一种头孢米诺7β-甲氧基立体异构体的分离纯化方法
阅读说明：本技术 一种头孢米诺7β-甲氧基立体异构体的分离纯化方法 (Separation and purification method of cefminox 7 beta-methoxy stereoisomer ) 是由 王辉 高全喜 于 2020-03-26 设计创作，主要内容包括：本发明属于药物技术领域,具体涉及一种头孢米诺7β-甲氧基立体异构体的分离纯化方法。该分离纯化方法包括步骤：1)以7-氨基-7-甲氧基-3-[(1-甲基-1H-四唑-5-基)硫甲基]-3-头孢烯-4-羧酸二苯甲酯为原料合成头孢米诺溶液,利用旋转蒸发仪除去大部分溶剂,得到含有头孢米诺7β-甲氧基立体异构体的粘稠状液体；2)用制备液相色谱进行分离纯化,根据色谱图收集头孢米诺7β-甲氧基立体异构体对应的洗脱流分,进行预冻后,放入真空冻干机中进行冻干,即得目标产物。本发明通过制备液相色谱分离纯化,经冷冻干燥得到白色粉末状头孢米诺异构体纯品。本发明得到的头孢米诺7β-甲氧基异构体质量好、纯度高,液相纯度在98%以上。(The invention belongs to the technical field of medicines, and particularly relates to a separation and purification method of cefminox 7 beta-methoxyl stereoisomer. The separation and purification method comprises the following steps: 1) synthesizing a cefminox solution by using 7-amino-7-methoxy-3- [ (1-methyl-1H-tetrazol-5-yl) thiomethyl ] -3-cephem-4-carboxylic acid diphenylmethyl ester as a raw material, and removing most of a solvent by using a rotary evaporator to obtain a viscous liquid containing a cefminox 7 beta-methoxy stereoisomer; 2) separating and purifying by using a preparative liquid chromatography, collecting an elution fraction corresponding to the cefminox 7 beta-methoxy stereoisomer according to a chromatogram, pre-freezing, and freeze-drying in a vacuum freeze dryer to obtain the target product. The invention obtains a white powdery cefminox isomer pure product by separation and purification of preparative liquid chromatography and freeze drying. The cefminox 7 beta-methoxyl isomer obtained by the method has good quality and high purity, and the liquid phase purity is more than 98%.)
技术领域
本发明属于药物
技术领域
，具体涉及一种头孢米诺7β-甲氧基立体异构体的分离纯化方法。背景技术
头孢米诺是上世纪90年代进入中国市场的头霉素类。作为广谱抗菌药物，其对需氧革兰阴性菌、革兰阳性菌和脆弱拟杆菌等厌氧菌具有广谱抗菌作用，并对细菌产生的广谱β内酰胺酶和超广谱β内酰胺酶稳定，主要用于敏感菌所致的败血症、扁桃体炎、气管炎、肺炎、肺化脓症、肾盂肾炎、膀胱炎、胆囊炎、腹腔炎、盆腔炎、子宫附件炎、子宫内膜炎以及腹部手术后感染等。
由于合成头孢米诺（结构见图1）的工艺路线的不同，会产生与原研药不同的杂质7β-甲氧基头孢米诺酸（结构见图2），该杂质为头孢米诺7β-甲氧基立体异构体，根据仿制药注册申报要求，必须鉴别并提供该杂质的对照品，故本发明根据仿制药注册及工艺研究的需要，通过制备液相分离纯化制备了该7β-甲氧基立体异构体。
本发明以7-氨基-7-甲氧基-3-[(1-甲基-1H-四唑-5-基)硫甲基]-3-头孢烯-4-羧酸二苯甲酯为原料合成头孢米诺溶液，参考文献Tetrahedron Lett., 1982, 23，(29)：2977-2980。
发明内容
本发明目的在于提供一种头孢米诺7β-甲氧基立体异构体的分离纯化方法，以7-氨基-7-甲氧基-3-[(1-甲基-1H-四唑-5-基)硫甲基]-3-头孢烯-4-羧酸二苯甲酯为原料合成的头孢米诺反应液为基础，并通过制备液相纯化制备了头孢米诺7β-甲氧基立体异构体。
一种头孢米诺异构体杂质的分离纯化方法，包括如下步骤：
一种头孢米诺7β-甲氧基立体异构体的分离纯化方法，该分离纯化方法包括如下步骤：
1）以7-氨基-7-甲氧基-3-[(1-甲基-1H-四唑-5-基)硫甲基]-3-头孢烯-4-羧酸二苯甲酯为原料合成头孢米诺溶液，利用旋转蒸发仪除去大部分溶剂，至粘稠状，得到含有头孢米诺7β-甲氧基立体异构体的粘稠状液体；
2）用制备液相色谱对步骤1）所制得的含有头孢米诺7β-甲氧基立体异构体的粘稠状液体进行分离纯化，色谱柱为固定相十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为4%～8%的乙腈水，等度洗脱，流速为10～20mL/min，波长为190～400nm，将所述的含有头孢米诺7β-甲氧基立体异构体的粘稠状液体用流动相配制成质量浓度为5～15mg/mL的溶液，取该溶液5～15mL注入制备液相色谱进行分离纯化，根据色谱图收集头孢米诺7β-甲氧基立体异构体对应的洗脱流分，进行预冻后，放入真空冻干机中进行冻干，即得目标杂质物头孢米诺7β-甲氧基立体异构体。
优选的，本发明所述的流动相4%～8%的乙腈水用质量百分含量为0.05%乙酸水和氨水调节pH至5.5。
优选的，一种头孢米诺7β-甲氧基立体异构体的分离纯化方法，该分离纯化方法步骤为：
1）以7-氨基-7-甲氧基-3-[(1-甲基-1H-四唑-5-基)硫甲基]-3-头孢烯-4-羧酸二苯甲酯为原料合成头孢米诺溶液，并利用旋转蒸发仪除去大部分溶剂，至粘稠状，得到含有头孢米诺7β-甲氧基立体异构体的粘稠状液体；
2）制备液相的分离：用制备液相对步骤1）所制得的含有头孢米诺7β-甲氧基立体异构体的粘稠状液体进行分离纯化，色谱柱为固定相十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为6%乙腈水，等度洗脱，流速为15mL/min，波长为254nm，将所述的含有头孢米诺7β-甲氧基立体异构体的粘稠状液体用流动相配制成质量浓度为10mg/mL的溶液，取10mL注入制备液相进行分离纯化，并收集目标峰的流出液；
3）按照步骤2）的方法将步骤1）所得的粘稠状液体全部分离纯化，并将全部目标峰的流出液合并得到溶液；
4）将步骤3）所得溶液经过-20℃预冻后，直接放入真空冻干机中进行冻干，即得目标杂质物头孢米诺7β-甲氧基立体异构体。
优选的，本发明一种头孢米诺7β-甲氧基立体异构体的分离纯化方法，该分离纯化方法步骤为：
1）以7-氨基-7-甲氧基-3-[(1-甲基-1H-四唑-5-基)硫甲基]-3-头孢烯-4-羧酸二苯甲酯为原料合成头孢米诺的溶液，并利用旋转蒸发仪除去大部分溶剂，至粘稠状，得到含有头孢米诺7β-甲氧基立体异构体的粘稠状液体；
2）制备液相的分离：用制备液相对步骤1）所制得的含有头孢米诺7β-甲氧基立体异构体的粘稠状液体进行分离纯化，色谱柱固定相十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为4%乙腈水，等度洗脱，流速为20mL/min，波长为254nm，将所述的含有头孢米诺7β-甲氧基立体异构体的粘稠状液体用流动相配制成质量浓度为10mg/mL的溶液，取10mL注入制备液相进行分离纯化，并收集目标峰的流出液；
3）按照步骤2）的方法将步骤1）所得的粘稠状液体全部分离纯化，并将全部目标峰的流出液合并得到溶液；
4）将步骤3所得溶液经过温度-20℃预冻后，直接放入真空冻干机中进行冻干，即得目标杂质物。
优选的，本发明一种头孢米诺7β-甲氧基立体异构体的分离纯化方法，该分离纯化方法步骤为：
1）以7-氨基-7-甲氧基-3-[(1-甲基-1H-四唑-5-基)硫甲基]-3-头孢烯-4-羧酸二苯甲酯为原料合成头孢米诺的溶液，并利用旋转蒸发仪除去大部分溶剂，至粘稠状，得到含有头孢米诺7β-甲氧基立体异构体的粘稠状液体；
2）用制备液相对上述异构体的样品进行分离纯化，色谱柱为固定相十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为8%乙腈水，等度洗脱，流速为10mL/min，波长为254nm，将步骤1）中的粘稠状液体用流动相配制成10mg/mL的溶液，取10mL注入制备液相进行分离纯化，并收集目标峰的流出液；
3）按照步骤2）的方法将步骤1）所得的粘稠状液体全部分离纯化，并将全部目标峰的流出液合并得到溶液；
4）将步骤3）所得溶液经过温度-20℃预冻后，直接放入真空冻干机中进行冻干，即得目标杂质物。
本发明的技术优点在于：
本发明以7-氨基-7-甲氧基-3-[(1-甲基-1H-四唑-5-基)硫甲基]-3-头孢烯-4-羧酸二苯甲酯为原料合成的头孢米诺反应液为基础，通过制备液相色谱分离纯化，经冷冻干燥得到头孢米诺异构体纯品。本发明方法步骤简单，工序节省，能够快速、简便得到杂质对照品，不需要危险，剧毒化学试剂，非常环保。本发明得到的头孢米诺纯品质量好、纯度高，液相纯度在98%以上。
附图说明
图1为头孢米诺结构式。
图2为7β-甲氧基头孢米诺酸结构式。
图3为含有7β-甲氧基头孢米诺酸的粘稠状液体的分析色谱图。
图4为7β-甲氧基头孢米诺酸制备液相色谱图。
图5为实施案例1所得7β-甲氧基头孢米诺酸分析色谱图。
图6为实施案例2所得7β-甲氧基头孢米诺酸分析色谱图。
图7为实施案例3所得7β-甲氧基头孢米诺酸分析色谱图。
图8为得到的目标纯品化合物7β-甲氧基头孢米诺酸的氢谱图。
图9为得到的目标纯品化合物7β-甲氧基头孢米诺酸的碳谱图。
图10为得到的目标纯品化合物7β-甲氧基头孢米诺酸的质谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
实施实例1
一、实验材料
制备液相：HT7100A
分析液相：waters2996/2695
制备色谱柱：RPS-C18-50um（50um，15*460mm）
分析色谱柱：HT-ODS-P(5um，4.6*250 mm)
实验材料：7-氨基-7-甲氧基-3-[(1-甲基-1H-四唑-5-基)硫甲基]-3-头孢烯-4-羧酸二苯甲酯。
二、试验方法及结果
1）以7-氨基-7-甲氧基-3-[(1-甲基-1H-四唑-5-基)硫甲基]-3-头孢烯-4-羧酸二苯甲酯为原料合成头孢米诺的溶液，利用旋转蒸发仪除去大部分溶剂，至粘稠状，得到含有头孢米诺7β-甲氧基立体异构体的粘稠状液体，其分析色谱图见图3，从图中可以看出该粘稠状液体中含有7β-甲氧基头孢米诺酸。
2）制备液相的分离：用制备液相对上述含有7β-甲氧基头孢米诺酸的样品进行分离纯化，色谱柱为RPS-C18-50um（50um，15*460mm），流动相为6%乙腈水（0.05%乙酸水，氨水调节pH5.5），等度洗脱，流速为15mL/min，波长为254nm，将步骤1）中的粘稠状液体用流动相配制成10mg/mL的溶液，取10mL注入制备液相进行分离纯化，并收集目标峰的流出液，制备色谱图见图4。
3）按照步骤2）的方法将步骤1）所得的粘稠液体全部分离纯化，并将全部目标峰的流出液合并。
4）将步骤3）所得溶液进行-20℃预冻后，直接放入真空冻干机中进行冻干，即得目标杂质物，收率约为61.3%，HPLC归一化纯度达到98.79%（见图5）。
实施实例2
一、实验材料
制备液相：HT7100A
分析液相：waters2996/2695
制备色谱柱：RPS-C18-50um（50um，15*460mm）
分析色谱柱：HT-ODS-P(5um，4.6*250 mm)
实验材料：7-氨基-7-甲氧基-3-[(1-甲基-1H-四唑-5-基)硫甲基]-3-头孢烯-4-羧酸二苯甲酯。
二、试验方法及结果
1）同实施实例1，以7-氨基-7-甲氧基-3-[(1-甲基-1H-四唑-5-基)硫甲基]-3-头孢烯-4-羧酸二苯甲酯为原料合成头孢米诺的溶液，并利用旋转蒸发仪除去大部分溶剂，至粘稠状，得到含有头孢米诺7β-甲氧基立体异构体的粘稠状液体。
2）用制备液相色谱对头孢米诺7β-甲氧基立体异构体的样品进行分离纯化，色谱柱为RPS-C18-50um（50um，15*460mm），流动相为4%乙腈水（0.05%乙酸水，氨水调节pH5.5），等度洗脱，流速为20mL/min，波长为254nm，将步骤1）中的粘稠状液体用流动相配制成10mg/mL的溶液，取10mL注入制备液相进行分离纯化，并收集目标峰的流出液。
3）按照步骤2）的方法将步骤1）所得的粘稠液体全部分离纯化，并将全部目标峰的流出液合并。
4）将步骤3所得溶液进行-20℃预冻后，直接放入真空冻干机中进行冻干，即得目标杂质物，收率约为59.8%，HPLC归一化纯度达到98.77%，见图6。
实施实例3
一、实验材料
制备液相：HT7100A
分析液相：waters2996/2695
制备色谱柱：RPS-C18-50um（50um，15*460mm）
分析色谱柱：HT-ODS-P(5um, 4.6x 250 mm)
实验材料：7-氨基-7-甲氧基-3-[(1-甲基-1H-四唑-5-基)硫甲基]-3-头孢烯-4-羧酸二苯甲酯。
二、试验方法及结果
1）1）同实施实例1，以7-氨基-7-甲氧基-3-[(1-甲基-1H-四唑-5-基)硫甲基]-3-头孢烯-4-羧酸二苯甲酯为原料合成头孢米诺的溶液，利用旋转蒸发仪除去大部分溶剂，至粘稠状，得到含有头孢米诺7β-甲氧基立体异构体的粘稠状液体。
2）用制备液相色谱对头孢米诺7β-甲氧基立体异构体的样品进行分离纯化，色谱柱为RPS-C18-50um（50um，15*460mm），流动相为8%乙腈水（0.05%乙酸水，氨水调节pH5.5），等度洗脱，流速为10ml/min，波长为254nm，将步骤1中的粘稠状液体用流动相配制成10mg/ml的溶液，取10ml注入制备液相进行分离纯化，并收集目标峰的流出液。
3）按照步骤2的方法将步骤1所得的粘稠液体全部分离纯化，并将全部目标峰的流出液合并。
4）将步骤3所得溶液进行-20℃预冻后，直接放入真空冻干机中进行冻干，即得目标杂质物，收率约为60.1%，HPLC归一化纯度达到97.97%，见图7。
经结构鉴定，得到的纯品化合物确定为目标物7β-甲氧基头孢米诺酸，其结构鉴定数据下：
1H-NMR（400Mz，D2O）:δ5.15(s，1H，CH)，4.32-4.29（dd，1H，CHN），4.06（s，3H，NH），4.00-3.98（dd，2H，CH 2），3.78-3.47（dd，2H，CH 2），3.54（s，3H，CH 3），3.52（d，2H，CH 2），3.24-3.15（dq，2H，CH 2）。见图8。
13C-NMR（400Mz，D2O）：δ173.1，172.4，167.2，159.7，153.4，130.5，119.1，92.3，63.2，53.5，53.0，36.3，34.9，34.1，32.9，26.4。见图9。
ESI-MS（m/z）：558.03[M+K]+。见图10。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
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