附图说明

图1示出的流程图举例说明了在创伤的治疗期间采取的步骤。

图2示出的流程图举例说明了为治疗被分类为急性创伤而采取的步骤。

图3示出的流程图举例说明了为治疗被分类为慢性创伤而采取的步骤。

图4示出了使用实施例1中概括的流程，使用所述创伤治疗组合物治疗的患者创伤的实例。

图5示出了糖尿病患者足跟中的创伤，其已使用实施例1中概述的流程治疗。

图6提供了按照本发明的方法使用系统对全血进行分级的结果的图示说明。其说明了在每种级分中通常存在的细胞类型，以及从PPP经PRP到红细胞部分的变化的血细胞比容水平。为2％和7％的血细胞比容水平提供了粗略的血小板水平。

图7提供了在实施例中使用的系统的PRP输出的图示说明。为了评估系统PRP输出与全血之间的差异，以2％、5％、7％、10％和15％的血细胞比容设置从6位健康供体的静脉血制备系统PRP。血小板、白细胞(WBC)和嗜中性粒细胞(NE)的浓度使用标准的全血计数(CBC)来测量。

发明详述

在本发明的第一方面，提供了一种制造创伤治疗组合物的方法，其中所述方法包括：

i)将全血样品分级成包括富血小板血浆(PRP)样品、贫血小板血浆(PPP)样品和红细胞样品在内的多个样品，其中所述PRP样品具有1-10％的血细胞比容水平；

ii)对一部分所述PPP和/或PRP样品进行加工，以促进所述PPP和/或PRP中存在的自体凝血酶原的裂解，产生自体凝血酶；以及

iii)将所述PRP样品与一部分所述PPP样品和一部分在步骤(ii)中产生的所述凝血酶合并，以产生所述创伤治疗组合物；并且

其中步骤ii)在低于15℃的温度下进行。

当在本文中使用时，术语“全血”是本技术领域中的术语，并且是指包含血浆、红细胞、白细胞和血小板的组合物。因此，全血可以是从个体抽取的含有所有天然组分的新鲜血液样品。全血样品也可以包含柠檬酸盐或其他适合的缓冲剂，以帮助阻止所述样品的凝结。设想了所述缓冲剂应该是药学上可接受的。

术语“富血小板血浆(PRP)”是指含有高比例或浓度的血小板(即高于全血)的血浆，它也基本上不含红细胞。所述PRP通过将全血样品分级(例如通过离心)来制备，并以比在所述全血样品中存在的更高的浓度包含血小板。根据所述本发明的第一方面，所述PRP可以含有超过600×10⁹个血小板/升，或超过800×10⁹个血小板/升，或超过1000×10⁹个血小板/升，或超过1200×10⁹个血小板/升，或超过1400×10⁹个血小板/升，或超过1600×10⁹个血小板/升，或超过1800×10⁹个血小板/升，或超过2000×10⁹个血小板/升，或超过2200×10⁹个血小板/升，或超过2400×10⁹个血小板/升。此外，根据所述本发明的第一方面，所述PRP可以含有600至2400×10⁹个血小板/升，或800至2200×10⁹个血小板/升，或1000至2000×10⁹个血小板/升，或1200至1800×10⁹个血小板/升，或1400至1600×10⁹个血小板/升，或其任何组合。所述“贫血小板血浆(PPP)”通过将全血样品分级来产生，并且是指含有低比例的血小板，例如低于1×10⁹个血小板/升或低于1×10⁸个血小板/升或低于1×10⁷个血小板/升的血浆。

正如在下文中更详细解释的，设想了所述PRP中的最佳血小板水平直接从步骤i)中为产生所述PRP进行的全血的分级获得，或在步骤i)后用PPP稀释所述PRP后获得。因此，所述PRP中的最佳血小板浓度在添加自体凝血酶(和任选的抗坏血酸)之前获得。来自于系统的输出的图示说明提供在图7中。

当在本文中使用时，术语“自体凝血酶”是指从与PRP所源自的同一全血样品衍生的凝血酶。

按照本发明的第一方面产生的创伤治疗组合物可以包含200至2400×10⁹个血小板/升，或400至2400×10⁹个血小板/升，600至2400×10⁹个血小板/升，或800至2200×10⁹个血小板/升，或1000至2000×10⁹个血小板/升，或1200至1800×10⁹个血小板/升，或1400至1600×10⁹个血小板/升。

在所述本发明的第一方面的特定实施方式中，所述方法还包括在添加所述凝血酶的同时、之前或之后向所述创伤治疗组合物添加抗坏血酸(维生素C)的步骤。所述抗坏血酸以0.5mM至5mM之间、优选地2mM至4mM之间、最优选地2.5mM至3mM之间的浓度添加。在本发明的第一方面的优选实施方式中，抗坏血酸(维生素C)被添加到所述PRP样品。

本领域中存在许多已知方法适合于促进凝血酶原裂解成凝血酶并适合用于本发明。在本发明的第一方面的特定实施方式中，所述方法的阶段ii)包括将一部分所述PPP样品和/或PRP样品与包含氯化钙和/或乙醇的组合物相接触。包含乙醇中的氯化钙的溶液特别适合于促进凝血酶原裂解成凝血酶。所述溶液可以含有约5至20％w/v之间的氯化钙或约8至15％w/v之间的氯化钙，优选地所述溶液含有10％w/v的氯化钙。所述氯化钙可以存在于含有乙醇的溶液中，其中所述溶液可以含有约10至30％v/v之间的乙醇或约10至20％v/v之间的乙醇，优选地所述溶液含有约17％v/v的乙醇。存在适合于对一部分所述PPP和/或PRP样品进行加工以促进所述PPP和/或PRP中存在的自体凝血酶原裂解以产生自体凝血酶的可商购试剂盒；此类试剂盒的非限制性实例包括Biotherapy Services ActivAT试剂盒Arthrex Thrombinator。

在本发明的第一方面，步骤ii)在低于15℃的温度下进行。具体来说，步骤ii)可以在2℃至15℃、4℃至15℃、6℃至15℃、8℃至15℃、10℃至15℃或12℃至15℃的温度下进行。在这个实施方式中，将所述一部分PPP和/或PRP样品和凝血酶原裂解反应所需的溶液冷却至低于15℃。通常，这可以通过在反应之前和期间将所述溶液储存在冰上来实现。这导致所述裂解反应在较低温度下发生。当将所述凝血酶与所述PRP合并时，血小板变得被激活，并导致凝胶的形成。由于已知较高温度提高反应动力学，因此在较低温度下进行所述裂解反应产生的凝血酶样品产生更加固体和有效的凝胶，这一点非常令人吃惊。为免生疑问，设想了所述第一方面的步骤i)通常在室温下进行。适合于分级全血样品的方法在本领域中是已知的。本发明的具体特点在于使用离心来分级所述全血样品。在所述分级阶段中，可以分两个阶段进行离心。初始离心阶段可用于将红细胞与其他组分分离开，然后进行第二离心阶段，其帮助分级血小板并形成所述PRP。所述初始离心阶段可以在3,000至4,500rpm之间、优选地3,200至4,000rpm之间、更优选地在3,700rpm下进行。所述第二离心阶段可以在2,000至3,500rpm之间、优选地2,500至3,000rpm之间、更优选地在2,700rpm下进行。这些离心步骤可以优选地使用系统进行。

在所述分级过程中，所述PRP样品会再分为子级，产生含有高浓度白细胞的PRP和含有低浓度白细胞的PRP。因此，可以产生含有不同白细胞水平的PRP。当在本文中使用时，术语“血细胞比容水平”是指从所述全血样品分级的PRP中存在的白细胞的近似量。

为了产生具有不同血细胞比容水平的PRP样品，可以使用可以区分所述PPP样品、PRP样品和红细胞样品的传感器。所述传感器也可以区分白细胞含量高的PRP样品和白细胞含量低的PRP样品。适合的传感器包括LED传感器。此外，存在许多适合于产生具有指定血细胞比容水平的PRP的可商购系统，包括自体血小板分离机、Biomet血小板浓缩系统和系统。

通过产生具有不同血细胞比容水平的PRP样品，可以改变所述PRP中存在的白细胞的量。为了形成包含高比例白细胞的PRP，其中来自于所述全血样品的总白细胞中的超过80％存在于所述PRP中，所述PRP应该被产生成具有较高血细胞比容水平，例如5至10％之间的血细胞比容水平，优选地7至9％之间的血细胞比容水平。为了形成基本上不含白细胞的PRP，其中所述全血样品的总白细胞中的少于10％存在于所述PRP中，所述PRP应该被产生成具有较低血细胞比容水平，例如1至5％之间的血细胞比容水平，优选地1至3％之间的血细胞比容水平。

被产生成具有2％的血细胞比容水平的PRP样品基本上不含白细胞，更具体来说所述全血样品的总白细胞中的少于10％、优选地少于5％、更优选地少于2％、最优选地少于1％存在于所述PRP中。被产生成具有2％的血细胞比容水平的PRP样品基本上不含白细胞，例如所述PRP可能含有少于12×10⁸个白细胞/升，或少于6×10⁸个白细胞/升，或少于3×10⁸个白细胞/升，或少于12×10⁷个白细胞/升，或少于6×10⁷个白细胞/升，或少于3×10⁷个白细胞/升。在本发明的特定实施方式中，所述PRP样品具有约2％的血细胞比容水平。在本发明的其他实施方式中，所述PRP样品可能具有约1、1.5、2.5、3、3.5、4或4.5％的血细胞比容水平。

相比而言，被产生成具有约8％的血细胞比容水平的PRP包含所述全血样品中存在的大部分白细胞，更具体来说来自于所述全血样品的总白细胞中的超过80％、优选地超过90％、更优选地超过95％存在于所述PRP中。被产生成具有8％的血细胞比容水平的PRP包含所述全血样品中存在的大部分白细胞，例如它可能包含超过1×10⁹个白细胞/升，或超过3×10⁹个白细胞/升，或超过5×10⁹个白细胞/升，或超过10×10⁹个白细胞/升。优选地，被产生成具有8％的血细胞比容水平的PRP可以包含约1×10⁹至15×10⁹个之间的白细胞/升，更优选地它可以包含约3×10⁹至12×10⁹个之间的白细胞/升。因此在本发明的特定实施方式中，所述PRP样品具有8％的血细胞比容水平。在本发明的其他实施方式中，所述PRP样品可以具有约5.5、6、6.5、7、7.5、8.5、9或9.5％的血细胞比容水平。

正如本领域技术人员会认识到的，所述“血细胞比容”水平是样品中红血细胞浓度的直观度量。尽管这不是血液样品中白细胞或血小板水平的直接度量，但在人类血液分级的情形中，它与样品中白细胞和/或血小板的水平直接相关。这在图6中图示说明，所述图示出了如本文中所述使用Arthrex Angel系统分级的全血中血细胞比容的梯度。在本领域中，血细胞比容水平通常被用作方便的度量，其能够对分级后血液的组成成分进行可重复的度量。这是可凭借其对所需组成的血液级分的收集进行自动化的手段。因此，在本领域中，血细胞比容测量允许自动收集具有所需血小板水平的浓缩血小板样品。血细胞比容水平允许通过手动和计算机两种方式收集PRP级分，因为血细胞比容水平是明显可区分的，并且是可重复且可预测的。直接测量血小板水平的更加侵入性的手段并不适合于本发明的情形，本发明的情形是一种旨在快速产生可以迅速施用到患者创伤的创伤治疗组合物的方法。测量血细胞比容不需与血液样品的任何直接接触或添加任何因子，因为它可以使用光学测量(检测光吸收的差异)简单地进行，正如通过在实施例中使用的装置所进行的。因此，血细胞比容是血小板水平的替代标志物，并且其意义和目的会被本领域技术人员容易地认识到。

本发明人还发现，所述PRP样品中存在的血小板水平存在最佳值。已发现，最有效的PRP血小板浓度在4至6倍的基线血小板水平之间，其中所述基线血小板水平是所述全血样品中存在的血小板水平。因此，如果所述PRP样品含有超过4至6倍之间的基线血小板水平，则可以将所述PRP样品用所述PPP样品稀释。这会确保在包含所述自体凝血酶和赋形剂例如抗坏血酸之前，所述PRP样品含有4至6倍的基线血小板水平。

因此，正如综上所述会认识到的，在本发明的方法的步骤iii)中，在与激活的凝血酶合并之前将一部分PPP样品与PRP样品合并的原理目的是获得具有最佳血小板水平的PRP样品。因此，所述PPP可用于在进一步加工之前稀释所述(所述浓缩的PRP)。在与凝血酶合并之前所述PRP中的最佳血小板水平取决于所述患者和待治疗的创伤。正如本领域技术人员应该理解的，某些个体例如由于自然倾向或疾病而表现出较高的血小板水平。相反，某些个体例如由于自然倾向或疾病而表现出较低的血小板水平。因此，可以根据患者血液中的天然血小板水平(这会影响在本发明的方法的第一步中产生的浓缩PRP的体积)为所述患者定制本发明的方法和通过所述方法制造的创伤治疗组合物。正如上文中解释的，优选情况下，在添加凝血酶(和任选的抗坏血酸)之前，所述PRP中的血小板水平大约在4至6倍的该个体患者中的基线血小板水平之间。在某些情况下，在本发明的方法的步骤i)中产生的PRP具有可接受用于继续加工的血小板水平(例如在所述患者具有低的血小板水平的情况下)，但在大多数情况下，在步骤i)中产生的PRP具有高于所需的血小板水平。在这种情况下，可以使用PPP将所述PRP稀释到所需血小板水平。

正如本领域技术人员会理解的，在通过所述方法产生的PRP中血小板的浓度不依赖于在所述方法中通过例如使用系统产生的浓缩PRP的体积。相反，所述体积指示了在加工之前所述全血样品中血小板的量。因此，所述PRP以几乎固定的血小板浓度产生，但PRP的体积可变。通过系统产生的PRP中的血小板浓度在3600×10⁹个血小板/升的区域内。例如，在血液中具有100×10⁹个血小板/升的患者会产生大约1ml浓缩PRP，然后通过添加PPP将其稀释回6ml，这会产生具有约600×10⁹个血小板/升(6x基线)的稀释PRP溶液。在血液中具有400×10⁹个血小板/升的患者会产生大约4ml浓缩PRP，然后将其稀释到6ml，这会产生具有约2400×10⁹个血小板/升(6x基线)的稀释PRP溶液。因此，在添加自体凝血酶之前所述PRP部分中的血小板浓度通常在4至6倍的全血中的基线血小板水平之间，优选为6倍。

据设想，在添加凝血酶之前所述PRP中血小板的最佳水平为约600×10⁹至1400×10⁹个血小板/升，优选为约600×10⁹至1200×10⁹个血小板/升，约600×10⁹至1000×10⁹个血小板/升，约600×10⁹至800×10⁹个血小板/升，约800×10⁹至1400×10⁹个血小板/升，约800×10⁹至1200×10⁹个血小板/升，或约800×10⁹至1000×10⁹个血小板/升。因此，本发明的方法包括在步骤iii)时，在添加凝血酶(和任选的抗坏血酸)之前提供具有最佳血小板水平的PRP样品。

在2％和7％血细胞比容设置下，系统PRP中的血小板密度与全血的比较和与其他可商购机器的比较，提供在上文参考的Degen等(2017)的表2中。

根据本发明的第一方面，所述创伤治疗组合物包含200至2,600×10⁹个血小板/升、优选地600至2,400×10⁹个血小板/升、更优选地1,000至2,000×10⁹个血小板/升的血小板水平。

按照本发明的第一方面产生的创伤治疗组合物包含0.5至10％或1至8％的最终血细胞比容水平。在一个实施方式中，所述按照本发明的第一方面产生的创伤治疗组合物包含0.5至5％、0.5至4％、0.5至3％或0.5至2％的最终血细胞比容水平。在另一个实施方式中，所述按照本发明的第一方面产生的创伤治疗组合物包含4至10％、4至9％、4至8％、4至7％或4至6％的最终血细胞比容水平。

根据本发明，将自体产生的凝血酶与所述PRP合并。所述凝血酶充当激动剂来激活所述PRP样品中的血小板，这导致生长因子的释放。因此，这些生长因子可以存在于本发明的创伤治疗组合物中，所述生长因子的非限制性实例包括血小板衍生生长因子(PDGF–AB)、转化生长因子β1(TGF-B1)、胰岛素样生长因子(IGF-1、IGF2)、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生血管生成因子(PDAF)、血小板衍生表皮生长因子(PDEGF)、血小板因子4(PF-4)、酸性成纤维细胞生长因子(FGF-A)、碱性成纤维细胞生长因子(FGF-B)、转化生长因子α(TGF-A)、β血栓球蛋白相关蛋白(BTG)、血小板反应蛋白(TSP)、纤连蛋白、von Willinbrand因子(vWF)、纤维肽A、纤维蛋白原、白蛋白、纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)、骨连接蛋白、正常T细胞表达和可能分泌的活化的调控因子(RANTES)、gro-α、玻连蛋白、纤维蛋白D二聚体、因子V、抗凝血酶III、免疫球蛋白-G(IgG)、免疫球蛋白-M(IgM)、免疫球蛋白-A(IgA)、a2-巨球蛋白、血管生成素、Fg-D、弹性蛋白酶、角质细胞生长因子(KGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肿瘤坏死因子(TNF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和白介素-1(IL-1)及其组合。这些生长因子协同作用以帮助促进创伤愈合。

本发明的第二方面包含可以通过根据本发明的第一方面所述的方法获得的创伤治疗组合物。

本发明的第二方面的具体特点是一种包含富血小板血浆(PRP)、凝血酶和抗坏血酸的创伤治疗组合物，其中所述组合物包含高于200×10⁹个血小板/升、或高于400×10⁹个血小板/升、或高于600×10⁹个血小板/升、或高于800×10⁹个血小板/升、或高于1,000×10⁹个血小板/升的血小板水平。

在根据本发明的第二方面所述的组合物的一个实施方式中，所述PRP和凝血酶从获自单一个体的全血样品产生。

本发明的创伤治疗组合物可用于治疗创伤。在特定实施方式中，本发明的创伤治疗组合物可用于治疗急性或慢性创伤。

本发明人已发现，根据本发明所述并从具有例如1至5％之间的较低血细胞比容水平的PRP样品产生的创伤治疗组合物，在治疗慢性创伤中有效。更具体来说，从具有约2％的血细胞比容水平的PRP产生的创伤组合物令人吃惊地对用于治疗慢性创伤特别有效。因此，本发明的创伤治疗组合物的一个实施方式可以从具有1至5％之间、优选地2％的血细胞比容水平的PRP样品产生。因此在一个实施方式中，从具有1至5％之间、优选地2％的血细胞比容水平的PRP样品形成的创伤治疗组合物可用于在需要的患者中治疗慢性创伤。当在本文中使用时，术语“慢性创伤”是指不通过创伤愈合的正常阶段进展并且通常保持在愈合的炎性阶段中的创伤。可能发生并且会从本发明的组合物获益并因此可能用本发明的组合物治疗的慢性创伤的非限制性实例包括糖尿病足溃疡、下肢静脉溃疡和压迫溃疡。

此外，从具有例如5至10％之间的较高血细胞比容水平的PRP样品产生的根据本发明所述的创伤治疗组合物在治疗急性创伤中有效。更具体来说，从具有约8％的血细胞比容水平的PRP产生的创伤组合物对用于治疗急性创伤特别有效。因此，根据本发明的创伤治疗组合物的一个实施方式可以从具有5至10％之间、优选地8％的血细胞比容水平的PRP样品产生。因此在一个实施方式中，从具有5至10％之间、优选地8％的血细胞比容水平的PRP样品形成的创伤治疗组合物可用于在需要的患者中治疗急性创伤。当在本文中使用时，术语“急性创伤”被用于指称突然而不是随时间发生的损伤或伤害。慢性创伤可以通过经历诸如清创的过程而被诱导成急性创伤，在所述清创中将死亡或受损组织从创伤处移除，以暴露出健康组织。这将所述创伤暴露于血液并因此刺激天然愈合。这些过程在慢性创伤治疗期间常用，并且专业技术人员会认识到适合的方法。

本发明的创伤治疗组合物在产生后优选地立即固化成凝胶稠度。因此，可以使用模具将所述凝胶定制成待治疗的创伤的形状，或者可以根据待治疗的创伤和临床医生的偏好将其切割成特定尺寸或形状。由于本发明的创伤治疗组合物具有比以前的组合物更稳定的结构，因此更容易切割或模制所述凝胶以根据特定创伤将其定制。

本发明的一个实施方式涉及一种通过施用本发明的创伤治疗组合物来治疗创伤的方法。这种方法可以包括在治疗过程中多次施用创伤治疗组合物。例如，创伤可以经历清创，然后施用从具有例如5至10％之间的较高血细胞比容水平的PRP样品产生的创伤治疗组合物。这个创伤可以经历后续治疗，其包括施用从具有例如1至5％之间的较低血细胞比容水平的PRP样品产生的创伤治疗组合物。本发明的另一方面是一种在对象中治疗创伤的方法，所述方法包括给药可以通过根据本发明的第一方面所述的方法获得的创伤治疗组合物。因此，根据本发明所述的在对象中治疗创伤的方法可以包括下述步骤：

i)从所述待治疗的对象获得全血样品；

ii)将全血样品分级成包括富血小板血浆(PRP)样品、贫血小板血浆(PPP)样品和红细胞样品在内的多个样品，其中所述PRP样品具有1-10％的血细胞比容水平；

iii)对一部分所述PPP和/或PRP样品进行加工，以促进所述PPP和/或PRP中存在的自体凝血酶原的裂解，产生自体凝血酶；以及

iv)将所述PRP样品与一部分所述PPP样品和一部分在步骤(iii)中产生的所述凝血酶合并，以产生所述创伤治疗组合物，其中所述创伤治疗组合物包含高于600×10⁹个血小板/升的血小板水平；以及

v)将所述创伤治疗组合物施用到所述待治疗的对象的创伤；并且其中步骤iii)在低于15℃的温度下进行。

根据本发明所述的治疗创伤的方法可以包括在一开始对慢性创伤进行清创以暴露出清洁的创面，有效地将其转变成急性创伤，或在一开始使用从例如8％的高血细胞比容的PRP样品产生的本发明的创伤治疗组合物治疗急性创伤。然后在后续治疗步骤中，当所述创伤愈合的初始急性阶段过去并且所述创伤可以被视为慢性时，本发明的方法可以包括施用从具有例如2％的较低血细胞比容的PRP组合物产生的本发明的创伤治疗组合物。可以视情况而定进行该第二阶段的多次施用，直至发生令人满意的创伤愈合。

因此，本发明的另一个实施方式是一种在对象中治疗急性创伤的方法，所述方法包括给药从具有8％的血细胞比容水平的PRP样品产生的本发明的创伤治疗组合物。因此，本发明的另一个实施方式是一种在对象中治疗慢性创伤的方法，所述方法包括给药从具有2％的血细胞比容水平的PRP样品产生的本发明的创伤治疗组合物。

本发明的另一方面是创伤治疗组合物在用于治疗创伤的药物的制备中的用途，其中所述创伤治疗组合物可以通过下述方法获得：

i)将全血样品分级成包括富血小板血浆(PRP)样品、贫血小板血浆(PPP)样品和红细胞样品在内的多个样品，其中所述PRP样品具有1-10％的血细胞比容水平；

ii)对一部分所述PPP和/或PRP样品进行加工，以促进所述PPP和/或PRP中存在的自体凝血酶原的裂解，产生自体凝血酶；以及

iii)将所述PRP样品与一部分所述PPP样品和一部分在步骤(ii)中产生的所述凝血酶合并，以产生所述创伤治疗组合物；并且

其中步骤ii)在低于15℃的温度下进行。

本发明还提供了一种根据第二方面所述的创伤治疗组合物，其用于药物，特别是如本文中所阐述的用于治疗慢性或急性创伤。

在适当情况下，关于本发明的较早方面描述的所有实施方式打算同等地适用于本发明的前述方面。

下面的实施例说明了本发明。