一种来源于亚洲象肠道毛螺菌科的细菌漆酶及其基因
阅读说明：本技术 一种来源于亚洲象肠道毛螺菌科的细菌漆酶及其基因 (Bacterial laccase from Astrospiraceae of elephant intestinal tract and gene thereof ) 是由 黄遵锡 张呈波 苗华彪 吴倩 于 2021-08-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种来源于亚洲象肠道毛螺菌科的细菌漆酶及其基因,该细菌漆酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示,编码基因如SEQIDNO.2所示,利用宏基因组分箱技术组装获得一株未培养毛螺菌科NK4A136菌属细菌的基因组,经InterPro和Pfam数据库注释含多铜多酚氧化还原酶漆酶基因,通过基因工程技术制备得到细菌漆酶。该细菌漆酶与真菌来源的漆酶相比,其pH稳定性和温度稳定性更好。(The invention discloses a bacterial laccase from Astrospiraceae of Asian elephant intestinal tract and a gene thereof, wherein the amino acid sequence of the bacterial laccase is shown as SEQIDNO.1, the coding gene is shown as SEQIDNO.2, the genome of a strain of bacteria of NK4A136 genus of the Astrospiraceae is obtained by assembling by using a metagenome component box technology, the gene containing multi-copper polyphenol oxidoreductase laccase is annotated by InterPro and Pfam databases, and the bacterial laccase is prepared by a gene engineering technology. Compared with laccase from fungi, the bacterial laccase has better pH stability and temperature stability.)
技术领域
本发明属于酶的基因工程
技术领域
，涉及一种来源于亚洲象肠道毛螺菌科的细菌漆酶及其基因，通过宏基因组测序分析技术和分子生物学手段获得表达该新型漆酶的重组表达菌株。背景技术
漆酶(Laccase，EC 1.10.3.2)，又称为酚酶、多酚氧化酶，属于一种多铜氧化酶类，其能够氧化多种芳香族化合物，最终将分子氧还原生成水。所以，漆酶是一类具有重要应用价值的绿色催化剂。
漆酶广泛分布在真菌、细菌、昆虫和动植物体内。对比动植物来源漆酶，微生物漆酶来源更加丰富。真菌来源漆酶在pH 4～6和30～55℃条件下有较高活性，而工业应用往往需要高温和强碱环境，使漆酶的应用受限且成本较高。而且真菌生长周期长对培养基要求苛刻，使得发酵罐易受到机械损伤，这些问题导致真菌漆酶在工业上的应用受到严重影响。而细菌漆酶不需要糖基化修饰，通常以单体蛋白体形式存在，pH适用范围广、热稳定好且存在Cu2+抗性等。这些对漆酶更广泛的应用具有重要意义。目前，对于细菌漆酶基因资源的挖掘较少，有待进一步发掘高活性高稳定性的新型细菌漆酶。
随着第二代测序技术的发展，结合宏基因组学分析手段，在挖掘微生物功能酶基因方面，能够成功的避开传统的微生物纯培养技术难题，且能够快速在短时间内发现大量功能酶基因，提高了功能酶基因
筛选的广泛性和有效性，大大促进了功能酶基因克隆效率的提高，为寻找和发现新型漆酶基因提供了新的研究策略。
发明内容
本发明的目的在于克服和避免漆酶在工业生产应用中不足之处，并提供一种来源于亚洲象肠道未培养毛螺菌科新型细菌漆酶编码基因及表达该新型细菌漆酶基因的工程菌株。
本发明中，新型漆酶的编码基因来源于亚洲象肠道微生物宏基因组，应用分箱(Binning)技术组装获得一株未培养毛螺菌科NK4A136菌属细菌的基因组(完整度为96.44％，污染率为0)，经InterPro和Pfam数据库注释含多铜多酚氧化还原酶漆酶基因(IPR003730和PF02578.16)，该漆酶基因的氨基酸序列与NR数据库的现有漆酶氨基酸序列比对最高一致性约为52％。对该新型漆酶编码基因进行克隆，并在枯草芽孢杆菌表达系统进行表达，获得了枯草芽孢杆菌高稳定性漆酶重组菌株。
为了达到上述技术目的，本发明具体通过以下技术方案实现：
一种来源于亚洲象肠道毛螺菌科的细菌漆酶，所述细菌漆酶的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
所述细菌漆酶以底物2,2’-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)测定新型漆酶酶学性质时，最佳作用温度为70℃，最适作用pH为5。
以底物ABTS测定该新型漆酶的pH稳定性和热稳定性，结果显示：在60℃下，pH 5～6范围内具有良好稳定性，作为来源于亚洲象肠道未培养毛螺菌科细菌的新型漆酶，其pH稳定性和热稳定性比真菌来源的漆酶更好。
所述细菌漆酶的编码基因也在本发明的保护范围制备，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
在本发明的另一方面，将上述细菌漆酶的编码基因插入到表达载体中，使其核苷酸序列与表达调控序列相连接。提供了一种包含所述编码基因的重组载体。
作为本发明的一个优选的实施方案，将上述细菌漆酶的编码基因和表达载体pBE-S相连接，得到重组大肠杆菌表达质粒pBE-S-Laac2。
更优选的，用于表达所述细菌漆酶的宿主细胞为E.coli DH5α。
在本发明的另一方面，还提供了一种包含所述细菌漆酶的编码基因的重组菌株。
优选的所述重组菌株为枯草芽孢杆菌，更优选的为重组菌株WB600/pBE-S-Lacc2。
在本发明的另一方面，提供了上述新型细菌漆酶的制备方法，包括以下步骤：
1)以亚洲象肠道宏基因组DNA为模板，并根据宏基因组分箱技术组装出的未培养毛螺菌科细菌基因组中编码漆酶的基因，分析其保守序列，设计所述漆酶的编码基因扩增引物为Pf和Pr，通过PCR扩增获得目的漆酶编码基因lacc2；
上游引物Pf：CAATTCATGAATGATATGACAGCAG，
下游引物Pr：GTCGACCTATCTAGCAAGCATGATAAC；
2)漆酶编码基因lacc2和表达载体pBE-S经EcoRI和SalI双酶切，T4连接酶连接后转化至克隆宿主E.coli DH5α，通过菌落PCR、酶切和测序验证正确后，获得了重组质粒pBE-S-laac2；
3)取重组质粒pBE-S-laac2转化至宿主枯草芽孢杆菌WB600并成功表达，获得产高稳定性新型漆酶的重组菌株；
4)通过发酵工艺优化获得高产高稳定性新型漆酶Lacc2。
在本发明的另一方面，提供了所述漆酶Lacc2在结晶紫、茜素红、靛红和活性黑5脱色中的应用。
新型漆酶Lacc2在无介体情况下，6h内对结晶紫、茜素红、靛红和活性黑5的脱色率分别为80.8％、81.6％、68.5％和45.85％；体系中加入介体乙酰丁香酮后，新型漆酶Lacc2在6h内，对活性黑5的脱色率提高至84.95％。
本发明的有益效果为：
本发明通过宏基因组分箱技术组装获得一株未培养毛螺菌科NK4A136菌属细菌的基因组(完整度为96.44％，污染率为0)，经InterPro和Pfam数据库注释含多铜多酚氧化还原酶漆酶基因，通过基因工程技术制备得到细菌漆酶Lacc2。该细菌漆酶Lacc2与真菌来源的漆酶相比，在70℃下，pH 5～6范围内具有良好稳定性，其pH稳定性和温度稳定性更好。
附图说明
图1是本发明新型漆酶编码基因的PCR扩增验证电泳图；
图2是本发明重组质粒pBE-S-laac2酶切电泳图；
图3是本发明新型漆酶Lacc2最适作用温度曲线；
图4是本发明新型漆酶Lacc2最适作用pH曲线；
图5是本发明新型漆酶Lacc2对4种染料的脱色效果，A:无介体条件下新型漆酶Lacc2对4种染料的脱色效果，B:有介体条件下新型漆酶Lacc2对4种染料的脱色效果。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所使用的亚洲象肠道宏基因组测序原始数据己存入中国科学院大数据中心基因组序列档案库，登录号为CRA003369。
实施例1亚洲象肠道未培养毛螺菌科新型细菌漆酶基因的获得
1、新型漆酶编码基因来源于本实验室保存的亚洲象新鲜粪便宏基因组，利用试剂盒(QIAamp DNA Stool Mini Kit)提取其宏基因组DNA，其中亚洲象新鲜粪便宏基因组DNA的提取步骤如下：
1)称取亚洲象粪便约0.2g至灭菌离心管中；
2)加入1.4mL buffer ASL，连续涡旋数分钟至充分混匀，70℃温育5min后再涡旋混匀15s；
3)20,000g离心1min去除粪便杂质，取上清至新的离心管；
4)加入1片inhibitEX Tablet后立即混匀约1min，然后室温放置1min，使抑制剂吸附到inhibitEX基质上，20,000g离心3min；
5)取上清至新的离心管，同4)再离心1次；
6)吸取上清至已加入15μL proteinase K的新离心管中，加入200μL buffer AL，充分混匀后70℃温育10min；
7)加入200μL无水乙醇，充分混匀后转移至QIAamp吸附柱中，20,000g离心1min(如果液体没有全部通过柱子，在重复离心1次)；
8)分别依次用500μL的buffer AW1和AW2洗柱，同7)离心3min后，将柱子转至新的收集管；
9)在吸附柱中央加入适量buffer AE，室温放置1min后，同上离心1min进行洗脱，所得的宏基因组DNA可用于下游的分子生物学实验或-20℃保存备用。
2、通过宏基因组学分析的分箱(Binning)组装技术，获得一株未培养毛螺菌科NK4A136菌属细菌的基因组(完整度为99.73％，污染率为0)，经InterPro和Pfam数据库注释含一条多铜多酚氧化还原酶漆酶基因(IPR003730和PF02578.16)，经NR数据库blast，结果显示，与NR数据库漆酶的最高氨基酸一致性约为52％，分析该新型漆酶的保守序列，设计本发明的漆酶编码基因的扩增引物如下：
上游引物Pf：CAATTCATGAATGATATGACAGCAG，
下游引物Pr：GTCGACCTATCTAGCAAGCATGATAAC；
上、下游引物Pf和Pr是用来扩增在枯草芽孢杆菌表达的漆酶基因，限制性酶切位点EcoRI和SalI分别引入上、下游引物。
扩增模板为亚洲象肠道宏基因组DNA，其PCR扩增反应体系为：EX Taq 1.25μL，10XBuffer 10μL，dNTP mix 5μL，Pf和Pr各2.5μL，DNA 5μL，ddH20 73.75μL，总体积100μL。
扩增反应条件为：94℃，5min；94℃，30s；55～61℃，30s；72℃，1min(2～4,30个循环)；72℃，10min；4℃，10min。
PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳验证，获得795bp的条带(图1)，PCR产物胶回收后经双酶切并纯化回收，获得本发明的亚洲象肠道未培养毛螺菌科新型细菌漆酶编码基因lacc2，见序列SEQ ID NO.2。
实施例2亚洲象肠道未培养毛螺菌科来源的新型细菌漆酶重组质粒的构建
1)用限制性内切酶EcoRI和SalI对表达质粒pBE-S进行双酶切，再通过T4连接酶将pBE-S质粒酶切后纯化产物与目的基因酶切后纯化产物在16℃下过夜连接，连接产物经化学转化至E.coli DH5α。
2)经菌落PCR鉴定、双酶切鉴定(图2)和测序正确后，获得重组质粒pBE-S-lacc2；
3)经验证正确的重组质粒pBE-S-lacc2的克隆菌株E.coli DH5α/pBE-S-lacc2加15％甘油于-80℃保存。
实施例3枯草芽孢杆菌高稳定性新型漆酶重组菌的构建
1)向枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞加入1μL(50ng/μL)pBE-S-lacc2重组质粒，轻柔混匀；
2)混匀后，转移至预冷的电转杯中，冰浴1～1.5min后，电击一次(3.0kV，3.0～4.5ms)，电击完毕后，立即加入1mL复苏培养基(LB+0.5mol/L山梨醇+0.38mol/L甘露醇)；
3)37℃震荡培养3h后，将菌液涂布于含有Kan抗性的LB平板上，37℃培养16h左右；
4)挑取阳性转化子，进行双酶切验证，确定获得表达lacc2的枯草芽孢杆菌重组菌株WB600/pBE-S-lacc2。
实施例4漆酶酶活的测定
酶活的测定为三次平行实验，结果取平均值。
酶活力单位(U)：1min内氧化1μmol ABTS所需的漆酶量。
预先将480μL的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液和100μL的3mmol/L的ABTS充分混匀，并于50℃条件下水浴5min。迅速加入20μL的Lacc1漆酶溶液。在420nm波长下读取OD值。
漆酶酶活的计算公式如下：
酶活(U/L)＝(ΔOD×V1×n)/(Δt×V2×ε×10-6)
公式中，ΔOD为起始和结束时的吸光度差值；V1为反应体系的总体积(mL)；n为酶液的稀释倍数；Δt为反应时间(min)；V2为体系中酶液的体积(mL)；ε为摩尔消化系数(L/(mol·cm))。
漆酶的最适pH：在50℃下，将反应体系放置在不同pH(2.0～11.0)的缓冲液中，测定酶活，以最高酶活为100％，比较获得最适反应pH。
最适温度：在最适反应pH条件下，将反应体系分别在不同的温度(30、40、50、60、70、80、90、100℃)条件下测酶活，以最高酶活为100％，得到漆酶的最适反应温度。
pH稳定性：将酶液放置在不同pH的缓冲液中，4℃付宇5h，以最高酶活为100％，测定其剩余酶活。
热稳定性测定：在最适反应pH条件下，将漆酶置于不同的温度梯度(30～90℃)条件下孵育2h，以最高酶活为100％，测定Lacc1漆酶的剩余酶活。
通过上述方法测定新型漆酶的酶学性质，该新型漆酶酶学性质如下：
以ABTS为底物测定新型漆酶酶学性质时，最适温度为70℃(图3)，最适pH为5(图4)；
以ABTS为底物测定该新型漆酶的pH稳定性和热稳定性，结果显示：该新型细菌漆酶在60℃下，pH 5～6的范围内稳定性良好。在4℃，pH＝5下保存4天时，残余酶活达到300％左右，在4℃，pH＝6.5下保存4天时，残余酶活达到200％左右；在4℃，pH＝5下保存10天时，残余酶活达到200％左右，在4℃，pH＝6.5下保存10天时，残余酶活达到200％左右(以上酶活均是在70℃，pH5条件下测定，且以初始酶活作为100％)。
实施例5新型漆酶在枯草芽孢杆菌重组菌株中的表达及制备
1)挑取枯草芽孢杆菌重组菌株WB600/pBE-S-lacc2单菌落接种到含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡过夜培养；
2)将步骤1)培养所得种子接种以2％的量到50mL LB液体培养基中，37℃、震荡培养约48h；
3)将步骤2)所得发酵液离心，收集上清，即可获得高稳定性新型漆酶粗酶液；
4)以ABTS为底物测定新型漆酶粗酶液酶活力(pH 5、70℃条件下)，枯草芽孢杆菌表达新型漆酶重组菌株发酵后漆酶酶活可达到300U/mL，然后采用分级盐析法沉淀新型漆酶，收集蛋白质沉淀，溶解后，透析除盐，再经离子交换层析、凝胶层析后，冷冻干燥制得新型漆酶纯酶酶粉。
实施例6新型漆酶Lacc2对4种染料的脱色处理及脱色率的计算
茜红素初始浓度为1,000mg/L,终浓度为100mg/L,最大吸收波长为520nm；活性黑5初始浓度为400mg/L,终浓度为40mg/L,最大吸收波长为597nm；靛红初始浓度为250mg/L,终浓度为25mg/L,最大吸收波长为610nm；结晶紫初始浓度为50mg/L,终浓度为5mg/L,最大吸收波长为583nm。无介体脱色反应体系的总体积为12mL，包括染料母液1.2mL、新型漆酶Lacc2粗酶液100μL和pH 5的0.2mol/L的Na2HPO4-NaHPO4缓冲液10.7mL。有介体的脱色反应体系总体积为12mL，包括0.1mol/L乙酰丁香酮12μL、染料母液1.2mL、新型漆酶Lacc2粗酶液100μL和pH 5的0.2mol/L的Na2HPO4-NaHPO4缓冲液10.688mL。37℃，200r/min摇床中进行脱色，测定2h、4h和6h时不同染料在最大吸收波长的光密度值，计算新型漆酶Lacc2对各种染料的脱色率。脱色率计算公式为：R＝(A0-A)/A0×100％，式中，A为定期取样时染料的光密度值，A0为初始染料的光密度值，3次重复。
新型漆酶Lacc2在无介体情况下，6h内对结晶紫、茜素红、靛红和活性黑5的脱色率分别为80.8％、81.6％、68.5％和45.85％，对结晶紫和茜素红的脱色效果较好；体系中加入介体乙酰丁香酮后，新型漆酶Lacc2在6h内，对活性黑5的脱色率提高至84.95％(图5)。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 云南师范大学
<120> 一种来源于亚洲象肠道毛螺菌科的细菌漆酶及其基因
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 264
<212> PRT
<213> 漆酶(Lacc2)
<400> 1
Met Asn Asp Met Thr Ala Val Ile Lys Thr Ser Ser Lys Ile Lys Ser
1 5 10 15
Pro His Gly Phe Ser Thr Arg Ile Gly Gly Val Ser Thr Gly Ile Phe
20 25 30
Asp Ser Leu Asn Leu Gly Met Asn Arg Gly Asp Asp Glu Asn Leu Val
35 40 45
Lys Glu Asn Trp Arg Arg Phe Met Glu Ala Ser Gly Ile Ser Glu Glu
50 55 60
Lys Phe Val Cys Gly Lys Gln Val His Gly Asn Tyr Val Gln Ile Ala
65 70 75 80
Thr Ser Lys Ile Ala Arg Pro Ala Tyr Gly Pro Gly Trp Met Ala Glu
85 90 95
Ala Asp Gly Tyr Val Thr Asn Glu Pro Gly Leu Pro Leu Ala Val Phe
100 105 110
Thr Ala Asp Cys Val Pro Val Leu Leu Glu Asp Tyr Val Ala Gly Val
115 120 125
Val Ala Ala Val His Cys Gly Trp Arg Ser Thr Val Ala Asp Ile Glu
130 135 140
Lys Glu Thr Ile Glu Lys Met Val Gly Leu Gly Ala Ser Thr Thr Asn
145 150 155 160
Ile Asn Val Ala Ile Gly Pro Ala Ile Cys Asp Lys Cys Phe Gln Val
165 170 175
Gly Ser Glu Val Ile Gly Ala Val Asn Lys Leu Leu Asn Gly Val Glu
180 185 190
Thr Gly Asp Leu Tyr Phe Pro Asp Lys Glu His Asp Asp Lys Phe Tyr
195 200 205
Leu Asn Leu Arg Gly Val Val Lys Arg Arg Phe Met Met Leu Gly Val
210 215 220
Leu Glu Asp Asn Ile Glu Val Ser Arg Glu Cys Thr Met His Gln Pro
225 230 235 240
Thr Glu Tyr Trp Ser His Arg Tyr Thr His Gly Glu Arg Gly Ser Gln
245 250 255
Ala Asn Val Ile Met Leu Ala Arg
260
<210> 2
<211> 795
<212> DNA
<213> 漆酶基因(lacc2)
<400> 2
atgaatgata tgacagcagt tattaaaact tcttctaaaa taaagagtcc tcatggcttt 60
tcaacaagaa ttggaggcgt gagtacagga atattcgatt ctcttaatct tggaatgaat 120
agaggcgacg atgaaaatct cgtcaaggaa aactggcgac gattcatgga ggccagtgga 180
ataagtgaag aaaaattcgt gtgtggcaag caggtgcatg gtaattatgt gcagattgct 240
acaagtaaaa tcgcgaggcc tgcatatgga cctggctgga tggcagaggc cgatggctat 300
gttaccaatg aaccagggct tccgctagct gtttttacag ctgattgtgt gccagtgctg 360
ctagaagatt atgtggccgg agttgtcgca gcggtacact gtggatggcg aagtacagtg 420
gctgatatag aaaaggaaac cattgagaag atggtgggac taggcgctag cactactaat 480
attaatgtgg caataggacc agccatatgt gacaagtgct ttcaagttgg tagtgaagtt 540
attggtgccg ttaataaact tcttaatggt gttgaaacag gggatttata ttttccagat 600
aaagagcatg atgataaatt ctatcttaac ctaagagggg tagtaaaaag acggtttatg 660
atgcttggtg tactagaaga caatattgaa gtatccaggg aatgtacaat gcatcaacca 720
actgaatact ggtctcatcg atatacacat ggtgagagag gaagtcaggc caacgttatc 780
atgcttgcta gatag 795
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caattcatga atgatatgac agcag 25
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtcgacctat ctagcaagca tgataac 27