨酸和丝氨酸残基构成(例如约30％、或约40％、或约50％、或约60％、或约70％、或约80％、或约90％、或约95％、或约97％甘氨酸和丝氨酸)。举例来说，在一些实施方案中，所述接头是(Gly4Ser)n，其中n是约1至约8，例如1、2、3、4、5、6、7或8(SEQ ID NO:810至SEQ ID NO:817)。在一些实施方案中，所述接头序列是GGSGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:818)。在一些实施方案中，所述接头包括但不限于具有序列LE、GGGGS(SEQ ID NO:810)、(GGGGS)n(n＝1-4)(SEQ ID NO:810-813)、(Gly)8(SEQ ID NO:819)、(Gly)6(SEQ ID NO:820)、(EAAAK)n(n＝1-3)(SEQ ID NO:821-823):、A(EAAAK)nA(n＝2-5)(SEQ ID NO:824-827)、AEAAAKEAAAKA(SEQ ID NO:824)、A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A(SEQID NO:828)、PAPAP(SEQ ID NO:829)、KESGSVSSEQLAQFRSLD(SEQ ID NO:830)、EGKSSGSGSESKST(SEQ ID NO:831)、GSAGSAAGSGEF(SEQID NO:832)和(XP)n的接头，其中X表示任何氨基酸，例如Ala、Lys或Glu。在一些实施方案中，所述接头是GGS。
在一些实施方案中，所述接头是GGGSE(SEQ ID NO:833)、GSESG(SEQ ID NO:834)、GSEGS(SEQ ID NO:835)、GEGGSGEGSSGEGSSSEGGGSEGGGSEGGGSEGGS(SEQ ID NO:836)和每四个氨基酸间隔随机放置G、S和E的接头中的一者或多者。
在一些实施方案中，所述接头是抗体(例如IgG、IgA、IgD和IgE，包括子类(例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，以及IgA1和IgA2))的铰链区。在一些实施方案中，所述接头是抗体(例如IgG、IgA、IgD和IgE，包括子类(例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，以及IgA1和IgA2))的铰链区。不希望受理论束缚，在一些实施方案中，IgG、IgA、IgD和IgE类抗体中发现的铰链区充当柔性间隔基，从而允许Fab部分在空间中自由移动。与恒定区相反，所述铰链结构域在结构上具有多样性，在序列和长度方面都因免疫球蛋白类别和子类而各异。举例来说，铰链区的长度和柔性因IgG子类而各异。IgG1的铰链区涵盖氨基酸216-231，而且因为它自由灵活，Fab片段可以关于其对称轴旋转并且在以两个重链间二硫桥中的第一个为中心的球体内移动。
IgG2具有比IgG1短的铰链，具有12个氨基酸残基和四个二硫桥。IgG2的铰链区缺乏甘氨酸残基，相对较短，并且含有通过额外的重链间二硫桥加以稳定的刚性聚脯氨酸双螺旋。这些性质约束了IgG2分子的柔性。IgG3因其独特的延长铰链区(长达IgG1铰链的约四倍)，含有62个氨基酸(包括21个脯氨酸和11个半胱氨酸)，形成非柔性聚脯氨酸双螺旋而不同于其他子类。在IgG3中，Fab片段相对远离Fc片段，从而赋予所述分子以更大的柔性。IgG3中的细长铰链还负责其与其他子类相比具有较高分子量。IgG4的铰链区比IgG1的短，并且其柔性介于IgG1与IgG2的柔性之间。铰链区的柔性按降序报告为IgG3>IgG1>IgG4>IgG2。
根据结晶学研究，免疫球蛋白铰链区可以在功能上进一步细分为三个区域：上铰链区、核心区和下铰链区。参见Shin等人,1992Immunological Reviews 130:87。上铰链区包括从CH1的羧基端至铰链中约束运动的第一个残基，一般是形成介于两个重链之间的链间二硫键的第一个半胱氨酸残基的氨基酸。上铰链区的长度与抗体的区段柔性相关。核心铰链区含有重链间二硫桥，而下铰链区接合CH2结构域的氨基端并且包括CH2中的残基。野生型人IgG1的核心铰链区含有序列Cys-Pro-Pro-Cys，所述序列当通过二硫键形成发生二聚时产生环状八肽，认为所述环状八肽充当枢轴，因此赋予柔性。在一些实施方案中，本发明的接头包含任何抗体(例如IgG、IgA、IgD和IgE，包括子类(例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，以及IgA1和IgA2))的上铰链区、核心区和下铰链区中的一者或两者或三者。铰链区还可以含有一个或多个糖基化位点，所述糖基化位点包括众多类型的结构独特的位点以供碳水化合物连接用。举例来说，IgA1含有铰链区的17个氨基酸区段内的五个糖基化位点，从而赋予铰链区多肽对肠蛋白酶的抗性，这被视为分泌免疫球蛋白的有利性质。在一些实施方案中，本发明技术的接头包含一个或多个糖基化位点。在一些实施方案中，所述接头是人IgG4抗体的铰链-CH2-CH3结构域。
在一些实施方案中，本发明的FAP结合剂连接至包含CH2和CH3结构域中的一者或两者和任选地铰链区的抗体Fc结构域。举例来说，编码作为单个核苷酸序列连接至Fc结构域的本发明技术FAP结合剂的载体可用于制备此类多肽。
在一些实施方案中，所述接头是合成的接头，诸如PEG。
在一些实施方案中，所述接头可以是功能性的。举例来说，在一些实施方案中，所述接头发挥功能以改善本发明的FAP结合剂的折叠和/或稳定性，改善表达，改善药物动力学，并且/或者改善生物活性。在另一个实例中，所述接头可以发挥功能以使所述FAP结合剂靶向特定的细胞类型或位置。
FAP结合剂的修饰和产生
在一些实施方案中，所述FAP结合剂包含作为VHH的靶向部分。在一些实施方案中，所述VHH不局限于特定的生物学来源或特定的制备方法。举例来说，所述VHH一般可以通过以下方式获得：(1)通过分离天然存在的重链抗体的VHH结构域；(2)通过表达编码天然存在的VHH结构域的核苷酸序列；(3)通过天然存在的VHH结构域的“人源化”或通过编码此类人源化VHH结构域的核酸的表达；(4)通过来自任何动物物种，诸如来自哺乳动物物种，诸如来自人类的天然存在的VH结构域的“骆驼化”，或通过编码此类骆驼化VH结构域的核酸的表达；(5)通过如本领域中所描述的“结构域抗体”或“Dab”的“骆驼化”，或通过编码此类骆驼化VH结构域的核酸的表达；(6)通过使用合成或半合成技术来制备本领域中已知的蛋白质、多肽或其他氨基酸序列；(7)通过使用本领域中已知的核酸合成技术来制备编码VHH的核酸，随后表达如此获得的核酸；和/或(8)通过上述一项或多项的任何组合。
在一个实施方案中，所述FAP结合剂包含对应于针对人FAP的天然存在的重链抗体的VHH结构域的VHH。在一些实施方案中，一般可以通过以下方式来产生或获得此类VHH序列：通过用FAP分子适当地使一种骆驼免疫(即，以便产生免疫应答和/或针对FAP的重链抗体)；通过从所述骆驼获得合适的生物样品(诸如血液样品或任何B细胞样品)；以及通过以所述样品为起始物，使用任何合适的已知技术来产生针对FAP的VHH序列。在一些实施方案中，针对FAP的天然存在的VHH结构域可以获自骆驼VHH序列的天然文库，举例来说，通过使用本领域中已知的一种或多种筛选技术，使用FAP或其至少一个部分、片段、抗原决定子或表位对此类文库进行筛选。举例来说，此类文库和技术描述于WO 9937681、WO 0190190、WO03025020和WO 03035694中，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。在一些实施方案中，可以使用来源于天然VHH文库的经过改善的合成或半合成文库，诸如通过诸如随机诱变和/或CDR改组的技术而获自天然VHH文库的VHH文库，如例如WO 0043507中所描述，所述文献的全部内容特此以引用方式并入。在一些实施方案中，用于获得针对FAP的VHH序列的另一种技术包括适当地使能够表达重链抗体的转基因哺乳动物免疫(即，以便产生免疫应答和/或针对FAP的重链抗体)，从所述转基因哺乳动物获得合适的生物样品(诸如血液样品，或任何B细胞样品)，然后使用任何合适的已知技术，以所述样品为起始物来产生针对FAP的VHH序列。举例来说，出于这个目的，可以使用WO 02085945中和WO 04049794中所描述的表达重链抗体的小鼠以及其他方法和技术(所述文献的全部内容特此以引用方式并入)。
在一个实施方案中，所述FAP结合剂包含已经“人源化”，即通过将天然存在的VHH序列的氨基酸序列中(且具体来说是框架序列中)的一个或多个氨基酸残基置换为来自人的常规4链抗体的VH结构域中对应位置上存在的一个或多个氨基酸残基的VHH。这可以使用本领域中已知的人源化技术来进行。在一些实施方案中，可能的人源化取代或人源化取代的组合可以通过本领域中已知的方法来确定，例如，通过在VHH的序列与天然存在的人VH结构域的序列之间进行比较。在一些实施方案中，对所述人源化取代进行选择，以使所得人源化VHH仍保留有利的功能性质。一般来说，作为人源化的结果，本发明技术的VHH相较于对应的天然存在的VHH结构域可以变得更“像人的”，同时仍保留有利性质，诸如降低的免疫原性。在一些实施方案中，本发明技术的人源化VHH可以用本领域中已知的任何合适的方式来获得，并且因此不严格限于已经使用包含天然存在的VHH结构域作为起始物质的多肽获得的多肽。
在一些实施方案中，所述FAP结合剂包含已经“骆驼化”，即通过将来自常规4链抗体的天然存在的VH结构域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基置换为骆驼重链抗体的VHH结构域中对应位置上存在的一个或多个氨基酸残基的VHH。在一些实施方案中，此类“骆驼化”取代被插入在形成和/或存在于VH-VL界面上的氨基酸位置上和/或在所谓的骆驼科标志残基上(参见例如WO 9404678，所述文献的全部内容特此以引用方式并入)。在一些实施方案中，用作起始物质或起始点以供产生或设计骆驼化VHH用的VH序列是来自哺乳动物的VH序列，例如，人的VH序列，诸如VH3序列。在一些实施方案中，所述骆驼化VHH可以用本领域中已知的任何合适的方式获得(即，如以上第(1)-(8)点所指示)，并且因此不严格限于已经使用包含天然存在的VH结构域作为起始物质的多肽而获得的多肽。
在一些实施方案中，“人源化”与“骆驼化”可以通过以下方式来进行：分别提供编码天然存在的VHH结构域或VH结构域的核苷酸序列，然后用本领域中已知的方式改变所述核苷酸序列中的一个或多个密码子，以这种方式使得新的核苷酸序列分别编码“人源化”或“骆驼化”VHH。然后可以用本领域中已知的方式表达这种核酸，以便提供本发明技术的所期望的VHH。或者，分别基于天然存在的VHH结构域或VH结构域的氨基酸序列，分别可以设计本发明技术的所期望的人源化或骆驼化VHH的氨基酸序列，然后使用本领域中已知的肽合成技术从头合成。而且，分别基于天然存在的VHH结构域或VH结构域的氨基酸序列或核苷酸序列，分别可以设计编码所期望的人源化或骆驼化VHH的核苷酸序列，然后使用本领域中已知的核酸合成技术从头合成，此后可以用本领域中已知的方式表达如此获得的核酸，以便提供本发明技术的所期望的VHH。以天然存在的VH序列或VHH序列为起始物获得本发明技术的VHH和/或编码所述VHH的核酸的其他合适的方法和技术在本领域中是已知的，并且可以例如包括以合适的方式组合一种或多种天然存在的VH序列的一个或多个部分(诸如一个或多个FR序列和/或CDR序列)、一种或多种天然存在的VHH序列的一个或多个部分(诸如一个或多个FR序列或CDR序列)和/或一个或多个合成或半合成序列，以便提供本发明技术的VHH或者编码所述VHH的核苷酸序列或核酸。
本文中描述了用于产生本发明技术的FAP结合剂的方法。举例来说，编码本发明技术的FAP结合剂的DNA序列可以使用本领域中已知的方法化学合成。合成DNA序列可以连接至其他适当的核苷酸序列，包括例如表达控制序列，以产生编码所期望的FAP结合剂的基因表达构建体。因此，在一些实施方案中，本发明技术提供了包含编码本发明技术的FAP结合剂的核苷酸序列的分离的核酸。
编码本发明技术的FAP结合剂的核酸可以并入(连接)至表达载体中，所述表达载体可以通过转染、转化或转导技术而引入宿主细胞中。举例来说，可以通过反转录病毒转导将编码本发明技术的FAP结合剂的核酸引入至宿主细胞中。说明性宿主细胞是大肠杆菌细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾293(HEK 293)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)和骨髓瘤细胞。可以使转化的宿主细胞在允许宿主细胞表达编码本发明技术的FAP结合剂的基因的条件下生长。因此，在一些实施方案中，本发明技术提供了包含编码本发明技术的FAP结合剂的核酸的表达载体。在一些实施方案中，本发明技术额外提供了包含此类表达载体的宿主细胞。
具体的表达和纯化条件将取决于所采用的表达系统而变化。举例来说，如果在大肠杆菌中表达基因，那么首先通过将工程化的基因置于合适的细菌启动子例如Trp或Tac和原核信号序列的下游而将它克隆至表达载体中。在另一个实例中，如果将要在真核宿主细胞，例如CHO细胞中表达工程化的基因，那么首先将它插入含有例如合适的真核启动子、分泌信号、增强子和各种内含子的表达载体中。可以使用转染、转化或转导技术将基因构建体引入至宿主细胞中。
本发明技术的FAP结合剂可以通过使经编码所述FAP结合剂的表达载体转染的宿主细胞在允许表达所述蛋白质的条件下生长来产生。在表达后，可以使用本领域中众所周知的技术，例如亲和力标签诸如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和组氨酸(His)标签或通过色谱法来收集并且纯化所述蛋白质。在一个实施方案中，所述FAP结合剂包含His标签。在一些实施方案中，所述FAP结合剂包含His标签和允许切割所述His标签的蛋白水解裂解位点。
因此，在一些实施方案中，本发明技术提供了一种编码本发明技术的FAP结合剂的核酸。在一些实施方案中，本发明技术提供了一种包含编码本发明技术的FAP结合剂的核酸的宿主细胞。
在一些实施方案中，本发明的FAP结合剂或包含其的嵌合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物可以在体内例如患者中表达。举例来说，在一些实施方案中，本发明的FAP结合剂或包含其的嵌合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物可以呈编码本发明的FAP结合剂或包含其的嵌合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物的核酸形式施用。在一些实施方案中，所述核酸是DNA或RNA。在一些实施方案中，本发明的FAP结合剂或包含其的嵌合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物是由经修饰的mRNA，即包含一个或多个经修饰的核苷酸的mRNA编码。在一些实施方案中，所述经修饰的mRNA包含一个或多个在美国专利号8,278,036中发现的修饰，所述专利的全部内容特此以引用方式并入。在一些实施方案中，所述经修饰的mRNA包含m5C、m5U、m6A、s2U、Ψ和2'-O-甲基-U中的一者或多者。在一些实施方案中，本发明技术涉及施用编码一种或多种本发明的嵌合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物的经修饰的mRNA。在一些实施方案中，本发明技术涉及包含所述经修饰的mRNA的基因治疗载体。在一些实施方案中，本发明技术涉及包括所述基因治疗载体的基因治疗方法。在一些实施方案中，所述核酸呈溶瘤病毒，例如腺病毒、呼肠孤病毒、麻疹、单纯疱疹、新城疫病毒或牛痘的形式。
药学上可接受的盐和赋形剂
本文所描述的FAP结合剂(和/或任何其他治疗剂)可以具有能与无机或有机酸反应的充分碱性的官能团，或能与无机或有机碱反应的羧基，以形成药学上可接受的盐。如本领域中众所周知，药学上可接受的酸加成盐是由药学上可接受的酸形成。此类盐包括例如以下文献中列出的药学上可接受的盐：Journal of Pharmaceutical Science,66,2-19(1977)和The Handbook of Pharmaceutical Salts；Properties,Selection,andUse.P.H.Stahl和C.G.Wermuth(编辑),Verlag,Zurich(Switzerland)2002，所述文献特此以引用方式整体并入。
作为非限制性实例，药学上可接受的盐包括硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、丹宁酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、樟脑磺酸盐、双羟萘酸盐、苯基乙酸盐、三氟乙酸盐、丙烯酸盐、氯代苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、邻乙酰氧基苯甲酸盐、萘-2-苯甲酸盐、异丁酸盐、苯基丁酸盐、a-羟基丁酸盐、丁炔-1,4-二甲酸盐、己炔-1,4-二甲酸盐、癸酸盐、辛酸盐、肉桂酸盐、乙醇酸盐、庚酸盐、马尿酸盐、苹果酸盐、羟基马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、酞酸盐、对苯二酸盐、丙炔酸盐、丙酸盐、苯基丙酸盐、癸二酸盐、辛二酸盐、对溴代苯磺酸盐、氯代苯磺酸盐、乙基磺酸盐、2-羟乙基磺酸盐、甲基磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、萘-1,5-磺酸盐、二甲苯磺酸盐和酒石酸盐。
术语“药学上可接受的盐”还指具有酸性官能团，诸如羧酸官能团的本发明技术的组合物与碱形成的盐。合适的碱包括但不限于碱金属诸如钠、钾和锂的氢氧化物；碱土金属诸如钙和镁的氢氧化物；其他金属诸如铝和锌的氢氧化物；氨和有机胺，诸如未经取代或经羟基取代的单烷基胺、二烷基胺或三烷基胺、二环己基胺；三丁胺；吡啶；N-甲基，N-乙基胺；二乙基胺；三乙基胺；单(2-OH-低级烷基胺)、双(2-OH-低级烷基胺)或三(2-OH-低级烷基胺)(诸如单(2-羟基乙基)胺、双(2-羟基乙基)胺或三(2-羟基乙基)胺)、2-羟基-叔丁胺或三(羟甲基)甲胺、N,N-二-低级烷基-N-(羟基-低级烷基)-胺(诸如N,N-二甲基-N-(2-羟基乙基)胺)或三(2-羟基乙基)胺；N-甲基-D-葡萄糖胺；和氨基酸，诸如精氨酸、赖氨酸等等。
在一些实施方案中，本文所描述的组合物呈药学上可接受的盐的形式。
药物组合物和制剂
在一些实施方案中，本发明技术有关于包含本文所描述的FAP结合剂(和/或任何其他治疗剂)和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。在一些实施方案中，本发明技术有关于包含本发明的FAP结合剂的药物组合物。在另一个实施方案中，本发明技术有关于包含本文所描述的任何其他治疗剂的药物组合物。在另一个实施方案中，本发明技术有关于包含本发明的FAP结合剂与本文所描述的任何其他治疗剂的组合的药物组合物。本文所描述的任何药物组合物都可以作为包含药学上可接受的载体或媒介物的组合物的组分施用至受试者。此类组合物可以任选地包含适量的药学上可接受的赋形剂，以便提供用于适当施用的形式。
在一些实施方案中，药物赋形剂可以是液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些液体，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等。所述药物赋形剂可以是例如生理盐水、阿拉伯树胶、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、胶体二氧化硅、脲等等。另外，可以使用助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。在一个实施方案中，当施用至受试者时，所述药学上可接受的赋形剂是无菌的。当经静脉内施用本文所描述的任何剂时，水是可用的赋形剂。还可以采用生理盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液作为液体赋形剂，具体来说，用于可注射溶液。合适的药物赋形剂还包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等等。本文所描述的任何剂在需要时还可以包含微量润湿剂或乳化剂或pH值缓冲剂。合适的药物赋形剂的其他实例描述于Remington’s Pharmaceutical Sciences 1447-1676(Alfonso R.Gennaro编辑,第19版1995)中，所述文献以引用方式并入本文。
本发明技术包括所描述的药物组合物(和/或其他治疗剂)的各种制剂形式。本文所描述的任何发明药物组合物(和/或其他治疗剂)可以呈溶液、悬浮液、乳液、滴剂、片剂、丸剂、丹剂、胶囊剂、含有液体的胶囊剂、明胶胶囊、粉剂、持续释放制剂、栓剂、乳液、气雾剂、喷雾剂、悬浮液、冻干粉剂、冷冻悬浮液、干燥粉剂的形式或任何其他合用的形式。在一个实施方案中，所述组合物呈胶囊剂形式。在另一个实施方案中，所述组合物呈片剂形式。在另一个实施方案中，所述药物组合物被配制为呈软凝胶胶囊形式。在另一个实施方案中，所述药物组合物被配制为呈明胶胶囊形式。在另一个实施方案中，所述药物组合物被配制为液体。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物(和/或其他剂)还可以包括增溶剂。所述剂还可以与如本领域中已知的合适的媒介物或递送装置一起递送。本文概述的组合疗法可以在单个递送媒介物或递送装置中共同递送。
本发明技术的包含本发明药物组合物(和/或其他剂)的制剂可能适宜呈单位剂型的形式存在，并且可以通过制药领域中众所周知的任何方法来制备。此类方法一般包括使所述治疗剂与构成一种或多种辅助成分的载体缔合的步骤。典型地，所述制剂是通过使所述治疗剂均匀地并且密切地与液体载体、细粉状固体载体或二者缔合，然后在必要时将产物成形为所期望的制剂的剂型(例如湿式或干式造粒、粉末掺合物等，随后使用本领域中已知的常规方法进行制片)来制备。
在一些实施方案中，本文所描述的任何药物组合物(和/或其他剂)根据常规程序配制为适合于本文所描述的施用模式的组合物。
在一些实施方案中，施用途径包括例如：口服、皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、舌下、鼻内、脑内、阴道内、经皮、直肠、通过吸入或局部。施用可以是局部的或全身的。在一些实施方案中，所述施用是通过口服实现。在另一个实施方案中，所述施用是通过肠胃外注射。施用模式可以留给医师判断，并且部分取决于医学病状的部位。在大部分情况下，施用使得本文所描述的任何剂释放至血流中。
在一些实施方案中，本文所描述的FAP结合剂根据常规程序配制为适合于口服施用的组合物。作为实例但不作为限制，在一些实施方案中，用于口服递送的组合物呈片剂、糖锭、水性或油性悬浮液、颗粒剂、粉剂、乳液、胶囊剂、糖浆或酏剂形式。在一些实施方案中，口服施用的组合物包含一种或多种剂，例如甜味剂，诸如果糖、阿斯巴特(aspartame)或糖精；调味剂，诸如薄荷油、冬青油或樱桃油；着色剂；和防腐剂，以提供药学上可口的制剂。在一些实施方案中，在呈片剂或丸剂形式时，所述组合物经过包衣以延迟胃肠道中的崩解和吸收，从而在较长时间段内提供持续作用。在本文所描述的渗透活性驱动的任何FAP结合剂周围的选择性渗透膜还适用于口服施用的组合物。在后面的这些平台中，来自于所述胶囊剂周围的环境的流体被驱动化合物吸入，所述驱动化合物膨胀从而通过孔口置换所述剂或剂组合物。与立即释放制剂的尖峰分布相反，这些递送平台可以提供本质上零阶的递送分布。在一些实施方案中，所述口服组合物包括时间延迟材料，诸如例如单硬脂酸甘油酯或硬脂酸甘油酯在一些实施方案中，口服组合物包括标准赋形剂，诸如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素和碳酸镁。在一个实施方案中，所述赋形剂属于药物等级。悬浮液以及活性化合物可以含有悬浮剂，诸如例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧化乙烯山梨糖醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、皂土、琼脂、黄芪胶等以及它们的混合物。
适用于肠胃外施用(例如静脉内、肌肉内、腹膜内、皮下和关节内注射和输注)的剂型包括例如溶液、悬浮液、分散液、乳液等等。它们还可以制造为呈无菌固体组合物(例如冻干组合物)形式，所述形式可以在即将使用前溶解或悬浮在无菌可注射介质中。它们可以含有例如本领域中已知的悬浮剂或分散剂。适用于肠胃外施用的制剂组分包括无菌稀释剂诸如注射用水、生理盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂诸如EDTA；缓冲液诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和张力调节剂诸如氯化钠或葡萄糖。
对于静脉内施用而言，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、克列莫佛(Cremophor)ELTM(BASF,Parsippany,NJ)或磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)。所述载体在制造和存储条件下应当是稳定的，并且应当经过防腐以免受微生物影响。所述载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)以及它们的合适的混合物的溶剂或分散介质。
本文提供的组合物可以单独或与其他合适的组分组合而制成气雾剂制剂(即，“喷雾”)以便经由吸入施用。气雾剂制剂可以放入加压可接受的推进剂诸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等等中。
本文所描述的任何发明药物组合物(和/或其他剂)可以通过控制释放或持续释放手段或通过本领域普通技术人员众所周知的递送装置施用。实例包括但不限于美国专利号3,845,770、3,916,899、3,536,809、3,598,123、4,008,719、5,674,533、5,059,595、5,591,767、5,120,548、5,073,543、5,639,476、5,354,556和5,733,556中所描述的那些，各美国专利以引用的方式整体并入本文。此类剂型可用于使用例如羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、其他聚合物基质、凝胶、渗透膜、渗透系统、多层涂层、微粒、脂质体、微球体或它们的组合提供一种或多种活性成分的控制释放或持续释放，从而在变化的比例下提供所期望的释放分布。可以容易地选择本领域技术人员已知的合适的控制释放或持续释放制剂，包括本文所描述的那些，以便与本文所描述的剂的活性成分一起使用。本发明技术因此提供了适合口服施用的单个单位剂型，诸如但不限于适合于控制释放或持续释放的片剂、胶囊剂、囊形片和胶囊片。
可以通过各种条件包括但不限于pH值变化、温度变化来刺激、通过适当的光的波长、酶的浓度或可用性、水的浓度或可用性或者其他生理条件或化合物来刺激活性成分的控制释放或持续释放。
在另一个实施方案中，控制释放系统可以放在欲治疗的目标区域的附近，因此仅需要全身剂量的一部分(参见例如Goodson,Medical Applications of ControlledRelease,同上,第2卷,第115-138页(1984))。可以使用Langer,1990,Science 249:1527-1533)的综述中讨论的其他控制释放系统。
药物制剂优选地是无菌的。可以例如通过经无菌过滤膜过滤来实现灭菌。在组合物被冻干的情况下，可以在冻干和复水之前或之后进行过滤灭菌。
施用和剂量
应当了解，根据本发明技术施用的FAP结合剂和/或本文所描述的任何治疗剂的实际剂量将根据具体剂型和施用模式而变化。本领域技术人员可以考虑能调节FAP结合剂的作用的许多因素(例如体重、性别、饮食、施用时间、施用途径、排泄速率、受试者的状况、药物组合、遗传倾向和反应敏感性)。可以连续地或者以最大耐受剂量内的一个或多个离散剂量进行施用。本领域技术人员可以使用常规剂量施用测试来确定给定条件组的最佳施用速率。
在一些实施方案中，所述FAP结合剂和/或本文所描述的任何治疗剂的合适的剂量在约0.01mg/kg至约10g/kg受试者体重、约0.01mg/kg至约1g/kg受试者体重、约0.01mg/kg至约100mg/kg受试者体重、约0.01mg/kg至约10mg/kg受试者体重的范围内，例如约0.01mg/kg、约0.02mg/kg、约0.03mg/kg、约0.04mg/kg、约0.05mg/kg、约0.06mg/kg、约0.07mg/kg、约0.08mg/kg、约0.09mg/kg、约0.1mg/kg、约0.2mg/kg、约0.3mg/kg、约0.4mg/kg、约0.5mg/kg、约0.6mg/kg、约0.7mg/kg、约0.8mg/kg、约0.9mg/kg、约1mg/kg、约1.1mg/kg、约1.2mg/kg、约1.3mg/kg、约1.4mg/kg、约1.5mg/kg、约1.6mg/kg、约1.7mg/kg、约1.8mg/kg、1.9mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg体重、约100mg/kg体重、约1g/kg体重、约10g/kg体重，包括所有值和介于这些值之间的范围。
在一些实施方案中，所述FAP结合剂和/或本文所描述的任何治疗剂的个别剂量以含有例如每个单位剂型约0.01mg至约100g、约0.01mg至约75g、约0.01mg至约50g、约0.01mg至约25g、约0.01mg至约10g、约0.01mg至约7.5g、约0.01mg至约5g、约0.01mg至约2.5g、约0.01mg至约1g、约0.01mg至约100mg、约0.1mg至约100mg、约0.1mg至约90mg、约0.1mg至约80mg、约0.1mg至约70mg、约0.1mg至约60mg、约0.1mg至约50mg、约0.1mg至约40mg活性成分、约0.1mg至约30mg、约0.1mg至约20mg、约0.1mg至约10mg、约0.1mg至约5mg、约0.1mg至约3mg、约0.1mg至约1mg或每个单位剂型约5mg至约80mg的单位剂型的形式施用。举例来说，单位剂型可以是约0.01mg、约0.02mg、约0.03mg、约0.04mg、约0.05mg、约0.06mg、约0.07mg、约0.08mg、约0.09mg、约0.1mg、约0.2mg、约0.3mg、约0.4mg、约0.5mg、约0.6mg、约0.7mg、约0.8mg、约0.9mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约15mg、约20mg、约25mg、约30mg、约35mg、约40mg、约45mg、约50mg、约55mg、约60mg、约65mg、约70mg、约75mg、约80mg、约85mg、约90mg、约95mg、约100mg、约200mg、约500mg、约1g、约2.5g、约5g、约10g、约25g、约50g、约75g、约100g，包括所有值和介于这些值之间的范围。
在一个实施方案中，所述FAP结合剂和/或本文所描述的任何治疗剂是以每天约0.01mg至约100g、每天约0.01mg至约75g、每天约0.01mg至约50g、每天约0.01mg至约25g、每天约0.01mg至约10g、每天约0.01mg至约7.5g、每天约0.01mg至约5g、每天约0.01mg至约2.5g、每天约0.01mg至约1g、每天约0.01mg至约100mg、每天约0.1mg至约100mg、每天约0.1mg至约95mg、每天约0.1mg至约90mg、每天约0.1mg至约85mg、每天约0.1mg至约80mg、每天约0.1mg至约75mg、每天约0.1mg至约70mg、每天约0.1mg至约65mg、每天约0.1mg至约60mg、每天约0.1mg至约55mg、每天约0.1mg至约50mg、每天约0.1mg至约45mg、每天约0.1mg至约40mg、每天约0.1mg至约35mg、每天约0.1mg至约30mg、每天约0.1mg至约25mg、每天约0.1mg至约20mg、每天约0.1mg至约15mg、每天约0.1mg至约10mg、每天约0.1mg至约5mg、每天约0.1mg至约3mg、每天约0.1mg至约1mg或每天约5mg至约80mg的量施用。在一些实施方案中，所述FAP结合剂是以约0.01mg、约0.02mg、约0.03mg、约0.04mg、约0.05mg、约0.06mg、约0.07mg、约0.08mg、约0.09mg、约0.1mg、约0.2mg、约0.3mg、约0.4mg、约0.5mg、约0.6mg、约0.7mg、约0.8mg、约0.9mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg约10mg、约15mg、约20mg、约25mg、约30mg、约35mg、约40mg、约45mg、约50mg、约55mg、约60mg、约65mg、约70mg、约75mg、约80mg、约85mg、约90mg、约95mg、约100mg、约200mg、约500mg、约1g、约2.5g、约5g、约7.5g、约10g、约25g、约50g、约75g、约100g的每日剂量施用，包括所有值和介于这些值之间的范围。
根据本发明技术的某些实施方案，包含所述FAP结合剂和/或本文所描述的任何治疗剂的药物组合物可以施用例如每天超过一次(例如每天约两次、约三次、约四次、约五次、约六次、约七次、约八次、约九次或约十次)、约每天一次、约每隔一天一次、约每第三天一次、约一周一次、约每两周一次、约每个月一次、约每两个月一次、约每三个月一次、约每六个月一次或约每年一次。
组合疗法和其他治疗剂
在一些实施方案中，将本发明技术的药物组合物与一种或多种另外的治疗剂联合共同施用。在一些实施方案中，共同施用可以同时或依序进行。
在一个实施方案中，将所述其他治疗剂和本发明技术的FAP结合剂同时施用至受试者。如本文所使用，术语“同时”意指所述其他治疗剂和FAP结合剂的施用时间间隔不超过约60分钟，诸如不超过约30分钟、不超过约20分钟、不超过约10分钟、不超过约5分钟或不超过约1分钟。所述其他治疗剂和FAP结合剂的施用可以通过同时施用单一制剂(例如包含所述其他治疗剂和FAP结合剂的制剂)或独立的制剂(例如包括所述其他治疗剂的第一制剂和包括FAP结合剂的第二制剂)来进行。
共同施用不需要同时施用各治疗剂，只要其施用时程使得所述其他治疗剂和FAP结合剂的药理学活性在时间上重叠，由此发挥组合治疗作用即可。举例来说，所述其他治疗剂和FAP结合剂可以依序施用。如本文所使用，术语“依序”意指所述其他治疗剂和FAP结合剂的施用时间间隔超过约60分钟。举例来说，依序施用所述其他治疗剂与FAP结合剂之间的时间可以间隔超过约60分钟、超过约2小时、超过约5小时、超过约10小时、超过约1天、超过约2天、超过约3天、超过约1周或超过约2周或超过约一个月。最佳的施用时间将取决于代谢速率、排泄速率和/或所施用的其他治疗剂和FAP结合剂的药物动力学活性。可以先施用所述其他治疗剂或FAP结合剂。
共同施用也不需要通过相同施用途径向受试者施用所述治疗剂。实际上，各治疗剂可以通过任何适当的途径，例如经肠胃外或非肠胃外施用。
在一些实施方案中，本文所描述的FAP结合剂当与另一种治疗剂共同施用时协同起作用。如本文所使用，“协同地”是指由至少两种剂的组合所产生的并且超过原本由单独施用各剂所产生的效果的大于累加的治疗效果。举例来说，可以使用较低剂量的一种或多种剂治疗疾病或病症，使得治疗功效增加且副作用减少。在此类实施方案中，所述FAP结合剂和其他治疗剂的施用剂量可以低于当各剂用于单一疗法情形时所采用的剂量。
在一些实施方案中，本发明技术有关于化学治疗剂作为其他治疗剂。举例来说但不限于，本发明的FAP结合剂与化学治疗剂的这种组合可用于治疗癌症，如本文其他部分所描述。化学治疗剂的实例包括但不限于烷化剂，诸如噻替派(thiotepa)和CYTOXAN环磷酰胺；烷基磺酸酯，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，诸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺(altretamine)、曲他胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰(acetogenin)(例如布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物拓扑替康(topotecan))；苔藓抑素(bryostatin)；海绵抑素(cally statin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；念珠藻环肽(cryptophycin)(例如，念珠藻环肽1和念珠藻环肽8)；海兔抑素(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物，KW-2189和CB 1-TM1)；伊斯罗宾(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑素(spongistatin)；氮芥，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、氮芥氧化物盐酸盐(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、乌拉莫司汀(uracil mustard)；亚硝基脲，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲霉素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫斯汀(ranimnustine)；抗生素，诸如烯二炔类抗生素(例如卡利奇霉素(calicheamicin)，尤其是卡利奇霉素γl和卡利奇霉素ωl(参见例如Agnew,Chem.Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994)))；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；双膦酸盐，诸如氯屈膦酸盐(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素发色团(neocarzinostatin chromophore)和相关色素蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代-多柔比星)、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉芬酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泼非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、奎那霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，诸如甲氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如迪诺特宁(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、噻咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如环胞苷(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮杂尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素，诸如卡芦睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺药，诸如氨鲁米特(minoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；贝斯布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依洛尼塞(elformithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；蘑菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；类美登素(maytansinoid)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocins)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他汀(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,Oreg.)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofuran)；锗螺胺(spirogermanium)；替奴佐酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢霉烯(trichothecenes)(例如T-2毒素、粘液霉素A(verracurin A)、杆孢菌素A(roridin A)和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；类紫杉醇(toxoid)(例如TAXOL、太平洋紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、太平洋紫杉醇的不含聚氧乙烯化蓖麻油(Cremophor)的经白蛋白工程化的纳米粒子制剂(AmericanPharmaceutical Partners,Schaumberg,111.)以及TAXOTERE多西他赛(doxetaxel)(Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France))；苯丁酸氮芥；GEMZAR(吉西他滨(gemcitabine))；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物(诸如例如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)和卡铂(carboplatin))；长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱(vincristine)；NAVELBINE(长春瑞滨(vinorelbine))；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；柔红霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(Camptosar、CPT-11)(包括伊立替康与5-FU的治疗方案)和亚叶酸(leucovorin))；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄素(retinoid)，诸如视黄酸(retinoic acid)；卡培他滨(capecitabine)；康普瑞汀(combretastatin)；亚叶酸(LV)；奥沙利铂(oxaliplatin)，包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX)；拉帕替尼(lapatinib)(Tykerb)；减少细胞增殖的PKC-a、Raf、H-Ras、EGFR的抑制剂(例如埃罗替尼(erlotinib)(T))和VEGF-A的抑制剂；以及以上任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。另外，在一些实施方案中，所述治疗方法还包括使用辐射。另外，在一些实施方案中，所述治疗方法还包括使用光动力疗法。
因此，在一些实施方案中，本发明技术涉及使用所述FAP结合剂和化疗剂的组合疗法。在一些实施方案中，本发明技术涉及对利用化疗剂进行治疗的患者施用所述FAP结合剂。在一些实施方案中，所述化疗剂是DNA插入剂，诸如但不限于多柔比星、顺铂、柔红霉素和表柔比星。在一些实施方案中，所述DNA插入剂是多柔比星。
在一些实施方案中，所述FAP结合剂当与多柔比星共同施用时协同作用。在一些实施方案中，所述FAP结合剂当与多柔比星共同施用以用于治疗肿瘤或癌症时协同作用。举例来说，共同施用所述FAP结合剂和多柔比星可以协同作用，以减轻或消除所述肿瘤或癌症，或者减缓所述肿瘤或癌症的生长和/或进展和/或转移。在一些实施方案中，所述FAP结合剂与多柔比星的组合当与单独用在单一疗法的情形下的所述剂相比时可以表现出提高的安全特性。在一些实施方案中，所述FAP结合剂和多柔比星按比当所述剂用在单一疗法的情形下时所采用的剂量更低的剂量施用。在一些实施方案中，所述FAP结合剂包含突变的干扰素，诸如突变的IFNα。在一些实施方案中，所述突变的IFNα相对于SEQ ID NO:688或SEQ IDNO:689在位置148、149和153处包含一个或多个突变，诸如取代M148A、R149A和L153A。
在一些实施方案中，本发明技术涉及利用一种或多种免疫调节剂，例如但不限于调节免疫检查点的剂的组合疗法。在一些实施方案中，所述免疫调节剂靶向PD-1、PD-L1和PD-L2中的一者或多者。在一些实施方案中，所述免疫调节剂是PD-1抑制剂。在一些实施方案中，所述免疫调节剂是对PD-1、PD-L1和PD-L2中的一者或多者具有特异性的抗体。举例来说，在一些实施方案中，所述免疫调节剂是抗体，诸如但不限于，纳武单抗(ONO-4538/BMS-936558，MDX1106，OPDIVO，BRISTOL MYERS SQUIBB)、派姆单抗(KEYTRUDA，MERCK)、皮地利珠单抗(CT-011，CURE TECH)、MK-3475(MERCK)、BMS 936559(BRISTOL MYERS SQUIBB)、MPDL3280A(ROCHE)。在一些实施方案中，所述免疫调节剂靶向CD137或CD137L中的一者或多者。在一些实施方案中，所述免疫调节剂是对CD137或CD137L中的一者或多者具有特异性的抗体。举例来说，在一些实施方案中，所述免疫调节剂是抗体，诸如但不限于乌瑞鲁单抗(urelumab)(又称为BMS-663513和抗4-1BB抗体)。在一些实施方案中，将本发明的嵌合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物与乌瑞鲁单抗(任选地与纳武单抗、利丽单抗(lirilumab)和乌瑞鲁单抗中的一者或多者)组合以治疗实体肿瘤和/或B细胞非霍奇金氏淋巴瘤和/或头颈癌和/或多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，所述免疫调节剂是靶向以下一者或多者的剂：CTLA-4、AP2M1、CD80、CD86、SHP-2和PPP2R5A。在一些实施方案中，所述免疫调节剂是对以下一者或多者具有特异性的抗体：CTLA-4、AP2M1、CD80、CD86、SHP-2和PPP2R5A。举例来说，在一些实施方案中，所述免疫调节剂是抗体，诸如但不限于伊匹单抗(ipilimumab)(MDX-010、MDX-101，Yervoy，BMS)和/或曲美目单抗(tremelimumab)(Pfizer)。在一些实施方案中，将本发明的嵌合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物与伊匹单抗(任选地与巴维昔单抗(bavituximab))组合以治疗黑素瘤、前列腺癌和肺癌中的一者或多者。在一些实施方案中，所述免疫调节剂靶向CD20。在一些实施方案中，所述免疫调节剂是对CD20具有特异性的抗体。举例来说，在一些实施方案中，所述免疫调节剂是抗体，诸如但不限于，奥法木单抗(GENMAB)、奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)(GAZYVA)、AME-133v(APPLIED MOLECULAREVOLUTION)、奥瑞珠单抗(GENENTECH)、TRU-015(TRUBION/EMERGENT)、维妥珠单抗(veltuzumab)(IMMU-106)。
在一些实施方案中，本发明技术涉及使用所述FAP结合剂和检查点抑制剂的组合疗法。在一些实施方案中，本发明技术涉及对利用检查点抑制剂进行治疗的患者施用所述FAP结合剂。在一些实施方案中，所述检查点抑制剂是靶向PD-1、PD-L1、PD-L2和CTLA-4中的一者或多者的剂(包括本文所描述的抗PD-1、抗PD-L1、抗PD-L2和抗CTLA-4剂中的任一者)。在一些实施方案中，所述检查点抑制剂是纳武单抗(ONO-4538/BMS-936558，MDX1106，OPDIVO，BRISTOL MYERS SQUIBB)、派姆单抗(KEYTRUDA，MERCK)、皮地利珠单抗(CT-011，CURE TECH)、MK-3475(MERCK)、BMS 936559(BRISTOL MYERS SQUIBB)、MPDL3280A(ROCHE)、伊匹单抗(MDX-010、MDX-101，Yervoy，BMS)和曲美目单抗(Pfizer)。在一些实施方案中，所述检查点抑制剂是针对PD-L1的抗体。
在一些实施方案中，所述FAP结合剂当与所述抗PD-L1抗体共同施用时协同作用。在一些实施方案中，所述FAP结合剂当与所述抗PD-L1抗体共同施用以用于治疗肿瘤或癌症时协同作用。举例来说，共同施用所述FAP结合剂和所述抗PD-L1抗体可以协同作用以减轻或消除所述肿瘤或癌症，或者减缓所述肿瘤或癌症的生长和/或进展和/或转移。在一些实施方案中，所述FAP结合剂与所述抗PD-L1抗体的组合当与单独用在单一疗法的情形下的所述剂相比时可以表现出提高的安全特性。在一些实施方案中，所述FAP结合剂和所述抗PD-L1抗体可以按比当所述剂用在单一疗法的情形下时所采用的剂量更低的剂量施用。在一些实施方案中，所述FAP结合剂包含突变的干扰素，诸如突变的IFNα。在说明性实施方案中，所述突变的IFNα相对于SEQ ID NO:688或SEQ ID NO:689在位置148、149和153处包含一个或多个突变，诸如取代M148A、R149A和L153A。
在一些实施方案中，本发明技术涉及使用所述FAP结合剂和免疫阻抑剂的组合疗法。在一些实施方案中，本发明技术涉及对利用免疫阻抑剂进行治疗的患者施用所述FAP结合剂。在一些实施方案中，所述免疫阻抑剂是TNF。
在说明性实施方案中，所述FAP结合剂当与TNF共同施用时协同作用。在一个说明性实施方案中，所述FAP结合剂当与TNF共同施用以用于治疗肿瘤或癌症时协同作用。举例来说，共同施用所述FAP结合剂和TNF可以协同作用以减轻或消除所述肿瘤或癌症，或者减缓所述肿瘤或癌症的生长和/或进展和/或转移。在一些实施方案中，所述FAP结合剂与TNF的组合当与单独用在单一疗法的情形下的所述剂相比时可以表现出提高的安全特性。在一些实施方案中，所述FAP结合剂和TNF可以按比当所述剂用在单一疗法的情形下时所采用的剂量更低的剂量施用。在一些实施方案中，所述FAP结合剂包含突变的干扰素，诸如突变的IFNα。在说明性实施方案中，所述突变的IFNa相对于SEQ ID NO:688或SEQ ID NO:689在位置148、149和153处包含一个或多个突变，诸如取代M148A、R149A和L153A。
在一些实施方案中，所述FAP结合剂当与嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法组合使用时协同作用。在一个说明性实施方案中，所述FAP结合剂当与CAR T细胞疗法组合用于治疗肿瘤或癌症时协同作用。在一个实施方案中，所述FAP结合剂当与CAR T细胞疗法组合用于治疗基于血液的肿瘤时协同作用。在一个实施方案中，所述FAP结合剂当与CAR T细胞疗法组合用于治疗实体肿瘤时协同作用。举例来说，使用所述FAP结合剂和CAR T细胞可以协同作用以减轻或消除所述肿瘤或癌症，或者减缓所述肿瘤或癌症的生长和/或进展和/或转移。在一些实施方案中，本发明技术的FAP结合剂诱导CAR T细胞分裂。在一些实施方案中，本发明技术的FAP结合剂诱导CAR T细胞增殖。在一些实施方案中，本发明技术的FAP结合剂预防CAR T细胞无应答。
在一些实施方案中，所述CAR T细胞疗法包含靶向诸多抗原(例如肿瘤抗原)，诸如但不限于碳酸酐酶IX(CAIX)、5T4、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD47、CS1、CD138、Lewis-Y、L1-CAM、MUC16、ROR-1、IL13Ra2、gp100、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、B细胞成熟抗原(BCMA)、第16型人乳头状瘤病毒E6(HPV-16E6)、CD171、叶酸受体α(FR-a)、GD2、人表皮生长因子受体2(HER2)、间皮素、EGFRvIll、成纤维细胞激活蛋白(FAP)、癌胚抗原癌胚抗原(CEA)和血管内皮生长因子受体2(VEGF-R2)以及本领域中众所周知的其他肿瘤抗原的CAR T细胞。其他说明性肿瘤抗原包括但不限于MART-1/Melan-A、gp100、二肽基肽酶IV(DPPIV)、腺苷脱氨酶结合蛋白(ADAbp)、亲环蛋白b、结肠直肠相关抗原(CRC)-0017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)及其免疫原性表位CAP-1和CAP-2、etv6、am11、前列腺特异性抗原(PSA)及其免疫原性表位PSA-1、PSA-2和PSA-3、T细胞受体/CD3-ζ链、MAGE家族肿瘤抗原(例如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-Al2、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-05)、GAGE家族肿瘤抗原(例如GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9)、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪氨酸酶、p53、MUC家族、HER2/neu、p21ras、RCAS1、a-胎儿球蛋白、E-钙粘蛋白、a-连锁蛋白、3-连锁蛋白和y-连锁蛋白、p120ctn、gp100Pme1117、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、腺瘤性结肠息肉病蛋白(APC)、胞衬蛋白、连接蛋白37、Ig独特型、p15、gp75、GM2和GD2神经节苷脂、病毒产物诸如人乳头状瘤病毒蛋白、Smad家族肿瘤抗原、Imp-1、NA、EBV编码的核抗原(EBNA)-1、脑糖原磷酸化酶、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1CT-7、c-erbB-2、CD19、CD37、CD56、CD70、CD74、CD138、AGS16、MUC1、GPNMB、Ep-CAM、PD-L1和PD-L2。
说明性CAR T细胞疗法包括但不限于JCAR014(Juno Therapeutics)、JCAR015(Juno Therapeutics)、JCAR017(Juno Therapeutics)、JCAR018(Juno Therapeutics)、JCAR020(Juno Therapeutics)、JCAR023(Juno Therapeutics)、JCAR024(JunoTherapeutics)、CTL019(Novartis)、KTE-C19(Kite Pharma)、BPX-401(BellicumPharmaceuticals)、BPX-501(Bellicum Pharmaceuticals)、BPX-601(BellicumPharmaceuticals)、bb2121(Bluebird Bio)、CD-19睡美人细胞(ZiopharmOncology)、UCART19(Cellectis)、UCART123(Cellectis)、UCART38(Cellectis)、UCARTCS1(Cellectis)、OXB-302(Oxford BioMedica、MB-101(Mustang Bio)和由InnovativeCellular Therapeutics开发的CAR T细胞。
在一些实施方案中，本发明技术涉及利用WO 2013/10779、WO 2015/007536、WO2015/007520、WO 2015/007542和WO 2015/007903中所描述的一种或多种嵌合剂的组合疗法，所述文献的全部内容特此以引用的方式整体并入。
在一些实施方案中，包括但不限于感染性疾病应用，本发明技术涉及抗感染剂作为其他治疗剂。在一些实施方案中，所述抗感染剂是抗病毒剂，包括但不限于阿巴卡韦(Abacavir)、阿昔洛韦(Acyclovir)、阿德福韦(Adefovir)、安普那韦(Amprenavir)、阿扎那韦(Atazanavir)、西多福韦(Cidofovir)、达芦那韦(Darunavir)、地拉韦啶(Delavirdine)、去羟肌苷(Didanosine)、多可沙诺(Docosanol)、依非韦仑(Efavirenz)、埃替格韦(Elvitegravir)、恩曲他滨(Emtricitabine)、恩福韦地(Enfuvirtide)、依曲韦林(Etravirine)、泛昔洛韦(Famciclovir)和膦甲酸盐(Foscarnet)。在一些实施方案中，抗感染剂是抗细菌剂，包括但不限于头孢菌素类抗生素(头孢胺苄(cephalexin)、头孢呋辛(cefuroxime)、头孢羟胺苄(cefadroxil)、头孢唑林(cefazolin)、头孢噻吩(cephalothin)、头孢克洛(cefaclor)、头孢孟多(cefamandole)、头孢西丁(cefoxitin)、头孢丙烯(cefprozil)和头孢托罗酯(ceftobiprole))；氟喹诺酮类抗生素(fluoroquinoloneantibiotics)(环丙沙星(cipro)、左氟沙星(Levaquin)、氧氟沙星(floxin)、加替沙星(tequin)、莫西沙星(avelox)和诺氟沙星(norflox))；四环素类抗生素(四环素、米诺环素(minocycline)、羟四环素(oxytetracycline)和去氧环素(doxycycline))；青霉素类抗生素(阿莫西林(amoxicillin)、胺苄西林(ampicillin)、青霉素V、双氯西林(dicloxacillin)、羧苄西林(carbenicillin)、万古霉素(vancomycin)和甲氧西林(methicillin))；单酰胺环类抗生素(胺曲南(aztreonam))；以及碳青霉烯类抗生素(厄他培南(ertapenem)、多尼培南(doripenem)、亚胺培南(imipenem)/西司他丁(cilastatin)和美罗培南(meropenem))。在一些实施方案中，抗感染剂包括抗疟药(例如氯喹(chloroquine)、奎宁(quinine)、甲氟喹(mefloquine)、伯胺喹(primaquine)、去氧环素(doxycycline)、蒿甲醚(artemether)/苯芴醇(lumefantrine)、阿托伐醌(atovaquone)/氯胍(proguanil)和磺胺多辛(sulfadoxine)/乙胺嘧啶(pyrimethamine))、甲硝唑(metronidazole)、替硝唑(tinidazole)、伊维菌素(ivermectin)、双羟萘酸噻嘧啶(pyrantel pamoate)和阿苯达唑(albendazole)。
在一些实施方案中，包括但不限于自身免疫应用，所述其他治疗剂是免疫阻抑剂。在一些实施方案中，所述免疫阻抑剂是消炎剂，诸如类固醇类消炎剂或非类固醇类消炎剂(NSAID)。类固醇，特别是肾上腺皮质类固醇及其合成类似物在本领域中是众所周知的。可用于本发明技术中的皮质类固醇的实例包括但不限于羟基曲安西龙(hydroxyltriamcinolone)、α-甲基地塞米松(alpha-methyldexamethasone)、β-甲基地塞米松、二丙酸倍氯米松(beclomethasone dipropionate)、苯甲酸倍他米松(betamethasonebenzoate)、二丙酸倍他米松、戊酸倍他米松、戊酸氯倍他索(clobetasol valerate)、地奈德(desonide)、去羟米松(desoxymethasone)、地塞米松(dexamethasone)、二乙酸二氟拉松(diflorasone diacetate)、戊酸二氟可龙(diflucortolone valerate)、氟氢缩松(fluadrenolone)、氟氯奈德(fluclorolone acetonide)、特戊酸氟美松(flumethasonepivalate)、氟轻松(fluosinolone acetonide)、醋酸氟轻松(fluocinonide)、氟可丁酯(flucortine butylester)、氟可龙(fluocortolone)、醋酸氟泼尼定(fluprednidene/fluprednylidene)、氟氢缩松(flurandrenolone)、哈西奈德(halcinonide)、醋酸氢化可的松(hydrocortisone acetate)、丁酸氢化可的松(hydrocortisone butyrate)、甲泼尼龙(methylprednisolone)、曲安奈德(triamcinolone acetonide)、可的松(cortisone)、可托多松(cortodoxone)、醋酸氟轻松、氟氢可的松(fludrocortisone)、二醋酸二氟拉松(difluorosone diacetate)、丙酮化氟雄诺龙(fluradrenolone acetonide)、甲羟松(medrysone)、安西缩松(amcinafel)、安西非特(amcinafide)、倍他米松及其相应酯、氯泼尼松(chloroprednisone)、氯可托龙(clocortelone)、克西诺龙(clescinolone)、二氯松(dichlorisone)、二氟泼尼酯(difluprednate)、氟氯奈德(flucloronide)、氟尼缩松(flunisolide)、氟米龙(fluoromethalone)、氟培龙(fluperolone)、氟泼尼龙(fluprednisolone)、氢化可的松(hydrocortisone)、甲泼尼松(meprednisone)、帕拉米松(paramethasone)、泼尼松龙(prednisolone)、泼尼松(prednisone)、二丙酸倍他米松。可以用于本发明技术中的(NSAID)包括但不限于水杨酸、乙酰水杨酸、水杨酸甲酯、乙二醇水杨酸酯、水杨酰胺、苯甲基-2,5-二乙酰氧基苯甲酸、布洛芬(ibuprofen)、舒林酸(fulindac)、萘普生(naproxen)、酮洛芬(ketoprofen)、依托芬那酯(etofenamate)、保泰松(phenylbutazone)和吲哚美辛(indomethacin)。在一些实施方案中，所述免疫阻抑剂可以是细胞抑制剂，诸如烷化剂、抗代谢物(例如硫唑喋呤、甲氨蝶呤)、细胞毒性抗生素、抗体(例如巴利昔单抗(basiliximab)、达克珠单抗(daclizumab)和莫罗单抗(muromonab))、抗免疫亲和素(anti-immunophilin)(例如环孢素(cyclosporine)、他克莫司(tacrolimus)、西罗莫司(sirolimus))、干扰素、阿片类、TNF结合蛋白、霉酚酸酯以及小生物剂(例如芬戈莫德、多球壳素(myriocin))。其他消炎剂描述于例如美国专利号4,537,776中，所述文献的完整内容特此以引用方式并入。
在一些实施方案中，本文所描述的FAP结合剂包括经过修饰的衍生物，即通过将任何类型的分子共价连接至该组合物以使得共价连接不会妨碍该组合物的活性。举例来说但不限于，衍生物包括通过特别是糖基化、脂化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、利用已知的保护基团/阻断基团衍生化、蛋白水解裂解、连接至细胞配体或其他蛋白质等进行修饰的组合物。可以利用已知技术，包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等进行多种化学修饰中的任一种。
在其他实施方案中，本文所描述的FAP结合剂还包含细胞毒性剂，在说明性实施方案中，所述细胞毒性剂包含毒素、化疗剂、放射性同位素以及引起细胞凋亡或细胞死亡的剂。此类剂可以与本文所描述的组合物缀合。
因此，本文所描述的FAP结合剂可以经历翻译后修饰以添加效应子部分，诸如化学接头；可检测部分，诸如荧光染料、酶、底物、生物发光材料、放射性材料和化学发光部分；或功能性部分，诸如链霉亲合素、抗生物素蛋白、生物素、细胞毒素、细胞毒性剂和放射性材料。
说明性细胞毒性剂包括但不限于甲氨蝶呤、氨基蝶呤、6-巯基喋呤、6-硫鸟喋呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪；烷化剂，诸如氮芥、噻替派、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)、丝裂霉素C、洛莫司汀(CCNU)、1-甲基亚硝基脲、环磷酰胺、氮芥、白消安、二溴甘露醇、链佐星、丝裂霉素C、顺-二氯二胺铂(II)(DDP)、顺铂和卡铂(伯尔定)；蒽环霉素，包括柔红霉素(先前的道诺霉素)、多柔比星(阿霉素)、地托比星、卡米诺霉素、伊达比星、表柔比星、米托蒽醌和比生群；抗生素，包括放线菌素D(dactinomycin/actinomycin D)、博来霉素、刺孢霉素、光辉霉素和安曲霉素(AMC)；以及抗有丝分裂剂，诸如长春生物碱类(vincaalkaloid)、长春新碱(vincristine)和长春花碱(vinblastine)。其他细胞毒性剂包括太平洋紫杉醇(紫杉醇)、蓖麻毒素、假单胞菌外毒素、吉西他滨、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴乙锭、依米丁(emetine)、依托泊苷、替尼泊苷、秋水仙素、二羟基蒽二酮、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、丙卡巴肼、羟基脲、天冬酰胺酶、皮质类固醇、米托坦(O,P'-(DDD))、干扰素，以及这些细胞毒性剂的混合物。
其他细胞毒性剂包括但不限于化疗剂，诸如卡铂、顺铂、太平洋紫杉醇、吉西他滨、刺孢霉素、多柔比星、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素C、放线菌素D、环磷酰胺、长春新碱、博来霉素、VEGF拮抗剂、EGFR拮抗剂、铂、紫杉醇、伊立替康、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、亚叶酸、类固醇、环磷酰胺、美法仑、长春生物碱类(例如长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨)、莫司汀类、酪氨酸激酶抑制剂、放射疗法、性激素拮抗剂、选择性雄激素受体调节剂、选择性雌激素受体调节剂、PDGF拮抗剂、TNF拮抗剂、IL-1拮抗剂、白介素(例如IL-12或IL-2)、IL-12R拮抗剂、毒素缀合的单克隆抗体、肿瘤抗原特异性单克隆抗体、爱必妥(Erbitux)、阿瓦斯丁(Avastin)、帕妥珠单抗(Pertuzumab)、抗CD20抗体、美罗华(Rituxan)、奥瑞珠单抗、奥法木单抗、DXL625、或它们的任何组合。来自植物和细菌的有毒酶，诸如蓖麻毒素、白喉毒素和假单胞菌毒素可以与这些治疗剂(例如抗体)缀合以产生细胞类型特异性杀伤试剂(Youle等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 77:5483(1980)；Gilliland等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 77:4539(1980)；Krolick等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 77:5419(1980))。
其他细胞毒性剂包括如Goldenberg在美国专利号6,653,104中所描述的细胞毒性核糖核酸酶。本发明技术的实施方案还涉及放射免疫缀合物，其中在使用或不使用复合物形成剂的情况下，发射α或β粒子的放射性核种稳定偶合至FAP结合剂。此类放射性核素包括β-发射体，诸如磷-32、钪-47、铜-67、镓-67、钇-88、钇-90、碘-125、碘-131、钐-153、镥-177、铼-186或铼-188；以及α发射体，诸如砹-211、铅-212、铋-212、铋-213或锕-225。
说明性可检测部分还包括但不限于辣根过氧化物酶、乙酰胆碱酯酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和荧光素酶。其他说明性荧光材料包括但不限于罗丹明、荧光素、异硫氰酸荧光素、伞形酮、二氯三嗪基胺、藻红蛋白和丹磺酰氯。其他说明性化学发光部分包括但不限于鲁米诺。其他说明性生物发光材料包括但不限于荧光素和水母发光蛋白。其他说明性放射性材料包括但不限于碘-125、碳-14、硫-35、氚和磷-32。
治疗方法
本文所描述的方法和组合物可应用于治疗各种疾病和病症，包括但不限于癌症、感染、免疫病症、纤维化疾病、炎性疾病或疾患、贫血、自身免疫性疾病、心血管疾病、创伤愈合、局部缺血相关疾病、神经退行性疾病、代谢性疾病和许多其他疾病和病症。
另外，任何本发明的剂都可以用于治疗各种疾病和病症，或制造用于治疗各种疾病和病症的药物，所述疾病和病症包括但不限于癌症、感染、免疫病症、炎症性疾病或疾患、纤维化疾病，以及自身免疫性疾病。
在一些实施方案中，本发明涉及对以下一种或多种疾病或患有以下一种或多种疾病的患者的治疗：慢性肉芽肿病、骨硬化病、特发性肺纤维化、弗里德希共济失调(Friedreich’s ataxia)、特应性皮炎、恰加斯病(Chagas disease)、癌症、心力衰竭、自身免疫性疾病、镰状细胞病、地中海贫血、失血、输血反应、糖尿病、维生素B12缺乏症、胶原血管病、舒瓦克曼综合征(Shwachman syndrome)、血小板减少性紫癜、乳糜泻、内分泌缺乏状态诸如甲状腺功能减退或爱迪生氏病(Addison's disease)、自身免疫性疾病如克罗恩氏病(Crohn's Disease)、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎或青少年类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎免疫病症诸如嗜酸性筋膜炎、低免疫球蛋白血症或胸腺瘤/胸腺癌、移植物抗宿主病、白血病前期、非血液综合征(例如唐氏综合征(Down's)、杜波维茨综合征(Dubowwitz)、塞克尔综合征(Seckel))、费尔蒂综合征(Felty syndrome)、溶血性尿毒综合征、骨髓增生异常综合征、夜间阵发性血红蛋白尿症、骨髓纤维瘤、全血细胞减少症、纯红细胞再生障碍、舍亨二氏紫癜(Schoenlein-Henoch purpura)、疟疾、蛋白质饥饿、月经过多、系统性硬化、肝硬化、代谢减退状态和充血性心力衰竭。
在一些实施方案中，本发明涉及对以下一种或多种疾病或患有以下一种或多种疾病的患者的治疗：慢性肉芽肿病、骨硬化病、特发性肺纤维化、弗里德希共济失调、特应性皮炎、恰加斯病、分枝杆菌感染、癌症、硬皮病、肝炎、丙型肝炎、败血性休克和类风湿性关节炎。
在一些实施方案中，本发明技术涉及对癌症或患有癌症的患者的治疗。如本文所使用，癌症是指可能干扰身体器官和系统的正常功能的任何不受控制的细胞生长，并且包括原发性和转移性肿瘤两种。原发性肿瘤或癌症从其原始位置迁移并且种在重要器官可以通过受影响器官的功能减退而最终导致受试者死亡。转移是由于癌细胞从原发性肿瘤播散至身体其他部分而在远离原发性肿瘤位置出现的一个癌细胞或一组癌细胞。转移最终可能导致受试者死亡。举例来说，癌症可以包括良性和恶性癌症、息肉、增生以及休眠肿瘤或微转移。
可以治疗的说明性癌症包括但不限于白血病(包括例如急性骨髓性、急性成淋巴细胞性、慢性骨髓性、慢性淋巴细胞性和毛细胞)、淋巴瘤和骨髓瘤(包括例如霍奇金氏和非霍奇金氏淋巴瘤、轻链、非分泌性、MGUS和浆细胞瘤)和中枢神经系统癌症(包括例如脑(例如神经胶质瘤(例如星形细胞瘤、寡枝神经胶质瘤和室管膜瘤)、脑膜瘤、垂体腺瘤和神经瘤和脊髓肿瘤(例如脑膜瘤和纤维神经瘤)。
可以治疗的说明性癌症包括但不限于基底细胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑和中枢神经系统癌症；乳腺癌；腹膜癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠和直肠癌；结缔组织癌；消化系统癌症；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头颈癌；胃癌(包括胃肠癌)；成胶质细胞瘤；肝癌；肝细胞瘤；上皮内赘瘤；肾脏癌或肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)；黑素瘤；骨髓瘤；成神经细胞瘤；口腔癌(唇、舌、口和咽)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；成视网膜细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌症；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫或子宫内膜癌；泌尿系统癌症；外阴癌；淋巴瘤，包括霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤，以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞性(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级成免疫细胞性NHL；高级成淋巴细胞性NHL；高级非核裂细胞NHL；巨大肿块性NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性成淋巴细胞性白血病(ALL)；急性骨髓性白血病(AML)；毛细胞性白血病；慢性成髓细胞性白血病；以及其他癌瘤和肉瘤；和移植后淋巴组织增生性病症(PTLD)，以及与斑痣性错构瘤相关的异常血管增生、水肿(例如，与脑肿瘤相关的水肿)和梅格斯氏综合征。
在一些实施方案中，本发明技术提供了供治疗癌症用的FAP结合剂，所述FAP结合剂是嵌合体或基于Fc的嵌合蛋白复合物的一部分，所述嵌合体或基于Fc的嵌合蛋白复合物还包含经修饰的信号传导剂。在一些实施方案中，本发明技术的FAP结合剂显著减小和/或消除肿瘤。在一些实施方案中，本发明的FAP结合剂当与其他抗癌剂诸如化疗剂、检查点抑制剂和免疫阻抑剂组合施用至受试者时显著减小和/或消除肿瘤。在一些实施方案中，FAP结合剂与其他抗癌剂的组合协同减小肿瘤大小和/或消除肿瘤细胞。
在一些实施方案中，本发明技术涉及利用FAP结合剂的癌症组合疗法，所述FAP结合剂是嵌合体或基于Fc的嵌合蛋白复合物的一部分，所述嵌合体或基于Fc的嵌合蛋白复合物包含一个或多个靶向部分和一个或多个经修饰的信号传导剂。因此，本发明技术提供了包括例如针对FAP的靶向部分和一个或多个信号传导剂的嵌合或融合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物及其与抗癌剂组合的用途。
举例来说，在一些实施方案中，本发明技术有关于癌症组合疗法，所述癌症组合疗法涉及本文所描述的FAP结合剂与经修饰的信号传导剂(包括但不限于突变的人干扰素，诸如IFNα，包括人干扰素α2)的嵌合体或基于Fc的嵌合蛋白复合物。
在其他实施方案中，本发明的FAP结合剂是包含多个靶向部分且因此呈双特异性或三特异性形式存在的嵌合体或基于Fc的嵌合蛋白复合物的一部分。举例来说，在一些实施方案中，本发明技术有关于癌症组合疗法，所述癌症组合疗法涉及FAP结合剂与本文所描述的检查点抑制剂结合剂(例如抗PD-L1、抗PD-1、抗PD-L2或抗CTLA)和经修饰的信号传导剂(包括但不限于突变的人干扰素，诸如IFNα，包括人干扰素α2)的嵌合体或基于Fc的嵌合蛋白复合物。
在一些实施方案中，所述信号传导剂经过修饰以便对其受体中的一者或多者具有降低的亲和力或活性，从而允许减弱活性(包括激动或拮抗)和/或预防嵌合蛋白或基于Fc的嵌合蛋白复合物的非特异性信号传导或不理想螯合。在一些实施方案中，所述受体处降低的亲和力或活性可通过与一个或多个如本文所描述的靶向部分连接或在包含于本文所公开的基于Fc的嵌合蛋白复合物中后而恢复。
在一些实施方案中，本发明技术涉及对患有微生物感染和/或慢性感染的患者的治疗，或患有微生物感染和/或慢性感染的患者。说明性感染包括但不限于HIV/AIDS、结核病、骨髓炎、乙型肝炎、丙型肝炎、爱波斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)或细小病毒、T细胞白血病病毒、细菌过度生长综合征、真菌或寄生虫感染。
在一些实施方案中，使用本发明的组合物来治疗或预防一种或多种炎症性疾病或疾患，诸如炎症、急性炎症、慢性炎症、呼吸道疾病、动脉粥样硬化、再狭窄、哮喘、过敏性鼻炎、特异性皮炎、脓毒性休克、类风湿性关节炎、炎症性肠病、炎症性盆腔病、疼痛、眼部炎症性疾病、乳糜泻、莱氏综合征(Leigh Syndrome)、甘油激酶缺乏症、家族性嗜酸性粒细胞增多症(FE)、常染色体隐性痉挛性共济失调、喉部炎症性疾病；结核病、慢性胆囊炎、支气管扩张、硅肺病和其他尘肺病。
在一些实施方案中，本发明技术适用于治疗自身免疫性疾病和/或神经退行性疾病。
在一些实施方案中，使用本发明的组合物来治疗或预防以不合需要的CTL活性为特征的一种或多种疾患和/或以高细胞死亡水平为特征的疾患。举例来说，在一些实施方案中，使用本发明的组合物来治疗或预防与不受控制或过度活化的免疫应答相关的一种或多种疾患。
在一些实施方案中，使用本发明的组合物来治疗或预防一种或多种自身免疫性和/或神经退行性疾病或疾患，诸如MS、糖尿病、狼疮、乳糜泻、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)、硬皮病、古德帕斯彻氏综合征(Goodpasture's syndrome)、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener's granulomatosis)、自身免疫性癫痫、拉斯马森氏脑炎(Rasmussen's encephalitis)、原发性胆汁性硬化、硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎、艾迪森氏病(Addison's disease)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto'sthyroiditis)、纤维肌痛症、美尼尔氏综合征(Menier'ssyndrome)；移植排斥(例如，预防同种异体移植排斥)、恶性贫血、类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、皮肌炎、修格连氏综合征(Sjogren's syndrome)、红斑狼疮、重症肌无力、瑞特氏综合征(Reiter's syndrome)、格雷夫氏病(Grave's disease)和其他自身免疫性疾病。
在一些实施方案中，本发明技术用于治疗或预防各种自身免疫性疾病和/或神经退行性疾病。在一些实施方案中，所述自身免疫性疾病和/或神经退行性疾病选自MS、阿尔茨海默氏病(包括但不限于早期发作阿尔茨海默氏病、晚期发作阿尔茨海默氏病和家族性阿尔茨海默氏病(FAD)、帕金森氏病和帕金森症(包括但不限于特发性帕金森氏病、血管帕金森症、药物诱发的帕金森症、路易体痴呆、遗传性帕金森氏病、青少年帕金森氏病)、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化(ALS，包括但不限于偶发性ALS、家族性ALS、西太平洋ALS、青少年ALS、西拉玛雅病(Hiramaya Disease))。
在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防一种或多种肝病症的方法，所述一种或多种肝病症选自病毒性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎、酒精性肝病、脂肪性肝病、脂肪变性、脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝病、药物诱发的肝病、肝硬化、纤维化、肝衰竭、药物诱发的肝衰竭、代谢综合征、肝细胞癌、胆管癌、原发性胆汁性肝硬化(原发性胆汁性胆管炎)、微胆管、吉尔伯特综合征(Gilbert's syndrome)、黄疸和任何其他肝毒性相关迹象。在一些实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防肝纤维化的方法。在一些实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防原发性硬化性胆管炎(PSC)、慢性肝病、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、丙型肝炎感染、酒精性肝病、肝损伤(任选地由进行性纤维化和肝纤维化引起)的方法。在一些实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的方法。在一些实施方案中，本发明提供了减少或预防纤维化的方法。在一些实施方案中，本发明提供了减少或预防肝硬化的方法。在一些实施方案中，本发明提供了减少或预防肝细胞癌的方法。
在一些实施方案中，本发明提供了治疗或预防纤维化疾病的方法，所述纤维化疾病任选地选自肝纤维化、肺纤维化、原发性硬化性胆管炎(PSC)、慢性肝病、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、丙型肝炎感染、酒精性肝病、肝损伤、肝硬化和骨髓增生异常综合征。
在各个实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防心血管疾病的方法，所述心血管疾病诸如影响心脏和血管的疾病或疾患，包括但不限于冠心病(CHD)、脑血管疾病(CVD)、主动脉瓣狭窄、周围性血管病、动脉粥样硬化、动脉硬化、心肌梗塞(心脏病发作)、脑血管疾病(中风)、短暂性脑缺血发作(TIA)、心绞痛(稳定的和不稳定的)、心房纤颤、心律不齐、血管疾病和/或充血性心力衰竭。在各个实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防涉及炎症的心血管疾病的方法。
在各个实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防一种或多种呼吸道疾病的方法，所述呼吸道疾病诸如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、支气管扩张、过敏性鼻炎、窦炎、肺血管收缩、炎症、过敏、呼吸受阻、呼吸窘迫综合征、囊性纤维化、肺高压、肺血管收缩、肺气肿、汉坦病毒肺综合征(Hantavirus pulmonary syndrome，HPS)、吕弗勒氏综合征(Loeffler's syndrome)、古德帕斯彻氏综合征(Goodpasture's syndrome)、胸膜炎、肺炎、肺水肿、肺纤维化、肉样瘤病、与呼吸道合胞病毒感染相关的并发症和其他呼吸道疾病。
在一些实施方案中，本发明技术的方法可用于治疗人受试者。在一些实施方案中，所述人是小儿。在其他实施方案中，所述人是成年人。在其他实施方案中，所述人是老年人。在其他实施方案中，所述人可以称为患者。在一些实施方案中，所述人是女性。在一些实施方案中，所述人是男性。
在某些实施方案中，所述人的年龄在约1至约18个月大、约18至约36个月大、约1至约5岁、约5至约10岁、约10至约15岁、约15至约20岁、约20至约25岁、约25至约30岁、约30至约35岁、约35至约40岁、约40至约45岁、约45至约50岁、约50至约55岁、约55至约60岁、约60至约65岁、约65至约70岁、约70至约75岁、约75至约80岁、约80至约85岁、约85至约90岁、约90至约95岁或约95至约100岁的范围内。在一些实施方案中，所述人的年龄超过30岁。
免疫调节
在一些实施方案中，本发明的组合物能够或可用于免疫调节方法中。举例来说，在一些实施方案中，本发明的治疗方法可以包括本文所描述的免疫调节。在一些实施方案中，所述免疫调节包括在树突状细胞(DC)的情形下的IFN信号传导，包括经修饰的IFN信号传导。
在一些实施方案中，提供了多特异性FAP结合剂。在一些实施方案中，本发明技术的这种多特异性FAP结合剂识别并结合至FAP和在一个或多个免疫细胞上发现的一个或多个抗原，所述免疫细胞可以包括但不限于巨核细胞、血小板、红细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、T淋巴细胞(例如，细胞毒性T淋巴细胞、T辅助细胞、自然杀伤细胞)、B淋巴细胞、浆细胞、树突状细胞或它们的子集。在一些实施方案中，所述FAP结合剂特异性地结合至目标抗原并且有效地直接或间接地募集一个或多个免疫细胞。
在一些实施方案中，所述FAP结合剂特异性地结合至目标抗原，并且有效地直接或间接地募集一个或多个免疫细胞以引起免疫阻抑作用，例如，所述FAP结合剂直接或间接地募集免疫阻抑性免疫细胞。在一些实施方案中，所述免疫阻抑性免疫细胞是调控T细胞(或“Treg”，如本文所使用，是指调节免疫系统、消除自身免疫性疾病、维持对自身抗原的耐受性以及阻碍抗肿瘤免疫应答的T细胞亚群)。其他免疫抑制性免疫细胞包括骨髓阻抑细胞(或“MSC”，如本文所使用，是指由其骨髓起源、不成熟状态和有效阻抑T细胞应答的能力定义的异质性细胞群)；肿瘤相关嗜中性粒细胞(或“TAN”，如本文所使用，是指能够阻抑免疫应答的嗜中性粒细胞子集)；肿瘤相关巨噬细胞(或“TAM”，如本文所使用，是指可以减少免疫应答的巨噬细胞子集)、M2巨噬细胞和/或诱导肿瘤的肥大细胞(如本文所使用，是指骨髓来源的长寿异质性细胞群的子集)。此外，免疫阻抑性免疫细胞包括Th2细胞和Th17细胞。另外，免疫阻抑性免疫细胞包括表达一个或多个检查点抑制受体(例如免疫细胞上表达的预防或抑制不受控制的免疫应答的受体，包括CTLA-4、B7-H3、B7-H4、TIM-3)的免疫细胞，例如CD4+和/或CD8+T细胞。参见Stagg,J.等人,Immunotherapeutic approach in triple-negative breast cancer.Ther Adv Med Oncol.(2013)5(3):169-181)。
在一些实施方案中，所述FAP结合剂刺激调控T细胞(Treg)增殖。Treg细胞以Foxp3(叉头框p3)转录因子的表达为特征。大部分Treg细胞是CD4+和CD25+，并且可以视为辅助T细胞的子集，但小群可能是CD8+。因此，将要通过本发明技术方法加以调节的免疫应答可以包括任选地响应于抗原而诱导Treg细胞的增殖。因此，所述方法可以包括对受试者施用包含所述抗原的组合物，其中所述抗原与对FAP具有亲和力的结合剂相关。所述抗原可以与促进Treg细胞增殖的佐剂一起施用。
只要这种方法包括响应于特定抗原而刺激Treg细胞的增殖和分化，它就可以被认为是一种刺激免疫应答的方法。然而，鉴于Treg细胞能够以其他方式调节免疫系统的其他细胞对抗原的应答，例如抑制或阻抑其活性，对免疫系统的作用总体上可以调节(例如阻抑或抑制)对该抗原的应答。因此，本发明技术的这个方面的方法同样可以被认为是调节(例如抑制或阻抑)对抗原的免疫应答的方法。
在一些实施方案中，所述方法治疗性地或预防性地抑制或阻抑对特定抗原的不合需要的免疫应答，甚至在预先存在针对该抗原的免疫力或持续免疫应答的受试者中亦如此。这可能特别有用，例如，在治疗自身免疫性疾病方面。
在某些条件下，还有可能通过使特定抗原靶向表达FAP的抗原呈递细胞而使受试者耐受所述抗原。本发明技术因此提供了一种用于诱导受试者对抗原的耐受性的方法，所述方法包括对所述受试者施用包含所述抗原的组合物，其中所述抗原与对FAP具有亲和力的结合剂相关，并且其中所述抗原是在不存在佐剂的情况下施用。在这种情形下，耐受性典型地涉及消耗将能够以其他方式应答该抗原的免疫细胞或诱导此类免疫细胞对抗原的应答的持续减少。
可能特别需要产生针对受试者表现出不合需要的免疫应答或处在发展不合需要的免疫应答的风险下的抗原的Treg应答。举例来说，它可能是自身免疫性疾病中对其发生免疫应答的自身抗原。特定抗原已经被鉴定为可能对发病重要的自身免疫性疾病的实例包括多发性硬化(髓鞘碱性蛋白)、胰岛素依赖性糖尿病(谷氨酸脱羧酶)、胰岛素抗性糖尿病(胰岛素受体)、乳糜泻(醇溶蛋白)、大疱性类天疱疮(第XVII型胶原蛋白)、自身免疫性溶血性贫血(Rh蛋白)、自身免疫性血小板减少症(GpIlb/Illa)、重症肌无力(乙酰胆碱受体)、格雷夫氏病(促甲状腺激素受体)、肾小球性肾炎诸如古德帕斯彻氏病(α3(IV)NC1胶原蛋白)和恶性贫血(内因子)。或者，靶抗原可能是外源性抗原，所述外源性抗原刺激还会引起对宿主组织的破坏的应答。举例来说，急性风湿热是由对与心肌细胞抗原交叉反应的链球菌抗原的抗体应答引起。因此这些抗原或其特定片段或表位可能是用于本发明技术的合适抗原。
在一些实施方案中，本发明的剂或使用这些剂的方法破坏了FAP信号传导(例如经由中和FAP)，例如通过降低或抑制FAP与其配体的结合。一些自身免疫性疾病以异常高水平的细胞死亡为特征，并且认为与这些细胞相关的对自身抗原的免疫应答可能促成了这些疾患的发病。因此可以使用FAP拮抗剂来防止FAP与死细胞和垂死的细胞(例如经历免疫原性细胞死亡的那些细胞)中暴露的配体结合，并且可以因此抑制或防止刺激对这些抗原的免疫应答。
在一些实施方案中，本发明技术的剂或使用这些剂的方法降低或阻抑自身反应性T细胞。在一些实施方案中，所述多特异性FAP结合剂在嵌合体或基于Fc的嵌合蛋白复合物的情形下任选地通过干扰素信号传导引起这种免疫阻抑。在一些实施方案中，所述多特异性FAP结合剂刺激可以阻抑自身反应性T细胞的PD-L1或PD-L2信号传导和/或表达。在一些实施方案中，所述FAP结合剂在嵌合体或基于Fc的嵌合蛋白复合物的情形下任选地通过干扰素信号传导引起这种免疫阻抑。在一些实施方案中，所述FAP结合剂刺激可以阻抑自身反应性T细胞的PD-L1或PD-L2信号传导和/或表达。
在一些实施方案中，本发明的方法包括对调控T细胞与效应T细胞的比进行调节以有利于免疫阻抑，例如，以治疗自身免疫性疾病。举例来说，在一些实施方案中，本发明的方法降低和/或抑制以下一者或多者：细胞毒性T细胞；效应记忆T细胞；中枢记忆T细胞；CD8+干细胞记忆效应细胞；TH1效应T细胞；TH2效应T细胞；TH9效应T细胞；TH17效应T细胞。举例来说，在一些实施方案中，本发明的方法增加和/或刺激以下一者或多者：CD4+CD25+FOXP3+调控T细胞、CD4+CD25+调控T细胞、CD4+CD25-调控T细胞、CD4+CD25高调控T细胞、TIM-3+PD-1+调控T细胞、淋巴细胞激活基因-3(LAG-3)’调控T细胞、CTLA-4/CD152+调控T细胞、神经纤毛蛋白-1(Nrp-1)±调控T细胞、CCR4+CCR8+调控T细胞、CD62L(L-选择素)’调控T细胞、CD45RB低调控T细胞、CD127低调控T细胞、LRRC32/GARP+调控T细胞、CD39+调控T细胞、GITR+调控T细胞、LAP’调控T细胞、1B11+调控T细胞、BTLA+调控T细胞、第1型调控T细胞(Tr1细胞)、第3型T辅助(Th3)细胞、自然杀伤T细胞表型调控细胞(NKTreg)、CD8+调控T细胞、CD8+CD28-调控T细胞和/或分泌IL-10、IL-35、TGF-3、TNF-a、半乳凝素-1、IFN-y和/或MCP1的调控T细胞。
在一些实施方案中，本发明的方法有利于免疫抑制信号超过免疫刺激信号。在一些实施方案中，本发明的方法允许逆转或阻抑免疫激活或共刺激信号。在一些实施方案中，本发明的方法允许提供免疫抑制信号。举例来说，在一些实施方案中，本发明的剂和降低对免疫刺激信号的影响的方法不限于以下一种或多种：4-1BB、OX-40、HVEM、GITR、CD27、CD28、CD30、CD40、ICOS配体；OX-40配体、LIGHT(CD258)、GITR配体、CD70、B7-1、B7-2、CD30配体、CD40配体、ICOS、ICOS配体、CD137配体和TL1A。此外，在一些实施方案中，本发明的剂和增加对免疫抑制信号的影响的方法不限于以下一种或多种：CTLA-4、PD-L1、PD-L2、PD-1、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160(又称为BY55)、CGEN-15049、CHK 1和CHK2激酶、A2aR、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)和各种B-7家族配体(包括但不限于B7-1、B7-2、B7-DC、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H5、B7-H6和B7-H7。
药盒
本发明技术还提供了用于施用本文所描述的任何FAP结合剂(例如具有或没有其他治疗剂)的药盒。所述药盒是包括至少一种本文所描述的本发明药物组合物在内的材料或组分的组合体。因此，在一些实施方案中，所述药盒含有至少一种本文所描述的药物组合物。
配置在药盒中的组分的确切特性取决于其预定目的。在一个实施方案中，所述药盒被配置用于治疗人受试者的目的。
在所述药盒中可以包括使用说明书。使用说明书典型地包括有形表示，其描述了使用所述药盒的组分实现所期望的治疗结果，诸如治疗癌症时将要采用的技术。任选地，所述药盒还含有本领域技术人员容易了解的其他有用组分，诸如稀释剂、缓冲剂、药学上可接受的载体、注射器、导管、敷涂器、吸移工具或测量工具、包扎材料或其他有用的附件。
装配在药盒中的材料和组分可以提供给从业人员，以保持其可操作性和效用的任何便利且适合的方式储存。举例来说，这些组分可以在室温、冷藏温度或冷冻温度下提供。这些组分典型地包含在合适的包装材料中。在一些实施方案中，包装材料是由众所周知的方法构造，优选地以提供无菌、无污染的环境。包装材料可以具有指示所述药盒和/或其组分的内含物和/或目的的外部标签。
定义
如本文所使用，“一个/一种(a/an)”或“所述(the)”可以意指一个或多于一个。
此外，术语“约”当与引用的数值指示结合使用时意指所引用的数值指示加或减所述引用的数值指示的至多10％。举例来说，语言“约50”覆盖45至55的范围。
如本文所使用，术语“有效量”是指足以实现所期望的治疗和/或预防效果的量，例如使得疾病或病症或与疾病或病症相关的一种或多种征象或症状得以预防或减少的量。在治疗或预防应用的情形中，施用至受试者的组合物的量将取决于疾病的程度、类型和严重程度，以及个体的特征(诸如总体健康状况、年龄、性别、体重和耐药性)。技术人员将能够根据这些和其他因素确定适当的剂量。所述组合物还可以与一种或多种其他治疗性化合物组合施用。在本文所描述的方法中，可以将所述治疗性化合物施用至患有疾病或病症的一种或多种征象或症状的受试者。
如本文所使用，如果活性和/或效应的读出在剂或刺激物存在下相对于不存在此类调节降低了显著量，诸如降低了至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或更多、多达并且包括至少约100％，那么某性质“降低”。如本领域普通技术人员所理解，在一些实施方案中，活性降低并且一些下游读出将降低但其他下游读出可以增加。
相反地，如果活性和/或效应的读出在剂或刺激物存在下相对于不存在此类剂或刺激物增加了显著量，例如增加了至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或更多、多达并且包括至少约100％或更多、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍，那么活性“增加”。
如本文所提及，除非另外规定，否则全部组成百分比都以总组合物的重量计。如本文所使用，词语“包括”及其变化形式旨在是非限制性的，使得在列表中对项目的列举不应排除也可以用于这项技术的组合物和方法中的其他类似项目。类似地，术语“可以(can/may)”及其变化形式旨在是非限制性的，使得一个实施方案可以包含某些要素或特征的列举不排除本发明技术的不含有那些要素或特征的其他实施方案。
尽管开放性的术语“包含”作为术语诸如包括、含有或具有的同义词在本文中用以描述和要求本发明技术，但本发明技术或其实施方案可以可选地使用替代性术语如“由……组成”或“基本上由……组成”加以描述。
如本文所使用，词语“优选的”和“优选地”是指所述技术的在某些情况下提供某些益处的实施方案。然而，其他实施方案在相同或其他情况下也可以是优选的。此外，列举一个或多个优选实施方案不意指其他实施方案是无用的，并且不打算将其他实施方案从所述技术的范围中排除。
如本文所使用，化合物的“治疗有效量”或“药理学有效量”或“药理学有效剂量”是指至少疾病或病症的生理效应得以改善的化合物水平。治疗益处还包括中断或减缓潜在疾病或病症的进展，无关于是否实现了改善。治疗有效量可以在一次或多次施用中给予。构成治疗有效量的化合物量将根据化合物、病症及其严重程度以及待治疗受试者的总体健康状况、年龄、性别、体重和耐药性而变化，但是可以由本领域普通技术人员常规地确定。
有效量、毒性和治疗功效可以通过标准药物程序在细胞培养物或实验动物中测定，例如测定LD50(约50％群体的致死剂量)和ED50(在约50％群体中具有治疗有效性的剂量)。剂量可以取决于所用剂型和所用施用途径而变化。毒性与治疗效果之间的剂量比率是治疗指数并且可以表示为比率LD50/ED50。在一些实施方案中，展现较大治疗指数的组合物和方法是优选的。治疗有效剂量最初可以由体外测定(包括例如细胞培养物测定)加以估算。此外，剂量可以在动物模型中配制以实现包括如在细胞培养物中或在适当动物模型中测定的IC50的循环血浆浓度范围。所描述的组合物在血浆中的含量可以例如通过高效液相色谱法加以测量。任何特定剂量的效应都可以通过合适的生物测定来监测。剂量可以由医师确定并且根据需要调整以适应观察到的治疗效果。
在某些实施方案中，效应将引起至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约50％、至少约70％或至少约90％的可定量变化。在一些实施方案中，效应将引起约10％、约20％、约30％、约50％、约70％或甚至约90％或更大的可定量变化。治疗益处还包括中断或减缓潜在疾病或病症的进展，无关于是否实现了改善。
如本文所使用，“治疗方法”同样适用于组合物用于治疗本文所描述的疾病或病症的用途和/或组合物用于制造用以治疗本文所描述的疾病或病症的药物的一种和/或多种用途。
实施例
术语Actaferon(AFN)在本文中偶尔用于指代本文所描述的嵌合蛋白(在实施例中提供了关于嵌合蛋白形式的详细信息)。
实施例1.人FAP VHH文库的产生
在第0天、第7天、第14天、第21天、第28天和第35天对美洲驼进行皮下注射，每次注射约200μg重组人FAPα细胞外结构域。在第40天，从美洲驼收集约100ml抗凝血以供淋巴细胞制备。从这些淋巴细胞构建VHH文库以筛选抗原特异性VHH的存在。将文库在固相包被抗原(100μg/ml，100mM NaHCO3 pH 8.2)上进行3轮淘选。基于阳性菌落的序列数据，区分出96个不同的全长VHH，它们属于13个不同的CDR3组(参见表6，SEQ ID No:2-42、46-86和837-850)。
实施例2：人FAP VHH表征
将编码来自实施例1的96个人FAP结合VHH的表达载体(pMECS)转化到WK6细胞中。IPTG过夜刺激后，将VHH(具有C端His标签)在周质提取物中表达。将这些提取物用于FACS结合测定：用编码人FAP质粒的质粒(pMET7 FLAG-hFAP)、编码小鼠FAP的质粒(pMET7 FLAG-mFAP)或作为对照的空载体(MOCK)瞬时转染HEK293T细胞。在转染后两天，将细胞重悬并在FACS缓冲液(PBS+0.5mM EDTA+3％FBS)中与1/5稀释的周质提取物一起孵育。使用FITC偶联的抗His Ab(GENSCRIPT)检测VHH结合。使用MACSQuant X仪器(MILTENYI BIOTEC)采集样品，并使用FlowLogic软件(MILTENYI BIOTEC)进行分析。数据汇总在图1中。
更详细地研究了所选择的11个VHH与如上所述的人、小鼠和食蟹猴FAP的结合。简单来说，将以不同方式转染的HEK293T细胞与连续稀释的基于金属亲和力的纯化VHH一起孵育两小时。在FACS中使用FITC偶联的抗His Ab(Genscript)检测结合。令人惊讶的是，VHH对人、小鼠和食蟹猴具有交叉反应性。示出VHH与人、小鼠和食蟹猴FAP的交叉反应性的数据汇总于图2中。2PE14的数据示于图2A中，2PE17的数据示于图2B中，2PE36的数据示于图2C中，2PE40的数据示于图2D中，2PE42的数据示于图2E中，2PE44的数据示于图2F中，3PE12的数据示于图2G中，3PE42的数据示于图2H中，3PE57的数据示于图2I中，3PE93的数据示于图2J中，3PE94的数据示于图2K中。
实施例3：人FAP ActaFeron(AFN)
基于对人、小鼠和食蟹猴FAP的亲和力，选择了三个FAP VHH用于在异源二聚体的“旋钮入孔洞Fc’AFN情形下进行评估：2PE14、3PE12和3PE42。为此，FAP VHH序列经由柔性20*GGS接头且在pcDNA3.4表达载体中融合至含有L234A_L235A_K322Q效应子突变和“孔洞”修饰Y349C_T366S_L368A_Y407V的人IgG1 Fc序列(参见下文序列)。第二AFN配偶体(也克隆到pcDNA3.4载体中)，由含有L234A_L235A_K322Q效应子突变和“旋钮”修饰S354C_T366W的人IgG1 Fc序列与具有AFN突变R149A和O-糖基化突变T106E的hIFNa2序列之间的融合物组成。
为了产生异源二聚体的“旋钮入孔洞”AFN，根据制造商的说明，将两种质粒的组合转染到ExpiCHO细胞(THERMOFISHER)中。转染后七天，使用蛋白A旋转板(THERMOFISHER)纯化重组蛋白，定量，并使用SDS-PAGE进行纯度测试。
在亲本HL116细胞(用p6-16荧光素酶报告基因稳定转染的IFN应答细胞系)和衍生的稳定转染的HL116-hFAP细胞上测量所得AFN(2PE14-AFN、3PE12-AFN和3PE42-AFN)的生物活性。将细胞接种过夜，并用连续稀释的FAP VHH AFN刺激6小时。在EnSight多模式酶标仪(Perkin Elmer)上测量荧光素酶活性。图3中的数据清楚地示出FAP靶引导致HL116-hFAP细胞中的IFN样信号传导，而在亲本HL116细胞中几乎观察不到任何报告基因激活。值得注意的是，HL116和HL116-hFAP细胞对野生型IFNa2的敏感性相当。
2PE14 AFN的结构：
·hFAP VHH 2PE14-20*GGS-hIgG1 Fc_L234A_L235A_K322Q_Y349C_T366S_L368A_ Y407V
2PE14 AFN的氨基酸序列(hFAP VHH 2PE14的氨基酸序列以粗体字母显示，20*GGS接头的氨基酸序列以斜体字母显示，并且hIgG1Fc_L234A_L235A_K322Q_Y349C_T366S_L368A_Y407V的氨基酸序列以加下划线字母显示)：
3PE12 AFN的结构：
·hFAP VHH 3PE12-20*GGS-hIgG1 Fc_L234A_L235A_K322Q_Y349C_T366S_L368A_ Y407V
3PE12 AFN的氨基酸序列(hFAP VHH 3PE12的氨基酸序列以粗体字母显示，20*GGS接头的氨基酸序列以斜体字母显示，并且hI gG1 Fc_L234A_L235A_K322Q_Y349C_T366S_L368A_Y407V的氨基酸序列以加下划线字母显示)：
3PE42 AFN的结构：
·hFAP VHH 3PE42-20*GGS-hIgG1 Fc_L234A_L235A_K322Q_Y349C_T366S_L368A_ Y407V
3PE12 AFN的氨基酸序列(hFAP VHH 3PE42的氨基酸序列以粗体字母显示，20*GGS接头的氨基酸序列以斜体字母显示，并且hIgG1Fc_L234A_L235A_K322Q_Y349C_T366S_L368A_Y407V的氨基酸序列以加下划线字母显示)：
·hIgG1 Fc_L234A_L235A_K322Q_S354C_T366W-20*GGS-hIFNa2_T106E_R149A
实施例4：FAP VHH序列的人源化
在该实施例中，两个FAP VHH 2PE14和3PE42的序列是人源化的。使用四个“opt”变体(序列P-1902至P-1905)评估人源化，这些变体含有以下突变的组合：Q1D、Q5V、P60A、A74S、S82N、K83R和Q108L。另外，两个VHH在CDR1中含有脱酰胺位点(N32)，而VHH 3PE42还在CDR1中含有额外的氧化基序(M31)。通过对任何其他氨基酸的单个突变(C或P除外；序列P-1906至P-1922用于脱酰胺，以及P-1924至P-1941用于氧化基序)，消除了两个序列的不稳定性。将由Twist Biosciences订购的序列在pET28载体中用C端His标签克隆，并转化到BL21细胞中。VHH在过夜IPTG刺激后表达，并根据制造商的指南使用HisPur钴旋转板(HisPurCobalt Spin Plates)(ThermoFisher)从周质提取物中纯化。使用生物层干涉法(BLI)技术在Octet RED96仪器(ForteBio)上测量所得VHH对FAP的亲和力。
简单来说，使用IP用抗体生物素化试剂盒(Pierce)对重组FAP蛋白(BioLegend)进行生物素化，并将其用于加载链霉亲和素传感器(ForteBio)。监测三种浓度(10、5和2.5nM)的FAP VHH的缔合和解离，并用于计算缔合和解离常数，并由此计算亲和力。FAP VHH变体的结果汇总于表7中。N32的优选突变包括F、Q、R和W。M31的优选突变包括A、D、K、L、N、Q、R、S和W。
表7：
序列：
·P-1901：2PE14 QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSINAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTQVTVSS(SEQ IDNO:1045)
·P-1902：2PE14_opt1(Q1D_Q5V_A74S_K83R_Q108L；粗体字母表示突变)VQLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSINAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNKNTVYLQMSSLPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTVTVSS(SEQ ID NO:1046)
·P-1903：2PE14_opt2(Q1D_Q5V_P60A_A74S_K83R_Q108L；粗体字母表示突变)VQLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSINAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYDSVKGRFTISRDNKNTVYLQMSSLPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTVTVSS(SEQ ID NO:1047)
·P-1904：2PE14_opt3(Q1D_Q5V_A74S_S82N_K83R_Q108L；粗体字母表示突变)VQLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSINAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNKNTVYLQMSLPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTVTVSS(SEQ ID NO:1048)
·P-1905：2PE14_opt4(Q1D_Q5V_P60A_A74S_S82N_K83R_Q108L；粗体字母表示突变)VQLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSINAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYDSVKGRFTISRDNKNTVYLQMSLPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTVTVSS(SEQ ID NO:1049)
·P-1906：2PE14_N32A(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSIAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1050)
·P-1907：2PE14_N32D(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSIAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1051)
·P-1908：2PE14_N32E(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSIAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1052)
·P-1909：2PE14_N32F(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSIAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1053)
·P-1910：2PE14_N32G(粗体字母表示突变)
·QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSIAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1054)
·P-1911：2PE14_N32H(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSIAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1055)
·P-1912：2PE14_N32I(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1056)
·P-1913：2PE14_N32K(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSIAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1057)
·P-1914：2PE14_N32L(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1058)
·P-1915：2PE14_N32P(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSIAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1059)
·P-1916：2PE14_N32Q(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSIAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1060)
·P-1917：2PE14_N32R(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSIAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1061)
·P-1918：2PE14_N32S(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSIAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1062)
·P-1919：2PE14_N32T(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSIAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1063)
·P-1920：2PE14_N32V(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSIAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1064)
·P-1921：2PE14_N32W(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSIAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1065)
·P-1922：2PE14_N32Y(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSIAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1066)
·P-1923：3PE42(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGESLRLSCAVSGSTSSMNAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1067)
·P-1924：3PE42_M31A(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGESLRLSCAVSGSTSSNAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1068)
·P-1925：3PE42_M31D(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGESLRLSCAVSGSTSSNAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1069)
·P-1926：3PE42_M31E(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGESLRLSCAVSGSTSSNAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1070)
·P-1927：3PE42_M31F(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGESLRLSCAVSGSTSSNAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1071)
·P-1928：3PE42_M31G(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGESLRLSCAVSGSTSSNAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1072)
·P-1929：3PE42_M31H(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGESLRLSCAVSGSTSSNAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1073)
·P-1930：3PE42_M31I(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGESLRLSCAVSGSTSSNAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1074)
·P-1931：3PE42_M31K(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGESLRLSCAVSGSTSSNAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1075)
·P-1932：3PE42_M31L(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGESLRLSCAVSGSTSSNAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1076)
·P-1933：3PE42_M31N(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGESLRLSCAVSGSTSSNAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1077)
·P-1934：3PE42_M31P(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGESLRLSCAVSGSTSSNAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1078)
·P-1935：3PE42_M31Q(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGESLRLSCAVSGSTSSNAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1079)
·P-1936：3PE42_M31R(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGESLRLSCAVSGSTSSNAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1080)
·P-1937：3PE42_M31S(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGESLRLSCAVSGSTSSNAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1081)
·P-1938：3PE42_M31T(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGESLRLSCAVSGSTSSNAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1082)
·P-1939：3PE42_M31V(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGESLRLSCAVSGSTSSNAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1083)
·P-1940：3PE42_M31W(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGESLRLSCAVSGSTSSNAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1084)
·P-1941：3PE42_M31Y(粗体字母表示突变)QVQLQESGGGLVQPGESLRLSCAVSGSTSSNAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:1085)
实施例5：FAP VHH变体
在该实施例中，来自人源化(实施例4)的观察结果被结合起来产生了六个另外的VHH变体。在这些变体中，我们结合了人源化突变(Q1D_Q5V_A74S_K83R_Q108L，有和没有S82N)、N32W脱酰胺突变，以及在3PE42的情况下的氧化突变M42A或M42D。如上所述产生并纯化变体，并测量亲和力。图24中的数据说明2PE14的这些突变的组合对亲和力没有严重影响(2PE14_OptA)，甚至导致亲和力明显增加(2PE14_OptB)。对于3PE42，3PE42_OptB中的突变组合对亲和力没有严重影响。
序列：
·P-1901：2PE14 QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSINAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTQVTVSS(SEQ IDNO:1045)
·P-2219：2PE14_OptA(Q1D_Q5V_N32W_A74S_K83R_Q108L)
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSIWAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMSSLRPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:1086)
·P-2220：2PE14_OptB(Q1D_Q5V_N32W_A74S_S82N_K83R_Q108L)
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSIWAVAWYRQAPGKRRELVAGISGGGVTNYPDSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNLWPPRASPGGRVYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:1087)
·P-1923：3PE42 QVQLQESGGGLVQPGESLRLSCAVSGSTSSMNAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTQVTVSS(SEQ IDNO:1088)
·P-2221：3PE42_OptA(Q1D_Q5V_M31A_N32W_A74S_K83R_Q108L)
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTSSAWAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMSSLRPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:1089)
·P-2222：3PE42_OptB(Q1D_Q5V_M31D_N32W_A74S_K83R_Q108L)
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTSSDWAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMSSLRPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:1090)
·P-2223：3PE42_OptC(Q1D_Q5V_M31A_N32W_A74S_S82N_K83R_Q108L)
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTSSAWAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:1091)
·P-2224：3PE42_OptD(Q1D_Q5V_M31D_N32W_A74S_S82N_K83R_Q108L)
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTSSDWAMAWYRQAPGKRRELVAGISGGGATNYPDSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCNLWPPRASPGGGVYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:1092)
等效方案
尽管已经结合本发明技术的具体实施方案描述了本发明技术，但应当理解，总体来说，按照本发明技术的原理，能够进行进一步修改并且本申请意在涵盖本发明技术的任何变化方案、用途或改编，并且包括如在本发明技术所属领域内的已知或惯用实践范围内和如可以应用于上文所阐述的基本特征和如下所附权利要求书范围内的对本公开的背离。
本领域技术人员仅仅使用常规实验就将认识到或者能够确定本文具体描述的具体实施方案的众多等效方案。此类等效方案意图涵盖在以下权利要求书的范围内。
以引用的方式并入
本文引用的所有专利和出版物特此都以引用方式整体并入。