一种毛竹高生长相关基因PeGA20ox1及其应用
阅读说明：本技术 一种毛竹高生长相关基因PeGA20ox1及其应用 (Phyllostachys pubescens high growth related gene PeGA20ox1 and application thereof ) 是由 侯丹 魏涵天 林新春 兰智鑫 刘容秀 张朋威 于 2021-07-07 设计创作，主要内容包括：一种毛竹高生长相关基因PeGA20ox1及其应用,属于分子生物技术领域。本发明一方面提供了毛竹高生长相关基因PeGA20ox1以及其编码蛋白,另一方面提供了毛竹高生长相关基因PeGA20ox1的用途。本发明提供了一种重要的并且可能具有普适性的调控株高和茎秆生物量累积的基因资源,为培育株高较高和茎秆生物量累积较多的植物品种提供了优秀的候选基因。(A moso bamboo high growth related gene PeGA20ox1 and application thereof belong to the technical field of molecular biology. The invention provides a moso bamboo high growth related gene PeGA20ox1 and its coded protein on one hand, and provides the use of the moso bamboo high growth related gene PeGA20ox1 on the other hand. The invention provides an important and possibly universal gene resource for regulating and controlling the plant height and the stalk biomass accumulation, and provides an excellent candidate gene for cultivating plant varieties with higher plant height and more stalk biomass accumulation.)
技术领域
本发明属于分子生物
技术领域
，具体涉及一种毛竹高生长相关基因PeGA20ox1及其应用。背景技术
毛竹(Phyllostachys edulis)属于禾本科竹亚科刚竹属，分布广泛，经济价值高。毛竹是植物界生长最快的植物之一，在气候适宜的春季日均生长量可达到1m。毛竹作为典型的竹类植物，在中国栽培历史最为悠久，分布面积最为广泛，是集众多功能于一体的笋材两用竹种。毛竹因其茎秆木质化程度高且坚韧是优秀的非木质资源，可用于加工人造板、竹浆纸和竹工艺品等。在福建、浙江、四川和江西等竹子主产区，竹产业蓬勃发展，目前已经成为了当地人民经济收入的重要组成部分。近年来随着分子生物学的发展，已经在毛竹中鉴定了一系列高生长相关基因，但目前对毛竹高生长相关基因功能研究的资料仍然十分匮乏，值得进行更加深入的探索。
赤霉素(gibberellins,GAs)在植物整个生长周期中都起着重要的作用，调节着植物的生长，影响着植物的发育。GA20氧化酶(GA20 oxidase，GA20ox)可通过13-羟化途径催化GA12形成GA9，也可通过非13-羟化途径催化GA53形成GA20，其中GA9和GA20分别是具有生物活性的GA4和GA1的直接前体。竹类植物中，赤霉素在笋尖合成通过极性运输到中部，可能通过影响竹子节间细胞分裂等方式调控着竹类植物的高生长。
综上所述，对参与毛竹高生长的GA通路相关基因的研究有助于了解毛竹快速生长机理，为后续遗传育种构建优良性状竹子打下良好的基础，进而提高竹林生物量，促进竹产业的经济繁荣发展具有重要的现实意义和应用前景。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种毛竹高生长相关基因PeGA20ox1及其应用的技术方案。
本发明是通过以下技术方案实现：
所述的一种毛竹高生长相关基因PeGA20ox1，该核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述的毛竹高生长相关基因PeGA20ox1编码蛋白，该蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
所述的一种毛竹高生长相关基因PeGA20ox1在调控植物株高和茎秆生物量累积中的应用。
所述的应用，使植物包含基因PeGA20ox1或使植物过表达基因PeGA20ox1。
所述的应用，构建含有基因PeGA20ox1的植物表达载体，将其异源转化到拟南芥中，筛选获得T3代阳性植株，通过阳性植株和野生型植株表型分析，获得了株高和茎秆生物量增加的植株。
所述的应用，具体包括以下步骤：
1)采集来自于浙江省杭州市临安区东湖村毛竹林的毛竹节间，进行RNA提取，反转录成cDNA，克隆出PeGA20ox1的CDS序列，再将其连接pMD18-T载体进行测序，鉴定正确后构建过表达载体，异源转化到拟南芥中；
2)利用潮霉素抗性和PCR技术对PeGA20ox1基因异源转化拟南芥进行了阳性植株筛选，得到T3代阳性植株，并对其进行了RNA提取和表型统计，验证其株高和茎秆生物量的增加，获得了株高和茎秆生物量增加的植株。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明首次从毛竹中获得PeGA20ox1基因以及编码蛋白，并验证了其调控植株高和茎秆生物量的生物学功能。
2、本发明首次将毛竹PeGA20ox1基因在拟南芥中过量表达，运用PCR方法证明该基因已成功整合到拟南芥基因组中，即阳性植株。
3、本发明对T3代转基因拟南芥和野生型拟南芥进行表型观察和生物量统计，结果表明转基因植株株高和茎秆生物量均较野生型高，说明PeGA20ox1基因的过表达提高了转基因拟南芥株高和茎秆生物量的累积。
附图说明
图1PeGA20ox1转基因拟南芥株系阳性植株检测；
图2PeGA20ox1转基因拟南芥株系阳性植株基因表达水平；
图3移栽后第30天不同转基因拟南芥表型；
图4移栽后转基因拟南芥主茎长度统计；
图5转基因株系拟南芥茎秆干鲜重；
图6转基因株系拟南芥茎秆木质素和纤维素含量。
具体实施方式
下面结合具体的实例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
实施例1：毛竹PeGA20ox1基因的克隆
1、材料准备：毛竹节间采集来自于浙江省杭州市临安区东湖村毛竹林(30°15’N,119°43’E)的，置于-80℃保存，用于后续实验使用。
2、RNA提取
参考Takara公司RNAiso plus试剂说明书，具体步骤如下：
(1)将实验所用研钵、镊子等器皿于高温灭菌后液氮预冷，取-80℃保存的毛竹样品于研钵中，加入液氮，快速研磨成粉末。
(2)取100mg左右样品粉末于2ml RNA-free离心管中，加入1ml RNAiso plus试剂，充分振荡混匀，静置5min，然后将样品于4℃下，12000g离心5min。
(3)取步骤2上清液800μl至1.5ml RNA-free离心管中，加入200ul三氯甲烷，剧烈振荡混匀15s，静置5min，然后4℃，12000g离心15min。
(4)取步骤3上清液400μl至新1.5ml RNA-free离心管中，加入-20℃预冷异丙醇400μl，上下颠倒混匀，静置10min，然后4℃，12000g离心10min。
(5)弃上清液，加入1ml无水乙醇重悬清洗沉淀，4℃，7500g离心5min。
(6)弃上清液，在4℃，7500g离心5min后吸出离心管中剩余酒精，于超净台中风干5min，然后加入40μl RNA-free水溶解沉淀。
3、RNA反转录
参考PrimerScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara)试剂盒，实验耗材均为RNA-free，反应均在冰上进行。
(1)去基因组DNA。以下试剂均于冰上配制反应混合液，离心混匀后42℃反应2min。
(2)RNA反转录cDNA。在步骤一PCR管中加入以下反应混合液，彻底混匀离心后，在37℃下反应15min，85℃反应5s，之后冰上冷却。
(3)反转录完成的cDNA稀释10倍后可用于基因克隆和荧光定量PCR等相关实验。
4、基因克隆
(1)从毛竹数据库中抽取PeGA20ox1基因的cDNA序列，设计引物，序列如下：
PeGA20ox1-cds-F：ATGGTGCAGAACCCACAGGTGGTCT(如SEQ ID NO.3所示)
PeGA20ox1-cds-R：CTAGCTAGGAGCCCTGGAGGGCTCA(如SEQ ID NO.4所示)
(2)PCR扩增
以毛竹cDNA为模板，用相应引物进行PCR扩增，反应程序为：95℃5min；95℃5s，60℃30s,72℃60s,30cycles；72℃10min。扩增仪器为CFX96TM Real-time PCR仪，扩增体系如下所示：
(3)使用1％琼脂糖凝胶电泳，检测条带大小是否符合预期，进行下一步割胶回收验证。
(4)胶回收纯化，使用上海生工生物公司SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收产物纯化。
(5)连接反应
参考Takara公司pMDTM18-T Vector Cloning Kit说明书，连接体系如下所示：
(6)连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α
参考上海唯地生物技术有限公司大肠杆菌感受态DH5α转化说明书，具体步骤如下所示：
①将购置的大肠杆菌感受态DH5α于冰上冻融，加入10μl连接产物，轻弹管底混匀，冰上静置30min。
②42℃90s后冰上静置2min。
③加入300μl无抗LB培养基，220rpm，37℃振荡培养1h。
④取100μl左右培养液均匀涂布于Luria-Bertani(LB)培养基(含氨苄青霉素)，37℃培养12h。
⑤挑选单克隆菌落于1ml含有相应抗生素液体培养基离心管中，37℃，220rpm震荡培养4-5h，直到菌液浑浊，进行菌液PCR鉴定。
⑥将步骤5鉴定正确的阳性菌液送到上海生工生物公司测序，每条序列选取3个以上单克隆，减少PCR过程中错配对基因序列确认的影响。
最终克隆得到的毛竹高生长相关基因PeGA20ox1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，毛竹高生长相关基因PeGA20ox1编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2：PeGA20ox1基因异源转化拟南芥提高其株高及茎秆生物量的应用
1、转基因拟南芥阳性植株筛选和培养
(1)DNA提取及PCR检测
①适量CTAB溶液65℃预热，适量异丙醇-20℃预冷。
②将采集的样品用液氮研磨成粉末，移至2ml离心管中，加入800μl预热的CTAB溶液，振荡混匀。
③将步骤2中离心管65℃水浴40min，期间每隔8min颠倒混匀一次。
④加入800μl氯仿：异丙醇(24：1)，剧烈振荡混匀使其乳化。
⑤13000rpm离心12min，取600μl上清液至1.5ml离心管中。
⑥加入600μl预冷的异丙醇，振荡混匀，置于-20℃中1h。
⑦13000rpm离心10min，弃上清，加入1ml无水乙醇清洗沉淀。
⑧7500rpm离心5min，弃上清，留沉淀DNA。
⑨待沉淀与通风橱晾干后，加入40μl ddH2O溶解沉淀。
⑩将上述获得DNA进行PCR检测，最终共获得16个阳性株系，如图1所示，分别将其命名为OW-1，OW-2，OW-3，OW-4，OW-5，OW-6，OW-7，OW-8，OW-9，OW-10，OW-11，OW-12，OW-13，OW-16，OW-17，OW-18。
(2)RNA提取及PeGA20ox1基因表达量的检测
①参照实施例1中的RNA提取方法进行转基因拟南芥RNA的提取，这里不再赘述。
②将上述提取的RNA进行PeGA20ox1基因的表达量检测。由图2可知，不同PeGA20ox1转基因拟南芥株系的表达量存在着较大差异。最终根据表达量测定结果与初步表型分析，本发明选择OW-1，OW-2与OW-16转基因植株进行后续的实验。
(3)转基因拟南芥的培养
①将干燥后的种子消毒后均匀撒于1/2Murashigeand Skoog(MS)培养基(含潮霉素)上萌发，同时播撒野生型拟南芥(Col-0)作对照，于4℃黑暗条件下春化24h。
②待春化结束后转移至光照条件(16h light/8h dark)下培养，温度23℃。
③将长出4片真叶且扎根于培养基的拟南芥移栽至花盆中，提供充足水分。
2、转基因拟南芥的功能验证
(1)表型统计：每个转基因株系拟南芥设置30个以上生物学重复，同时设置野生型拟南芥(Col-0)和突变体拟南芥(pg1，已鉴定为纯和，SALK编号为SALK_094207C)作为对照间种，种植地点为浙江农林大学拟南芥室。拟南芥抽薹时间和植株高均统计于移栽后每天下午2点至4点。莲座叶数目、莲座叶直径和茎秆生物量均统计于移栽后第30天。测定结果如图3、图4、图5和图6所示。转基因拟南芥抽薹时间早于野生型拟南芥3至4天，莲座叶数目小于野生型拟南芥10片左右，莲座叶直径差异不显著。第30天时，转基因拟南芥OW-1、OW-2和OW-16主茎长度均为野生型拟南芥主茎长度的1.40倍左右。第30天时，转基因拟南芥的茎秆干鲜重均大野生型拟南芥，且存在显著性差异。以上结果表明PeGA20ox1转基因拟南芥提前进入了生殖生长阶段，且转基因拟南芥株高和茎秆生物量均显著大于野生型拟南芥。毛竹高生长PeGA20ox1基因在一定程度上具有提高植株株高和茎秆生物量累积的作用。
(2)木质素和纤维素含量：根据苏州科铭生物技术有限公司木质素含量测试盒和纤维素含量(CLL)测试盒说明书，测定第30天时拟南芥茎秆木质素和纤维素含量。测定结果见表1所示，转基因拟南芥茎秆木质素和纤维素含量均显著大于野生型拟南芥，其中转基因拟南芥茎秆木质素含量大约为野生型拟南芥的1.42倍，纤维素含量大约为野生型拟南芥的1.92倍。
以上结果表明转基因拟南芥木质素和纤维素的累积均显著高于野生型拟南芥，可能是造成转基因拟南芥茎秆生物量累积高于野生型拟南芥的原因之一。
表1转基因株系表型统计
序列表
<110> 浙江农林大学
<120> 一种毛竹高生长相关基因PeGA20ox1及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1230
<212> DNA
<213> 毛竹(Phyllostachys edulis)
<400> 1
atggtgcaga acccacaggt ggtcttcgac gccgccgtgc tgagcggcca ggccgacatc 60
ccgtcgcagt tcatctggcc cgcggacgag agccccaccc ctgacgccgc cgaggagctc 120
cccgtgccgc tcatcgacat cggcgggctc ctctcggggg accgcgcggc cgccgccgag 180
gtgacccggc tggtgggcga ggcgtgcgag cggcacggct tcttccaggt cgtgaaccac 240
ggcatcgacg cggagcttct ggcggaggcc caccggtgcg tggacgcctt cttcacgctg 300
ccgctcgcgg agaagcagcg cgccctgcgc cgcccaggcg agagctgcgg ctacgcgagc 360
agcttcacgg ggcggttcgc gtccaagctc ccctggaaag agacgctctc cttcccttac 420
tccgcctgcg cctcctcccc cgacctcgtc gtcgataact tcgtgcaaaa gctcggcgag 480
gagtaccgcc gcctcgggta actatccatt aattaatttc ttcctgcttg gtccgtgaaa 540
cagagcagag ctgcatccgt gcgtggaaga tgaaactaac aaaggtcggt cgatatatgg 600
tgcatatgaa aaaacaggga ggtttacgcg cgctactgcg gcgagatgag ccggctgtcg 660
ctggagatca tggaggtgct gggcgagagc ctgggcgtgg ggcgcgcgca ctaccggagc 720
ttcttcgagg gcaacgactc cataatgcgg ctcaactact acccgccgtg ccagcgcccg 780
tacgagacgc tgggcacggg cccgcattgc gaccccacct ccctcaccat cctccaccag 840
gacgacgtcg gcggcctcca ggtcttcacc gacggccgct ggcgctccat ccgcccccac 900
gccggcgcct tcgtcgtcaa cattggcgac accttcatgg cgctctccaa cggccgctac 960
aagagcggcc tgcaccgcgc cgtcgtcaac agccgggtgc cgcgcaagtc gctcgccttc 1020
ttcctctgcc cggagatgga caaggtggtg cgccctccgg ggacactcgt cgacgccgac 1080
aacccccgcg cgtacccgga cttcacatgg cggacgctgc tcgacttcac gcagaaggac 1140
tacagggccg acatgaggac gctcgaggcc ttctcaagct gggtccaagc ccaggcccaa 1200
ccagctgagc cctccagggc tcctagctag 1230
<210> 2
<211> 369
<212> PRT
<213> 毛竹(Phyllostachys edulis)
<400> 2
Met Val Gln Asn Pro Gln Val Val Phe Asp Ala Ala Val Leu Ser Gly
1 5 10 15
Gln Ala Asp Ile Pro Ser Gln Phe Ile Trp Pro Ala Asp Glu Ser Pro
20 25 30
Thr Pro Asp Ala Ala Glu Glu Leu Pro Val Pro Leu Ile Asp Ile Gly
35 40 45
Gly Leu Leu Ser Gly Asp Arg Ala Ala Ala Ala Glu Val Thr Arg Leu
50 55 60
Val Gly Glu Ala Cys Glu Arg His Gly Phe Phe Gln Val Val Asn His
65 70 75 80
Gly Ile Asp Ala Glu Leu Leu Ala Glu Ala His Arg Cys Val Asp Ala
85 90 95
Phe Phe Thr Leu Pro Leu Ala Glu Lys Gln Arg Ala Leu Arg Arg Pro
100 105 110
Gly Glu Ser Cys Gly Tyr Ala Ser Ser Phe Thr Gly Arg Phe Ala Ser
115 120 125
Lys Leu Pro Trp Lys Glu Thr Leu Ser Phe Pro Tyr Ser Ala Cys Ala
130 135 140
Ser Ser Pro Asp Leu Val Val Asp Asn Phe Val Gln Lys Leu Gly Glu
145 150 155 160
Glu Tyr Arg Arg Leu Gly Glu Val Tyr Ala Arg Tyr Cys Gly Glu Met
165 170 175
Ser Arg Leu Ser Leu Glu Ile Met Glu Val Leu Gly Glu Ser Leu Gly
180 185 190
Val Gly Arg Ala His Tyr Arg Ser Phe Phe Glu Gly Asn Asp Ser Ile
195 200 205
Met Arg Leu Asn Tyr Tyr Pro Pro Cys Gln Arg Pro Tyr Glu Thr Leu
210 215 220
Gly Thr Gly Pro His Cys Asp Pro Thr Ser Leu Thr Ile Leu His Gln
225 230 235 240
Asp Asp Val Gly Gly Leu Gln Val Phe Thr Asp Gly Arg Trp Arg Ser
245 250 255
Ile Arg Pro His Ala Gly Ala Phe Val Val Asn Ile Gly Asp Thr Phe
260 265 270
Met Ala Leu Ser Asn Gly Arg Tyr Lys Ser Gly Leu His Arg Ala Val
275 280 285
Val Asn Ser Arg Val Pro Arg Lys Ser Leu Ala Phe Phe Leu Cys Pro
290 295 300
Glu Met Asp Lys Val Val Arg Pro Pro Gly Thr Leu Val Asp Ala Asp
305 310 315 320
Asn Pro Arg Ala Tyr Pro Asp Phe Thr Trp Arg Thr Leu Leu Asp Phe
325 330 335
Thr Gln Lys Asp Tyr Arg Ala Asp Met Arg Thr Leu Glu Ala Phe Ser
340 345 350
Ser Trp Val Gln Ala Gln Ala Gln Pro Ala Glu Pro Ser Arg Ala Pro
355 360 365
Ser
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> primer(引物)
<400> 3
atggtgcaga acccacaggt ggtct 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> primer(引物)
<400> 4
ctagctagga gccctggagg gctca 25