一种温敏荧光探针及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种温敏荧光探针及其制备方法和应用 (Temperature-sensitive fluorescent probe and preparation method and application thereof ) 是由 白钢 侯媛媛 申福葵 杨雯 于 2021-06-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种温敏荧光探针及其制备方法和应用,属于化学生物学领域。本发明温敏荧光探针的分子式为C-(33)H-(42)ClN-3O,分子量为531.3016；所述温敏荧光探针的制备方法包括以下步骤：制备酯基保护罗丹明B；制备羟基修饰罗丹明B；制备氯代罗丹明B；制备温敏荧光探针。本发明所制备的温敏荧光探针RhBⅣ,具有良好的温度敏感性,且靶向细胞线粒体,可以在活细胞和活体小动物上实时观测线粒体温度变化,可用于调控能量代谢的药物筛选,以及活体动物水平实时监测脏器温度的变化,为相关药效学评价提供新的检测方法,具有良好的应用前景。(The invention discloses a temperature-sensitive fluorescent probe and a preparation method and application thereof, belonging to the field of chemistry and biology. The molecular formula of the temperature-sensitive fluorescent probe is C 33 H 42 ClN 3 O, molecular weight 531.3016; the preparation method of the temperature-sensitive fluorescent probe comprises the following steps: preparing ester group protected rhodamine B; preparing hydroxyl modified rhodamine B; preparing chlororhodamine B; and preparing the temperature-sensitive fluorescent probe. The temperature-sensitive fluorescent probe RhB IV prepared by the invention has good temperature sensitivity, targets cell mitochondria, can observe the temperature change of the mitochondria in real time on living cells and living small animals, can be used for screening medicines for regulating and controlling energy metabolism and monitoring the level of the living animals in real timeThe change of the organ temperature provides a new detection method for the related pharmacodynamics evaluation, and has good application prospect.)
技术领域
本发明涉及化学生物学领域，特别是涉及一种温敏荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
芳烃类荧光化合物的丰度在一定的程度上表现为其荧光强度的大小。而荧光产生以及其荧光响应强度的大小不仅受到化合物本身共轭结构的影响，同时也与外界环境有关。其中涉及的环境因素主要包括温度、溶剂极性、溶剂pH值和荧光分子的浓度等。温度在一定程度上能够影响到溶液中化合物的荧光强度。在一般情况下，温度越高，荧光的量子产率越低，荧光强度降低，这是因为温度升高，分子运动速度加快，分子间的碰撞次数也增多，能量损失较大，使得荧光量子产率降低，反之则荧光量子产率增强。
线粒体是细胞的能量工厂，在细胞生命中起着至关重要的作用。线粒体温度是线粒体功能的重要指标，而维持线粒体温度是细胞生长、分化和存活的基础，具有重要意义。因此利用分子探针的信号变化(即荧光温度计)来观测细胞温度的变化，已引起生物学界的极大关注。线粒体功能障碍与许多疾病密切相关，例如糖尿病、心血管疾病、神经退行性疾病和神经肌肉疾病、癌症、胃肠道疾病以及肝病等代谢病。研究线粒体温度变化对了解和控制细胞功能的分子机制极为重要，因此开发线粒体相关的荧光探针具有重要意义，对药物开发和机制研究具有重要的推动作用。
目前已有各种类型的荧光温度计的报道，例如采用无机纳米粒子[Fischer L H等.Angew Chem Int Ed Engl,2011,50(20):4546-4551.]、纳米金刚[Kucsko G等.Nature,2013,500(7460):54-58.]、染料嵌入的聚合物颗粒[Takei Y等.ACS Nano,2014,8(1):198-206.]和对温度敏感的聚合物颗粒[Okabe K等.Nat Commun,2012,3:705.]。中国发明专利公开了两种温敏探针的制备方法，即基于配合物可见光激发的荧光温敏探针[申请号：CN201610802438.0]和基于界面缺陷的量子点温敏探针[CN201510906169.8]。目前可用于检测生物体温度变化的荧光探针通常由一个定位基团和一个荧光检测基团组成，且整体为偏脂溶性的分子。这导致其无法准确定位于细胞内的线粒体。而鉴于热量能迅速被扩散到细胞外环境的特点，现有技术通常将温度探针置于细胞器较近的位置，靶向细胞器热源，以更好地感测其所产生热量的变化。但是，就温度测量的准确性而言，荧光探针与热源之间的距离也被认为是一个关键的因素，即温度探针置于细胞器较近的位置远不如定位于线粒体上测得的温度准确。
罗丹明B(RhodamineB,RhB)是一种邻苯二酚类荧光染料，具有螺环开闭的互变异构。罗丹明B中的两个芳环由与碳原子相对的氧原子连接，形成一个六元环，使得罗丹明B具有一个刚性平面结构，形成一个大的共轭体系。罗丹明类探针中的螺内酰胺可以在特定客体存在下诱导开环，导致探针颜色及荧光发生变化。同时由于罗丹明骨架中有许多可修饰的结合位点，因此对罗丹明骨架上的特定位点进行化学修饰会对其荧光的生成产生影响。Arai等基于罗丹明设计合成了温敏荧光探针MitoThermoYellow，其具有线粒体靶向能力，尽管其在细胞水平展示了温度变化的感应性，但是由于MitoThermoYellow的激发波长跟发射波长较近(激发波长540nm,发射波长570nm)，相互干扰较强，并且其发射波长的红移不够，内源性背景较高，导致其不能用于活体成像分析，目前仅限于细胞层面分析[Arai S等.Chem Commun(Camb),2015,51(38):8044-8047.]。MitoThermoYellow探针的分子结构如下：
尽管基于罗丹明B的荧光衍生的分子探针已在生物学和医学领域中得到广泛应用，但目前可用于活体动物检测的温敏探针尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种温敏荧光探针及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，使温敏荧光探针能够靶向细胞中的线粒体，且能够用于活细胞和活体动物水平检测。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明目的之一是提供一种温敏荧光探针，所述探针的分子式为C33H42ClN3O，分子量为531.3016，结构式如下所示：
本发明目的之二是提供上述温敏荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，制备酯基保护罗丹明B：罗丹明B与K2CO3和碘甲烷反应得到酯基保护罗丹明B；
所述酯基保护罗丹明B的结构式为
步骤2，制备羟基修饰罗丹明B：所述酯基保护罗丹明B与四氢铝锂反应得到羟基修饰罗丹明B；
所述羟基修饰罗丹明B的结构式为
步骤3，制备氯代罗丹明B：所述羟基修饰罗丹明B与氯化亚砜反应得到氯代罗丹明B；
所述氯代罗丹明B的结构式为
步骤4，制备温敏荧光探针：所述氯代罗丹明B与哌啶和Na2CO3反应得到所述温敏荧光探针。
进一步地，步骤1的反应溶剂为无水丙酮，反应温度为65℃，反应时间为12小时。
进一步地，步骤2的反应溶剂为无水四氢呋喃，反应温度为室温，反应时间为12小时。
进一步地，步骤3的反应溶剂为无水二氯甲烷，反应温度为室温，反应时间为12小时。
进一步地，步骤4的反应溶剂为无水DMF溶液，反应条件为：先冰浴反应30分钟，再室温反应12小时。
进一步地，步骤1-4生成目标化合物之后还包括用盐酸淬灭反应的步骤。
本发明目的之三是提供上述温敏荧光探针在离体活细胞中的应用。
本发明的技术构思是：
线粒体具有双层膜结构。外膜是限制膜，内膜向内折叠形成脊。内外膜不相连，形成约-180mV的膜电位。目前，大多数线粒体定位荧光探针都是基于线粒体负膜电位的特性。使用带正电荷的荧光团或将带正电荷的基团引入荧光团靶向线粒体进行染色。本发明中的温敏探针RhBⅣ含有季铵结构的正电荷所以可以实现线粒体靶向。由于温敏荧光探针RhBⅣ的最佳激发波长为520nm，最佳发射波长为592nm，可以有效避免内源性荧光物质干扰，所以内源性背景较低。
本发明公开了以下技术效果：
(1)本发明所制得的温敏荧光探针(RhBⅣ)的最佳激发波长为520nm，最佳发射波长为592nm，二者差距较大，避免了相互干扰；
(2)温敏探针RhBⅣ的荧光强度具有良好的温敏响应性，在27℃至41℃范围内其荧光值响应随温度升高而降低，且高低温度每次变化的荧光强度没有明显差异，呈现良好的线性和稳定性；
(3)细胞活力检测和小鼠急性毒性试验证明，本发明制备的温敏探针RhBⅣ具有较低的细胞毒性，在10-4mol/L浓度以下对细胞活力没有影响，单次注射给药小于100mg/kg对小鼠没有明显的毒性；
(4)本发明制备的温敏探针RhBⅣ可以定位在细胞内的线粒体上，并可以有效指示细胞线粒体的温度变化，可以用于细胞线粒体的活性评价。小鼠尾静脉注射温敏探针RhBⅣ的小动物活体成像分析显示，RhBⅣ探针给药后主要分布于肝脏，约1.5小时后达到峰值，并可以有效维持6小时，可用于小鼠体温变化的监测；
(5)本发明所制备的温敏荧光探针RhBⅣ，具有良好的温度敏感性，且靶向细胞线粒体，可以在活细胞和活体小动物上实时观测线粒体温度变化，可用于调控能量代谢的药物筛选，以及活体动物水平实时的监测脏器温度的变化，为相关药效学评价提供新的检测方法，具有良好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明温敏荧光探针RhBⅣ的合成路线；
图2为温敏探针RhBⅣ的核磁共振氢谱图；
图3为温敏探针RhBⅣ的核磁共振碳谱图；
图4为温敏探针RhBⅣ的HPLC液相色谱图；
图5为温敏探针RhBⅣ的高分辨质谱图；
图6为RhB、MitoThermoYellow探针和温敏荧光探针RhBⅣ在最佳激发波长下荧光强度以及随温度变化的荧光光谱图；
图7为温敏荧光探针RhBⅣ在Hepg2细胞上的细胞毒性考察；
图8为温敏荧光探针RhBⅣ与线粒体染料MitoTracker的共定位考察；
图9为温敏荧光探针RhBⅣ在Hepg2细胞上的温敏性考察；其中图A为基于细胞水平温敏探针RhBⅣ的荧光强度-温度变化曲线；图B为温敏探针RhBⅣ的稳定性考察；
图10为温敏荧光探针RhBⅣ检测药物对细胞温度变化的影响图；
图11为温敏荧光探针RhBⅣ在活体动物上的分布及应用；其中，图A为给药30分钟后小鼠体内的分布情况考察；图B为给药后小鼠体内的代谢情况考察；图C为应用温敏探针RhBⅣ检测药物干预前后小鼠脏器温度的变化。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1：温敏探针RhBⅣ的合成
1)将500mg(1.04mmoL,1.0eq)罗丹明B和290mg(2.08mmol,2.0eq)K2CO3置于50mL的圆底烧瓶中，在氮气保护下加入10mL无水丙酮溶液，缓慢滴加240mg碘甲烷，并升温至65℃，反应12小时。经TLC检测原料罗丹明B反应完全后，用1mol/L盐酸淬灭反应。经乙酸乙酯萃取和饱和食盐水洗涤三次，将有机相用无水硫酸钠干燥后真空浓缩，采用硅胶柱纯化得到420mg酯基保护罗丹明B(RhBⅠ)，产率为82.1％。
2)将400mg(0.81mmol,1.0eq)酯基保护罗丹明B(RhBⅠ)置于50mL圆底烧瓶中，氮气保护下加入10mL无水四氢呋喃溶液，冰浴下缓慢加入63mg(1.62mmol,2.0eq)四氢铝锂，室温反应12小时。经TLC检测原料消失后，加入1mol/L盐酸淬灭反应，经乙酸乙酯萃取和饱和食盐水洗涤三次，将有机相用无水硫酸钠干燥后真空浓缩，采用硅胶柱纯化，得到278mg羟基修饰罗丹明B(RhBⅡ)，产率为74％。
3)将250mg(0.54mmol,1.0eq)羟基修饰罗丹明B(RhBⅡ)置于50mL圆底烧瓶中，氮气保护下加入5mL无水二氯甲烷溶液，冰浴下缓慢加入193mg(1.62mmol,3.0eq)氯化亚砜，室温反应12小时。经TLC检测原料消失后，用1mol/L碳酸氢钠淬灭反应，经乙酸乙酯萃取和饱和食盐水洗涤三次，将有机相用无水硫酸钠干燥后真空浓缩，采用硅胶柱纯化，得到229mg氯代罗丹明B(RhBⅢ)，产率为88％。
4)将200mg(0.42mmol,1.0eq)氯代罗丹明B(RhBⅢ)和71mg(0.84mmol,2.0eq)哌啶的混合物置于25mL圆底烧瓶中，氩气保护下加入8mL无水DMF溶液，冰浴下加入174mg(1.26mmol,3.0eq)Na 2CO3和70mg(0.42mmol,1.0eq)KI，冰浴反应30分钟后，室温反应12小时。经TLC检测原料消失后，用1mol/L盐酸淬灭反应，经乙酸乙酯萃取和饱和食盐水洗涤三次，将有机相用无水硫酸钠干燥后真空浓缩得到终产物粗品，进一步经硅胶柱纯化得到206mg温敏探针RhBⅣ，产率为67％。温敏探针RhBⅣ的合成路线如图1所示。
温敏探针RhBⅣ的核磁共振检测(NMR)检测结果为：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.13–7.02(m,3H),6.79(d,J＝8.6Hz,2H),6.37(d,J＝2.6Hz,2H),6.26(dd,J＝8.6,2.6Hz,2H),5.68(s,1H),3.61(s,2H),3.31(q,J＝7.1Hz,8H),2.41(s,4H),1.55(t,J＝5.6Hz,4H),1.46–1.41(m,2H),1.14(t,J＝7.0Hz,12H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ152.0,147.4,131.3,130.6,130.3,128.0,125.2,113.0,107.4,98.7,62.5,54.6,44.4,26.1,24.6,12.7，如图2、3所示。
采用高效液相色谱法(HPLC)对温敏探针RhBⅣ进行纯度检测，所用仪器以及色谱条件如下：
仪器，岛津高效液相色谱仪LC-15C，配有二元泵、SPD-15C紫外检测器、CTO-15C柱温箱，LC-Solution 15C工作站，Agilent Eclipse Plus C18色谱柱(4.6×100mm，3.5μm)。
色谱条件，流动相A:0.05％磷酸水，流动相B:乙腈。程序设置:B相设置为：0.01～6分钟，4～45％；6～8分钟，45～65％；8～12分钟，65～85％；12～22分钟，85～100％；22～25分钟，100％。流速：1.00mL/min，柱温：28℃，检测波长：550nm。通过积分计算，温敏探针RhBⅣ的HPLC纯度为99.2％，如图4所示。
对温敏探针RhBⅣ进行高分辨率质谱(HRMS)检测，[M-Cl]+的高分辨质谱HRMS计算值为：496.3322,实测值：496.3326，如图5所示。
结合NMR和HRMS鉴定结果，可知本实施例最终制得的化合物为目标产物，温敏探针RhBⅣ为紫红色粉末，熔点为187℃，分子式为C33H42ClN3O，分子量为531.3016，易溶于水、乙醇，微溶于丙酮、氯仿、盐酸等溶液。
实施例2：温敏探针RhBⅣ荧光光谱检测及温敏性考察
利用多功能酶标仪(Spark，奥地利)对10-5mol/L温敏探针RhBⅣ溶于生理盐水中进行荧光扫描，确定最佳激发波长为520nm，最佳发射波长为592nm。再在相同浓度条件下对罗丹明B(RhB)、MitoThermoYellow探针(委托天津希恩思奥普德科技有限公司合成)及温敏探针RhBⅣ在最佳激发波长520nm下进行荧光光谱扫描，考察其温度响应的效果。
实验结果表明：罗丹明B(RhB)荧光强度几乎不受温度影响；RhBⅣ随温度升高，其荧光强度衰减表现出较好的温度依赖性；而MitoThermoYellow探针的荧光幅度变化较小(如图6所示)。温敏探针RhBⅣ的最佳发射波长592nm明显高于MitoThermoYellow的发射波长570nm，说明温敏探针RhBⅣ具有更好的荧光响应性和温敏性，可用于后续功能评价。
实施例3：温敏探针RhBⅣ的细胞毒性和单次口服急性毒性考察
使用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒，检测不同剂量温敏探针RhBⅣ对HepG2细胞活性的影响，实验方法如下：
1)将复苏后的HepG2细胞置于DMEM完全培养基中(含10％FBS和1％双抗)，置于5％CO2培养箱中，37℃恒温培养。待细胞生长至融合度为50～60％时，每孔加入100μL含不同浓度温敏探针RhBⅣ的无血清培养基，孵育过夜；弃去培养基，加入10μL的CCK-8溶液和90μLPBS溶液的混合液；将培养板置于培养箱内孵育30分钟；按照试剂盒说明书，用酶标仪(Spark，奥地利)测定其吸光度，检测波长为450nm。
2)实验设置不含药物的对照组，以及不含细胞和药物的空白组进行校准。实验重复8次，取平均值，通过方差分析统计探针对细胞活力的影响。计算公式：细胞存活率＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100％。其中，As表示实验组吸光度；Ac表示对照组吸光度；Ab表示空白组吸光度。
3)实验结果如图7所示，在温敏探针RhBⅣ浓度小于10-4mol/L时，RhBⅣ对HepG2肝癌细胞的毒性较小，当浓度超过5×10-3mol/L时，HepG2肝癌细胞的存活率有所下降。因此，选择10-4mol/L以下浓度为细胞水平检测的安全剂量。
4)罗丹明B作为食品添加剂，其安全剂量较大。参考其静脉注射给药计量，选择20克昆明小鼠尾静脉注射RhBⅣ，当单次注射给药小于100mg/kg时，小鼠未发现有明显的毒性。
实施例4：温敏探针RhBⅣ的细胞定位
取HepG2细胞参照上述实施例3的条件培养，待细胞生长融合至70～80％时使用胰蛋白酶进行消化，将细胞传代至共聚焦小皿，每皿2mL，置于CO2培养箱中继续培养过夜。待细胞融合至50％时，弃去培养基，经PBS清洗三次，再加入无血清培养基稀释的10-6mol/L温敏探针RhBⅣ，置于CO2培养箱内继续培养6小时。PBS洗涤3次后，加入线粒体染料(10-7moL/L)放置15分钟，再用PBS洗涤3次，立即在共聚焦显微镜下对HepG2细胞进行共聚焦成像分析(LSM 800with Airyscan，德国)。线粒体染料的检测采用644nm波长激发，665nm发射波长检测。温敏探针RhBⅣ采用在540nm波长激发，600nm发射波长检测。实验结果表明，温敏探针产生的绿色荧光可以和线粒体染料的红色荧光，可以部分重合显示为橙色，曼德斯共定位系数为0.96，如图8所示。证明了温敏探针在细胞中可以与线粒体发生相互作用，可以用于检测线粒体温度变化的检测。
实施例5：基于HepG2细胞的RhBⅣ探针的温敏性考察
1)取HepG2细胞参照实施例3的条件培养，待细胞生长融合至70-80％时，消化后接种至黑色避光96孔板中，每孔200μL，细胞密度104/孔，再加入终浓度10-5mol/L的温敏探针RhBⅣ，并置于培养箱内继续培养20分钟。加入4％多聚甲醛溶液固定细胞15分钟后，采用27℃预先恒温处理的PBS清洗三次后，迅速置于温控酶标仪中，设定升温程序(每分钟温度升高2℃)，取27-41℃温度范围，分别检测其荧光强度变化，激发波长设为520nm，发射波长设为592nm。实验重复6次，以平均值表示荧光强度的变化，结果如图9A所示，随着温度升高其荧光值响应逐渐降低，在27℃至41℃范围内呈现良好的线性关系。经线性拟合满足方程：Y＝-780.5X+45871(其中X为温度，Y为荧光强度)，经计算从27℃至41℃，荧光强度降低55％，平均每升高1℃荧光响应值约降低为3.92％。
2)为考察温敏探针RhBⅣ荧光强度对温度相应的稳定性，将上述酶标板温度从27℃升高到41℃，然后再将温度从41℃降到27℃，重复3次，在激发波长为520nm，发射波长为592nm的相同条件下进行重复检测，通过统计荧光值的变化来评价探针对温度变化的稳定性，结果如图9B所示，随着温度的反复变化，可以发现温敏探针荧光强度随着温度的重复变化，高低温度每次变化的荧光强度没有明显差异，表明温敏探针RhBⅣ具有良好的温度稳定性和重现性。
实施例6：基于温敏探针RhBⅣ检测药物对细胞温度变化的影响
京尼平为线粒体解耦联蛋白(uncoupling protein,UCP)的天然抑制剂，可有效减低线粒体温度。本实施例采用氧化磷酸化抑制剂羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)使线粒体产生高热，再使用温敏探针RhBⅣ考察京尼平在细胞水平上的解热效果。
具体参照实施例3的方法培养HepG2细胞，将培养的HepG2细胞接种至黑色避光96孔板中，细胞密度104/孔，分别加入浓度为10-4mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L和10-7mol/L的京尼平，37℃孵育6小时后，用PBS洗三次，再加入5×10-5mol/L羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)孵育30分钟，用PBS清洗三次后，加入10-5mol/L的温敏探针RhBⅣ继续孵育20分钟，再经PBS清洗后，酶标仪下测定荧光强度的变化。激发波长520nm，发射波长592nm。同时设置空白组和模型组，空白组不加CCCP和京尼平，模型组不加京尼平。
实验结果如图10所示，与空白组相比，模型组通过加入CCCP后荧光值下降较为明显，表明CCCP可以诱导线粒体发热。与模型组相比，京尼平可以浓度依赖性的提升RhBⅣ探针的荧光强度，与模型组相比京尼平表现出浓度依赖的解热活性(**P<0.01；***P<0.001)。
实施例7：基于温敏探针RhBⅣ活体检测小动物的体温变化
取20克昆明小鼠，尾静脉注射10mg/Kg的温敏探针RhBⅣ，给药30分钟后利用小动物活体成像仪(NightOWLⅡLB983，德国)检测探针在小鼠体内的分布情况，结果如图11A所示，温敏探针主要富集在小鼠的肝脏、肾脏和淋巴组织；动态观察发现，RhBⅣ探针分子约在60至120分钟内在肝脏内的荧光强度基本保持稳定，90分钟达到峰值，并可以持续6小时(每组4只动物)。因此确定最佳图像采集时间为90分钟，如图11B所示。
为了考察药物对小鼠体温变化的影响，本实验通过2,4-二硝基苯酚诱导的小鼠发热模型，并采用温敏探针RhBⅣ检测小动物的体温变化。实验设空白组、2,4-二硝基苯酚发热组、安痛定以及京尼平给药组(每组4只)，分别通过其温敏探针RhBⅣ荧光强度的变化考察了给药前后小鼠体温的相对变化。结果如图11C所示，2,4-二硝基苯酚能显著升高小鼠体温，温敏探针RhBⅣ的荧光强度被削弱(与空白组比较，##P<0.01)。安痛定(20mg/Kg)与京尼平(28mg/Kg)均表现出良好的解热效果(与模型组比较,***P<0.001,*P<0.05)。实验结果表明温敏探针RhBⅣ可以在活体水平上检测小鼠体温的变化，有良好的应用前景。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。