具体实施方式

本发明提供了一种茶树干旱响应基因CsNAC168，所述CsNAC168的核苷酸序列如SEQ ID NO:1(GAAAAAAATTGAAAAATTTCTTAGTTTTGATAATTATACACTGAAATCATTCTCTATTTTGAAATTGAGAATATTCTCAGTTTTGGTGTTGATCTAGTTTAACAGCAATGCTATTATATATACACTTGTTTAGGTTAAAGGGCAAAACGTCTTTTTACCTGTAAATGGGACTTGTTGGTTAAAAAACTTTTTGACAGGACCTAAACTACTACTAAATATGTAGCTAGGACTTTTAGGTAATTAATCCTAATAAATATAAAAAAACACTCATCATCCTCCCATGGTTTTACCTTTCTTTACAACAATTTTTTTTTTTAATTTCAAAAATATCTTTTTAATATTTTTTTTGTTAAATTAATTTATATTTTAAGAAAAATTTATTTCGAATTAAATCAAATAGATCAATGTTTGAATAAGAAAGCAAAAGAATTTACTTCAAAGCGGTTGATACATGAATTTTTCAAGATTCTTGTCATACCAAATGTAAAATTGAGAAGAGTTAAAACATAACAAACAGTCAAGAATGTAAGAATTTGCTTGATTCAGTTTACGGTCATGCATGAAGAATGACGAAGAAATTTCACCATAAATATAGATATTACAATGAGCCGGCTCTCACTCTCAACAACCCTTTTATAGAATCTCATAAAATCATCATAACCTAAAACCTTGAAACAATCCAACATATGCACGAATTTGAAACTAATAAAATCATATTAAAATAGATCCAAATATAAATAACCGATCATACGCCAATGGATAATAAGCATAATCCAAGCTGAATTCGAAACACAACAACAATCAGTGGGCTTCAGTGAGCCATTTCAAATTGGATATCAAACAATCATTCGATTGCTTTGAGAATGGTGAATTGACAATTTCATCAGTTGATTTCAATTCAATTTTTAAAATTGTTTTCAATTGGACTAAATTGACGTAATGTGCCAAATTTAAATATATATTGATACAATTAAAACTACAATAGCCATATTGAACCAACTAAGCTAGTTCAGTCCTTCAGCATCGGGTTAGCTACTCATGTATTCTCCTAACTAAATGTCAGGGAGTCAATCATTATCAAAGGCAAGATTGATTATTTCTCCCCCTATTGAGGCTTTGTTGTATTGGATTTATTTCCTCTCATTATGGACTTGTTCTTATGTTGGTGGTTAATATTGAGCTGTTGGGTTAGTTTAGTAGTTGGACTATGATTTTCCATTTGATGTAATTCTCTTCTTATACTTATAAATTTCTTACCAATTGGCAAATAATAAAATAACAAAAACAAAAACAAAAACCAAATTGACATAAAACTATAGGGCCTAATTTGCCATTTGATTATGTGGATATAATATTCATAAAAATATTGAGCAAATCAAACACAAAAGGTCATGTTGGAATATCATGGCCTGTTGTACCAAATATTATATAGAAAGTGATGGGTGGTCTCTCCAACACACAACAAAAATTTCTCAACCCATTGCTTGTTAGCCTTTATAAAAAGAGACACCATGGTTTTCAGGATCACTAAGACAATAGCTTATCCCACAACTTGGGAAACAGAGTCTCAAAATTCCTTGAGTAATTGTCCAATCAGAGGTCAGATTAGAATGTGTAGTCCACATCTCCCACCAGGCTTTAGATTTCATCCCACTGACGAAGAGCTCATCGTCTATTATCTGAAGAAAAAGGTCTCATCACCTACTAGTCCTCTGTTCTCTATCATAGCTGATATTGATCTCTACAAGTTCAATCCATGGGAGCTTCCTGGTATTTTCAATTTCTTTATCATCTCTTTTCATATGTGGTGATGCATATGTTGGTTGGTGTTGTTTGTGCTTGTATTTGCAAGAGAAAGATGCAAATAATAATGGGTTCTTGTCTTTTGAGGCTCGGGAGGATCCTCTGTTTTGAAATCTCCTTATCTTTCTGTTTTAAATTGCTCTTAAATTATAAGGTAAACCAAACTCGTAATCTTTGTAGTATGCATCTTGTGTCGATTTGATCTTTGTAATTCGACTCTATATCAAATTTTCTCTTGAATTTTTCACATTGTGTCAACTTTATTCAATTGATAGCACGCCGTTTAAAAATTGAACCGATATCAAGGGATAAAACAGTCAATTCACTATCTTCAAAGTGATTGGCAGGTTGGCGTACAATTTTTTTTTAAAAACAATTATTTTCTTTTGAAGCGAGAAATTTGGGAACAGAGTTTCTTAACTGATCAGTTGAACATCTATTTAAACATTTTTTTTTTCCATTCAATTTGCTTATAATAGTTGTCTGAATTTCTACAGGCAAGGCTCTGTTTGGCAGTAACGAGTGGTTTTTCTTCACACCGAGAGATAGGAAGTATCCAAACGGAGCTCGTCCAAACAGGACAGCTGGAGCTGGGTACTGGAAAGCAACTGGTACTGACAAACCGATCCTAAACTCGGGTGGGTTGCAGTGTATTGGTGTGAAAAAGGCTCTGGTCTTCTATCAAGGCCGTCCTCCAAAGGGCGTGAAGACTGATTGGGTGATGCATGAGTACAGACTTCTCGAAGATTCCCATTCGCTCCCGAGACTCAGGGGATCGATGCGGGTAAGCCACCATTGACAAAAGCTTCTGCTCTTTTTTCTGTTTCTGCAATCATAAGTGCTTTAGCTTTTGAATCCACTCTGTTTTCATCTCCCCTGTTTTTCATTACTTCTATGTCATATTTCAAAATATGATTGGTTCGTTGCGTGATAGAAAGGTGATTTGAAACAGAGGATAAGAATCGCGTGTGAATGGTCAATTCAAAAGAGAATGAATCATTTTGAGTTGACTTTTTTGACGTTAACCACTCGAATGGACTATTTTATTTCATTTTACTCTATTTTGTTTAAATTGATACAATATAAAAAATTCAATAGTAAACTTGAAGCAATTAAAACTAAAATAACTAAATTGATATAAGAGGCAAATTCAATGGACACGAATGCAATTTGCCCCAAAAAAACATAAAGTATCTAATTGGATTTGCAGTGTGCTTTTAAACTCGGTCACAATAATGAGTTTGATCTACACATTTAAAAATATTTTTCTGAGTACGTAGCATTGTTGCCAATCATGTTAGTTTTTAGTACAACTATGAAAACACTTAACAAATCTAGTTAAGATTTTCAATTTTAATCACAAATTGTTCTTTCTTGTGAGATGCTCTATTTTAGACTTGTAGTAATTAACAGTTTCTCCATTGTATTTTTCAGTTGGATGATTGGGTACTATGCCGAGTACGCCAAAAAAACAACATCCCACAACAAATCCCAGAATTCTCAGAAGAAAGCAGTTTCAATTCCATCCCTGGACTCAATTTCCCATTCTTGAATGATCCACATAACAAAAACACAATACACTCAATAGACTCTGGCAACGAAATCAAAACTCATCTCCAATCGCCCAAAGCGAGAACAGGACTAAATGATCAAGAACAAGAACAAGCACAAGCACAATGGTACTTAAACTTTCAAGGAGGACCATCCATGTCTTCAAGCACAGATGGAAGTTCTCAGTACGCAAATGAAGAATCGGTTTCGCCAATCAAAGATGTTTTCAAATCCCTCAAAAGATCGATCTCTGTCGTGTCTTTTGGCGAAGAATTTCCATTCTCACCAAGTAATAACAAGAGGCTGCACGCAGTACCAACTGATAGCATGGAGGATTCAAGCATTTTCCAAATCTGTTATCTTGCTAACTGTGTATGAATGAAATGAAAGCATTCTAAGTGTTCTTGAAAATGCGCGATGACGCTTTAAAACAACTTTATGATGGTGTTAGATATTTGCCCTGTGTTTTTCATTTATTTTCTTGTCTATTAGTTCTTTCTGTTCCTAGAAAGAGATTAAGAGGAACTGAGATTTGTAGAAAGGAAAATAGATGTAGTTAGATATATTACTGTGAGAT)所示，基因结构图见图1。所述基因的编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示(ATGGTTTTCAGGATCACTAAGACAATAGCTTATCCCACAACTTGGGAAACAGAGTCTCAAAATTCCTTGAGTAATTGTCCAATCAGAGGTCAGATTAGAATGTGTAGTCCACATCTCCCACCAGGCTTTAGATTTCATCCCACTGACGAAGAGCTCATCGTCTATTATCTGAAGAAAAAGGTCTCATCACCTACTAGTCCTCTGTTCTCTATCATAGCTGATATTGATCTCTACAAGTTCAATCCATGGGAGCTTCCTGGCAAGGCTCTGTTTGGCAGTAACGAGTGGTTTTTCTTCACACCGAGAGATAGGAAGTATCCAAACGGAGCTCGTCCAAACAGGACAGCTGGAGCTGGGTACTGGAAAGCAACTGGTACTGACAAACCGATCCTAAACTCGGGTGGGTTGCAGTGTATTGGTGTGAAAAAGGCTCTGGTCTTCTATCAAGGCCGTCCTCCAAAGGGCGTGAAGACTGATTGGGTGATGCATGAGTACAGACTTCTCGAAGATTCCCATTCGCTCCCGAGACTCAGGGGATCGATGCGGTTGGATGATTGGGTACTATGCCGAGTACGCCAAAAAAACAACATCCCACAACAAATCCCAGAATTCTCAGAAGAAAGCAGTTTCAATTCCATCCCTGGACTCAATTTCCCATTCTTGAATGATCCACATAACAAAAACACAATACACTCAATAGACTCTGGCAACGAAATCAAAACTCATCTCCAATCGCCCAAAGCGAGAACAGGACTAAATGATCAAGAACAAGAACAAGCACAAGCACAATGGTACTTAAACTTTCAAGGAGGACCATCCATGTCTTCAAGCACAGATGGAAGTTCTCAGTACGCAAATGAAGAATCGGTTTCGCCAATCAAAGATGTTTTCAAATCCCTCAAAAGATCGATCTCTGTCGTGTCTTTTGGCGAAGAATTTCCATTCTCACCAAGTAATAACAAGAGGCTGCACGCAGTACCAACTGATAGCATGGAGGATTCAAGCATTTTCCAAATCTGTTATCTTGCTAACTGTGTATGA)所示。所述基因还包括在SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生物。本发明将所述SEQ ID NO：3与其他已知的NAC基因构建系统进化树，结果见图2，茶树NAC转录因子CsNAC168蛋白编码序列与小麦NAC转录因子TaNAC2/TaNAC29、大豆NAC转录因子GMNAC11及水稻NAC转录因子OsNAC10聚为一枝。其结果说明茶树NAC转录因子CsNAC168可能具备同其他NAC转录因子相似的功能。

本发明提供了所述茶树干旱响应基因CsNAC168编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示：(MVFRITKTIAYPTTWETESQNSLSNCPIRGQIRMCSPHLPPGFRFHPTDEELIVYYLKKKVSSPTSPLFSIIADIDLYKFNPWELPGKALFGSNEWFFFTPRDRKYPNGARPNRTAGAGYWKATGTDKPILNSGGLQCIGVKKALVFYQGRPPKGVKTDWVMHEYRLLEDSHSLPRLRGSMRLDDWVLCRVRQKNNIPQQIPEFSEESSFNSIPGLNFPFLNDPHNKNTIHSIDSGNEIKTHLQSPKARTGLNDQEQEQAQAQWYLNFQGGPSMSSSTDGSSQYANEESVSPIKDVFKSLKRSISVVSFGEEFPFSPSNNKRLHAVPTDSMEDSSIFQICYLANCV)。

本发明提供了一种植物过表达载体，包括所述茶树干旱响应基因CsNAC168。所述植物过表达载体优选还包括35S启动子。本发明对所述植物过表达载体的构建方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的植物过表达载体的构建方法即可。在本发明实施例中，所述植物过表达载体的核苷酸序列由南京金斯瑞生物科技公司合成并进行亚克隆，植物过表达载体的结构见图3。

本发明提供了一种耐干旱和/或耐盐性的植物细胞，包括所述茶树干旱响应基因CsNAC168、所述蛋白或所述植物过表达载体。本发明对所述植物细胞的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的植物细胞即可。为了举例说明本发明提供的茶树干旱响应基因CsNAC168的功能，本发明实施例中以植物模式生物拟南芥和茶树细胞为代表进行检测，但这不能理解为对本发明保护范围的限制。本发明对所述植物细胞的构建方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的植物细胞的构建方法即可，例如将植物过表达载体在植物农杆菌介导下导入植物细胞中。

本发明提供了所述茶树干旱响应基因CsNAC168、所述蛋白、所述植物过表达载体或所述植物细胞在抗干旱和/或抗盐渍化的转基因植物中的应用。

本发明对所述转基因植物的构建方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的转基因植物的构建方法即可，例如将含CsNAC168的植物过表达载体在农杆菌介导下转入植物中，经筛选得到转基因植物。转基因植株在渗透胁迫和盐胁迫处理下能保持更高的细胞膜结构完整性，其体内MDA和活性氧含量比非转基因的野生型植株更低，叶片叶绿素含量、脯氨酸含量、SOD和POD酶活性相比非转基因的野生型植株更高。综合各项生理检测指标结果表明，过表达CsNAC168的转基因植株具有更强的盐胁迫耐受力和抗干旱能力。

基于CsNAC168在植物细胞中过表达能有效提高植株的耐盐性和耐旱性，本发明提供了所述茶树干旱响应基因CsNAC168、所述蛋白、所述植物过表达载体或所述植物细胞在植物抗干旱和/或抗盐渍化中的应用。

在本发明中，所述茶树干旱响应基因CsNAC168、所述蛋白、所述植物过表达载体或所述植物细胞优选联合提高转基因植株体内脯氨酸含量和抗氧化酶的活性的试剂在植物抗干旱和/或抗盐渍化中的应用。

在本发明中，所述盐渍化的盐浓度优选不高于130mmol/L，更优选为20～100mmol/L，进一步优选为50～80mmol/L。

下面结合实施例对本发明提供的一种茶树干旱响应基因CsNAC168及其编码蛋白和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

根特异表达基因的筛选

一、拟南芥种植

(1)土壤播种

将泥炭基质高压灭菌以防止土壤霉菌和板结。用牙签沾水将春化后的拟南芥种子单粒均匀点播在湿润基质中，覆盖塑料薄膜。将基质转入光照培养箱内，设置周期(光照16h，23℃；黑暗8h，18℃)，湿度为65％。种子出芽后移除塑料薄膜，保持土壤湿润。

(2)培养皿播种

取适量拟南芥种子放入已灭菌的1.5mlEP管中。在超净工作台上，先加入70％酒精处理2min，用移液枪移除酒精，加入20％次氯酸钠消毒30min。期间，不断震荡管子，使溶液充分与种子接触。吸出次氯酸钠消毒液，用无菌水清洗3至5次。吸出种子置于无菌滤纸上。等种子晾干之后，用灭菌牙签将种子点播在1/2MS(murashigeandskoog)固体培养基表面。将培养皿4℃黑暗处理2至3天后置于光照培养箱中(恒温23℃、光照16h、黑暗8h)。

在消毒过程中，拟南芥种子会粘附在管壁上，影响消毒效果，妨碍移除上清液。用手指不断弹动震荡管壁，可使种子脱离管壁，沉降在管底。

二、过表达载体构建

由南京金斯瑞生物科技公司进行茶树CsNAC168基因CDS序列合成并进行亚克隆，构建到含有35S启动子的pCAMBIA1300的过表达载体上(见图3)。获得测序报告后进行双酶切验证载体准确性。反应体系见表1。

表1双酶切验证载体反应体系

在200μlEP管中加样混匀，37℃孵育3小时，之后进行凝胶电泳检测。

结果见图4，其中M：DL15000DNAMarker；Vector：过表达载体。经过XbaⅠ和BamhⅠ双酶切后，CsNAC168过表达载体质粒被分割为一大一小两条带状，其中小的条带大小为1000bp左右，与目标序列大小一致，证明CsNAC168过表达载体构建成功。

三、农杆菌转化

取农杆菌感受态细胞，置于冰上融化，加入1～2μl质粒，指头轻微弹动混匀。

将电击杯放入冰箱提前预冷半小时，取出后置于冰上。电击前，用纸将电击杯底部及外侧擦干。设置电击参数为:电压:2.4kV；电容：25μF；电阻：200Ω。

在超净工作台内进行电击。按住电击按钮，待听到“滴”的一声后，松开按钮，电击为时间5ms左右(若电击时间相差太大，可进行二次电击)。

电击结束后，向电击杯内加入约600μl液体无抗YEP液体培养基。用电击杯自带吸管将电击杯内的液体转移到1.5ml无菌EP管内，于28℃摇床内180rpm复苏培养3小时。

在4000rpm下离心2min，收集菌体，弃上清。留下约100μl体积悬浮菌体。

涂布在含卡那霉素和链霉素的YEP培养基上，28℃倒置培养48小时。

挑取单菌落到5mL含卡那霉素和链霉素的YEP液体培养基中，28℃、180rpm摇床过夜培养。

取800μl菌液，加入200μl甘油，-80℃冰箱保菌。剩余菌液提取质粒，酶切再次验证转化成功与否。

四、拟南芥花序浸染

取验证后甘油保菌的菌液100μl转接到5mL新鲜的含卡那霉素和链霉素的YEP液体培养基中，28℃/200rpm摇床过夜培养。第二天吸取2mL菌液转接到50至60mL新鲜的含卡那霉素和链霉素的YEP液体培养基中，再次28℃摇床培养过夜

取50mL菌液于50ml离心管中，4000rpm离心10分钟，去上清。用50mL5％(w/v)蔗糖溶液(现配现用)，悬浮菌体，加入75μl0.15％AS，上下轻轻颠倒混匀，静置两小时。

取10μl(0.02％)silwet-77加入到悬浮静置的蔗糖菌液中，轻轻颠倒混匀。

花序浸染法转化拟南芥。将拟南芥花序浸入农杆菌蔗糖悬浮液中，浸泡5-10秒。将浸染完成的拟南芥植株遮光处理24小时，之后光下正常培养。隔一周左右，待新的花序长出后再次浸染，重复浸染4至5次。

拟南芥土壤栽培四周左右，主茎开始抽薹。减去第一次抽薹的主茎，拟南芥莲座会分生更多侧枝。为提高转化效率，在侵染前一天，用水浇透待的拟南芥，剪去角果与全开放花序，只保留露白的花序。

五、转基因植株鉴定

潮霉素抗性筛选。收集浸染后的拟南芥成熟种子(T0代)，室温或37℃干燥果荚。进行表面消毒后，将种子播种于在含有潮霉素(30mg/L)的1/2MS培养基上。将培养皿放于4℃春化两天，转入光照培养箱。将潮霉素抗性成功存活下来的幼苗转移到灭菌后的泥炭基质中培养，覆盖薄膜，保持湿润。两天后移去薄膜。

潮霉素编码基因PCR鉴定

TPS法提取植物DNA

i.幼苗长大后取0.1g幼嫩叶片放入2ml管子中；

ii.加入液氮冷冻，进行充分研磨；

iii.研磨结束后加入加入400～500μlTPS溶液，70℃水浴30mins；

iv.12000rpm离心10mins，取上清至新的1.5ml管子中；

v.加入等体积异丙醇(预冷)，颠倒混匀；

vi.12000rpm离心5mins，去上清(核酸沉淀在底部，或可见白色斑块)；

vii.加入500μl70％酒精，颠倒后静置2mins；

viii.12000rpm离心5mins，去酒精，干燥；

ix.加40μlddH₂O，混合均匀，离心收集。

表2 100mlTPS溶液配方

PCR扩增鉴定

i.PCR扩增体系见表3

表3 PCR扩增体系

其中HPT-F:AGAAGAAGATGTTGGCGACCT(SEQ ID NO:4)；

HPT-R:CTCCTGCGGGTAAATAGCTG(SEQ ID NO:5)。

ii.按照表4反应条件进行PCR扩增。

表4 PCR扩增的反应条件

结果见图5，其中图5A为1/2MS培养基潮霉素筛选；图5B为转基因拟南芥植株PCR阳性鉴定结果。图中M为DNAmarker，WT(wildtype,野生型)作为对照，L1-L5分别表示5个转基因株系，即株系1、株系2、株系3、株系4、株系5。

PCR鉴定为阳性的植株定为T1代，分株收集T1种子，将收取的T1代转基因拟南芥种子点播于含有潮霉素(30mg/L)的1/2MS培养基上进行抗性筛选。将能够在抗性培养基上正常萌发的T1植株移栽到土壤中，分株收集其种子，为T2代转基因种子。再次将T2代转基因拟南芥种子点播于含有潮霉素(30mg/L)的1/2MS培养基上继续进行抗性筛选。此时，一些株系的部分种子无法在抗性培养基上萌发，约为1/3。T2代种子全部表现出潮霉素抗性的植株为纯合株系，收集纯合T2代株系植株种子为T3代。

实施例2

抗旱耐盐评价：

一、干旱失水与复水

将T3代转基因拟南芥种子点播于土壤中生长两周左右，开始缺水处理。停止浇水后，植株依然放在培养箱中进行光照培养。在植株叶片出现明显枯萎表型时(两周左右)进行复水。

结果见图6。图6是拟南芥野生型及转基因植株干旱复水实验；图6A为拟南芥野生型及转基因植株干旱复水处理。取两周大小的拟南芥野生型和转基因植株各4盆，每盆6颗进行缺水干旱处理，在干旱16天后进行复水，观察统计植株存活率。WT：拟南芥野生型；L1、L2：拟南芥CsNAC168基因过表达株系；D0：缺水第0天；D16：缺水第16天；R5：复水后第5天；图6B为拟南芥野生型及转基因植株干旱复水后存活率统计。n＝3，**表示差异极显著(p<0.01)。对干旱复水后各株系植株存活率进行统计显示，野生型拟南芥株系WT和转基因株系L1、L2其存活率分别为：9.72％、95.83％、91.66％，转基因株系植株复水后存活率显著高于野生型植株。实验结果表明，过表达茶树CsNAC168基因提高了拟南芥对缺水干旱的抵抗能力，表现为缺水环境下更高的存活率和耐旱性。

二、叶片失水率检测

分别从五株四周大小的拟南芥植株上剪取长势相同。大小相对一致的健康叶片置于培养皿中，立刻称重(W1)，之后置于室内实验台上，分别在1h、2h、4h、6h和8h称重(W2)。每个时间点的失水率按照公式I计算。每个实验进行3次生物学重复。

失水率(％)＝(W1–W2)/W1*100％ 公式I

结果见图7。图7是离体叶片失水率分析；n＝3，*表示差异显著(p<0.05)，**表示差异极显著(p<0.01)。分别测定了拟南芥野生型植株和CsNAC168过表达转基因植株离体叶片在1h、2h、4h、6h和8h的失水情况。WT失水率为13.43％、16.18％、25.42％、33.77％、37.44％，转基因株系L1和L2失水率分别为8.91％、10.25％、14.97％、22.16％、25.37％和9.43％、12.44％、14.80％、23.90％、24.40％。可见，相对于野生型，转基因植株表现出更低的叶片失水率。说明过表达CsNAC168基因提高了拟南芥叶片水分保持的能力，减缓了植株水分散失。

三、种子萌发及根长测定

将拟南芥T3代两个株系纯合种子与野生型种子进行表面消毒后，用牙签分别点播于含有不同浓度NaCl、ABA和甘露醇的1/2MS培养基上，4℃春化两天，转入光照培养箱。7至10天左右统计种子萌发率。

种子于1/2MS培养基上萌发后，待根长为一厘米左右时，转入含有不同浓度NaCl、ABA和甘露醇的1/2MS培养基上，垂直培养7至10天左右观测根长。

图8是氯化钠处理对种子萌发的影响；图8A为拟南芥野生型及转基因植株种子在不同浓度氯化钠处理下的萌发情况；图8B为种子萌发率统计分析。1/2MS培养基中氯化钠浓度分别为0mM、50mM、100mM、150mM、200mM，点播后一周左右，连续两天没有新种子萌发开始统计种子萌发率，每皿培养基中每个株系种子总数为36。WT：拟南芥野生型；L1、L2：拟南芥CsNAC168基因过表达株系。n＝3，**表示差异极显著(p<0.01)；将野生型拟南芥种子和CsNAC168转基因拟南芥种子点播到含不同浓度(0mmol/L、50mmol/L、100mmol/L、150mmol/L、200mmol/L)NaCl的1/2MS(murashigeandskoog)培养基上，观察种子萌发情况，一周左右连续两天没有新的种子萌发时统计种子萌发率，三周左右时统计各株系根发育情况。如图所示，随着盐浓度升高，野生型植株种子萌发率逐渐低于转基因植株，其萌发率依次为：100.00％、66.67％、8.33％、0.00％、0.00％，转基因株系L1、L2种子萌发率依次为：100.00％、69.44％、52.78％、19.44％、5.56％和97.22％、72.22％、61.11％、16.67％、16.67％。在低浓度盐处理下(50mmol/L)，野生型拟南芥种子萌发率与转基因拟南芥种子萌发率无显著差异，当盐处理浓度提高到100mmol/L及以上时，野生型拟南芥种子萌发率急剧下降，而转基因拟南芥种子依旧维持较高的萌发率。结果说明野生型拟南芥种子对低浓度盐胁迫具有一定的耐受性，而过表达CsNAC168基因极大提高了拟南芥种子对盐胁迫的耐受性。

图9是氯化钠处理对根发育的影响；图9A为拟南芥野生型及转基因植株在不同浓度氯化钠处理下的根系发育情况，图9B为根长统计分析。1/2MS培养基中氯化钠浓度分别为0mM、50mM、100mM点播后三周左右开始统计植株根长。WT：拟南芥野生型；L1、L2：拟南芥CsNAC168基因过表达株系。n＝3，**表示差异极显著(p<0.01)。对盐胁迫培养条件下个株系的根长观测显示，在0mM氯化钠和50mM氯化钠条件下，各株系植株根长无显著变化，而在100mM氯化钠条件下时，野生型植株表现出明显的子叶变黄，根伸长发育受阻现象，而转基因株系的根伸长情况明显优于野生型。根长测定显示，各个株系植株在不同盐胁迫条件下的根长为：WT(6.67cm、6.03cm、0.06cm)，L1、L2株系分别为(7.34cm、5.39cm、1.46cm和6.90cm、5.09cm、1.14cm)。对盐胁迫条件下植株根系发育状况的观测结果表明，当盐处理浓度高达100mM时，野生型拟南芥无法进行根本伸长发育，而转基因植株尽管受抑制严重，但子叶和根系仍能生长。

图10是甘露醇处理对种子萌发的影响；图10A为拟南芥野生型及转基因植株种子在不同浓度甘露醇处理下的萌发情况，图10B为种子萌发率统计分析。1/2MS培养基中甘露醇浓度分别为0mM、100mM、150Mm、200mM、250mM，点播后一周左右，连续两天没有新种子萌发开始统计种子萌发率，每皿培养基中每个株系种子总数为36。WT：拟南芥野生型；L1、L2：拟南芥CsNAC168基因过表达株系。n＝3，**表示差异极显著(p<0.01)。用甘露醇模拟植物遭受的渗透胁迫，观察不同浓度甘露醇(0mmol/L、100mmol/L、150mmol/L、200mmol/L、250mmol/L)处理下野生型拟南芥种子和CsNAC168转基因拟南芥种子的萌发状况。结果显示，不同甘露醇处理下各株系种子萌发率为：WT(100.00％、94.44％、91.67％、80.56％、41.67％)，转基因株系L1、L2种子萌发率依次为：100.00％、88.89％、91.67％、94.44％、83.33％和100.00％、94.44％、88.89％、91.67％、77.78％。随着甘露醇处理浓度升高，野生型拟南芥种子萌发率逐渐下降，而转基因拟南芥种子在高浓度甘露醇处理下依旧维持较高的种子萌发率。结果说明，过表达CsNAC168基因一定程度上提高了拟南芥种子抗渗透胁迫的能力。

图11是不同浓度甘露醇处理对各株系拟南芥根系发育的影响；图11A为拟南芥野生型及转基因植株在不同浓度甘露醇处理下的根系发育情况，图11B为根长统计分析，图11C为侧根数目。1/2MS培养基中氯化钠浓度分别为0mM、150mM、200mM点播后三周左右开始统计植株根长。WT：拟南芥野生型；L1、L2：拟南芥CsNAC168基因过表达株系。n＝3，**表示差异极显著(p<0.01)；对不同浓度甘露醇处理条件下个株系的根长观测显示，在低浓度处理条件下，各株系植株根长无显著变化，而在150mM甘露醇处理条件下，野生型植株和转基因植均表现出根伸长发育受阻现象，转基因株系的根伸长情况短于野生型，而侧根数目明显多于野生型。当甘露醇处理浓度达到200mM时，各个株系植株根伸长发育受阻现象更加严重，此时转基因植株根长和侧根数目均明显高于野生型植株。其根长依次为：WT(6.30cm、2.54cm、2.32)，L1、L2株系分别为(7.41cm、1.68cm、3.10cm和6.27cm、0.95cm、6.68cm)。结果表明过表达CsNAC168基因可能通过刺激植株侧根发育，增强植株根系吸水能力，以提高植株对干旱缺水环境的耐受性。

图12是ABA处理对种子萌发的影响；图12A为拟南芥野生型及转基因植株种子在不同浓度ABA处理下的萌发情况，图12B为种子萌发率统计分析。1/2MS培养基中ABA浓度分别为0μM、0.5μM、1.0μM、1.5μM，点播后一周左右，连续两天没有新种子萌发开始统计种子萌发率，每皿培养基中每个株系种子总数为36。WT：拟南芥野生型；L1、L2：拟南芥CsNAC168基因过表达株系。n＝3，**表示差异极显著(p<0.01)。观察不同浓度ABA(0μmol/L、0.5μmol/L、1.0μmol/L)处理条件下野生型和CsNAC168转基因拟南芥种子的萌发情况，结果显示，各株系种子萌发率依次为：WT(91.67％、86.11％、63.89％、66.67％)，转基因株系L1、L2种子萌发率分别为：91.67％、41.67％、33.33％、13.89％和86.11％、30.56％、44.44％、27.78％。随着ABA处理浓度升高，转基因拟南芥种子萌发率较野生型更低。说明过表达CsNAC168基因提高了拟南芥种子对ABA的敏感性。

图13是ABA处理对根发育的影响；图13A为根长统计分析，图13B为拟南芥野生型及转基因植株在不同浓度ABA处理下的根系发育情况；1/2MS培养基中氯化钠浓度分别为0μM、0.5μM、1.0μM，点播后三周左右开始统计植株根长。WT：拟南芥野生型；L1、L2：拟南芥CsNAC168基因过表达株系。n＝3，**表示差异极显著(p<0.01)；对不同浓度ABA处理条件下个株系的根长观测显示，随着ABA处理浓度升高，各株系植株根长逐渐变短，其根长依次为：WT(6.27cm、4.75cm、3.39cm)，L1、L2株系分别为6.90cm、2.81cm、1.60cm和6.53cm、2.38cm、1.78cm。相对于野生型而言，转基因植株根长更短，根伸长发育受阻更严重。表明过表达CsNAC168基因提高植株对ABA的敏感性。

四、气孔观察

取拟南芥长势相同，大小相似的健康叶片，下表皮朝下放入含有不同浓度ABA(0μM、0.5μM、1.0μM、1.5μM)的气孔缓冲液中，光照培养箱中正常生长光照处理2小时。撕取叶片下表皮，制作临时装片，用显微镜观察气孔开合情况。

摘取叶片前保证植株处于光照条件下至少3小时作为预处理，以保证叶片气孔处于开放状态。

图14是ABA调控气孔的开合；图14A为拟南芥野生型及转基因植株在不同浓度ABA处理下气孔的开合，图14B为气孔开度统计分析。各株系植株提前进行3小时光照预处理，将叶片放入含不同浓度ABA(0μM、0.5μM、1.0μM、1.5μM)的气孔工作液中继续光照处理三小时后观察统计叶片气孔开合状况。WT：拟南芥野生型；L1、L2：拟南芥CsNAC168基因过表达株系。n＝3，**表示差异极显著(p<0.01)；对不同浓度ABA(0μM、0.5μM、1.0μM、1.5μM)诱导条件下不同株系拟南芥叶片的气孔开合情况进行观察发现，WT株系拟南芥叶片气孔开度(宽/长)为55.70％、21.59％、20.66％、14.14％，转基因株系L1、L2气孔开度分别为32.46％、9.54％、5.47％、5.17％和12.37％、7.90％、5.91％、8.51％。观察结果表明，相比于野生型拟南芥植株，转基因拟南芥植株受ABA诱导后气孔关闭更加彻底，叶片气孔开度更低，因此能够更大程度地降低水分损耗，维持植株对干旱环境的耐受性。

五、生理检测

叶片相对电导率(REC)测定参考陈爱葵等的试验方法；叶绿素含量测定参考张志良的方法进行；参考郝再彬等的描述方法测定脯氨酸含量；测定超氧化物歧化酶(SOD)活性测定参考Beauchamp等的试验方法；过氧化物酶(POD)活性测定和可溶性蛋白含量测定参考李合生等的试验方法；丙二醛含量测定参考董树刚等的试验方法。

结果见图15～图20。图15是不同胁迫条件下各株系拟南芥相对电导率；图15A为拟南芥野生型及转基因植株在不同浓度氯化钠处理下相对电导率，图15B为拟南芥野生型及转基因植株在不同浓度PEG处理下相对电导率。WT：拟南芥野生型；L1、L2：拟南芥CsNAC168基因过表达株系。n＝3，**表示差异极显著(p<0.01)；在不同浓度PEG处理下，各株系相对电导率为：WT(44.31％、45.72％、53.99％、65.98％)，L1、L2分别为41.50％、44.23％、46.07％、53.92％和39.34％、43.49％、48.12％、57.59％。在不同浓度氯化钠处理下，各株系相对电导率为：WT(43.58％、47.65％、50.22％、62.16％)，L1、L2分别为：41.97％、45.33％、50.50％、53.37％和42.37％、44.81％、49.73％、54.70％。观测结果表明，随着渗透胁迫和盐胁迫加剧，野生型植株和转基因植株相对电导率都呈现上升趋势，但过表达CsNAC168基因植株相对于野生型而言始终保持更低的相对电导率，说明其膜结构受胁迫损伤的程度更轻。

图16是不同胁迫条件下各株系拟南芥叶绿素总含量；图16A为拟南芥野生型及转基因植株在不同浓度氯化钠处理下叶绿素总含量，图16B为拟南芥野生型及转基因植株在不同浓度PEG处理下叶绿素总含量。WT：拟南芥野生型；L1、L2：拟南芥CsNAC168基因过表达株系。n＝3，**表示差异极显著(p<0.01)；不同浓度PEG处理下，各株系叶片叶绿素含量为：WT(2.38、1.74、1.41、1.02)，L1、L2分别为2.75、1.82、1.73、1.37和2.35、1.80、1.65、1.55。不同浓度氯化钠处理下，各株系叶片叶绿素含量为：WT(1.82、1.93、1.67、1.51)，L1、L2分别为1.88、2.25、2.17、1.91和1.84、1.98、1.96、1.88。测定结果表明，正常生长条件下，野生型和转基因拟南芥植株叶片叶绿素含量差异不明显，但随着渗透胁迫和盐胁迫加剧，野生型植株叶绿素含量相对于转基因植株更低，转基因植株受胁迫损伤的程度更小。

图17是不同胁迫条件下各株系拟南芥脯氨酸含量；图17A为拟南芥野生型及转基因植株在不同浓度氯化钠处理下脯氨酸含量，图17B为拟南芥野生型及转基因植株在不同浓度PEG处理下脯氨酸含量；WT：拟南芥野生型；L1、L2：拟南芥CsNAC168基因过表达株系；n＝3，**表示差表示差异极显著(p<0.01)；不同浓度PEG处理下，各株系叶片脯氨酸含量为：WT(2.00、2.69、4.80、36.55)，L1、L2分别为6.34、9.04、19.13、65.82和5.47、10.94、18.99、60.00。不同浓度氯化钠处理下，各株系叶片脯氨酸含量为：WT(2.17、2.86、4.22、3.65)，L1、L2分别为2.09、12.02、13.55、31.51和2.38、11.00、14.80、33.67。测定结果表明，正常生长条件及低浓度PEG和氯化钠处理下，野生型和转基因拟南芥植株叶片脯氨酸含量差异不明显，随着渗透胁迫和盐胁迫加剧，转基因拟南芥植株叶片脯氨酸含量持续增高，且远高于野生型拟南芥植株脯氨酸含量。结果说明过表达CsNAC168基因促进了植株脯氨酸的合成或积累。

图18是不同胁迫条件下各株系拟南芥丙二醛含量；

图18A为拟南芥野生型及转基因植株在不同浓度氯化钠处理下脯氨酸含量，图18B为拟南芥野生型及转基因植株在不同浓度PEG处理下脯氨酸含量；WT：拟南芥野生型；L1、L2：拟南芥CsNAC168基因过表达株系；n＝3，*表示差表示差异显著(p<0.05)，**表示差表示差异显著(p<0.01)；不同浓度PEG处理下，各株系叶片丙二醛含量为：WT(9.16、10.94、16.89、32.74)，L1、L2分别为7.44、11.40、15.97、29.52和6.90、9.68、15.33、26.45。不同浓度氯化钠处理下，各株系叶片丙二醛含量为：WT(11.47、16.42、22.17、30.90)，L1、L2分别为10.60、14.87、17.19、20.08和11.03、13.99、18.15、22.37。测定结果表明，随着PEG和氯化钠处理浓度升高，野生型和转基因拟南芥植株叶片丙二醛含量逐渐升高，在PEG处理浓度达到10％及以上，氯化钠处理浓度达到150mM及以上时，野生型拟南芥植株丙二醛含量高于转基因拟南芥植株。结果说明过表达CsNAC168基因减轻了植株在高盐胁迫和高渗胁迫下的膜脂过氧化程度，降低了植株在胁迫环境中的过氧化损伤。

图19是不同胁迫条件下各株系拟南芥SOD活性；图19A为拟南芥野生型及转基因植株在不同浓度氯化钠处理下SOD活性，图19B为拟南芥野生型及转基因植株在不同浓度PEG处理下SOD活性；WT：拟南芥野生型；L1、L2：拟南芥CsNAC168基因过表达株系；n＝3，**表示差异显著(p<0.01)；不同浓度PEG处理下，各株系叶片SOD酶活性为：WT(76.79、154.74、50.21、31.57)，L1、L2分别为90.10、145.68、247.79、259.2和94.79、154.56、265.98、273.58。不同浓度氯化钠处理下，各株系叶片SOD酶活性为：WT(100.93、129.51、50.27、28.84)，L1、L2分别为90.21、145.42、106.08、58.90和95.68、150.34、116.03、61.04。测定结果表明，随着PEG处理浓度升高，野生型植株叶片SOD酶活性呈现先升高后下降的趋势，在PEG处理浓度达为10％时达到最高154.74，转基因拟南芥植株叶片SOD酶活性随着PEG处理浓度升高而升高，且在20％及以上PEG处理浓度下显著高于野生型植株。

图20是不同胁迫条件下各株系拟南芥POD活性；图20A为拟南芥野生型及转基因植株在不同浓度氯化钠处理下SOD活性，图20B为拟南芥野生型及转基因植株在不同浓度PEG处理下SOD活性；WT：拟南芥野生型；L1、L2：拟南芥CsNAC168基因过表达株系；n＝3，**表示差异极显著(p<0.01)；不同浓度PEG处理下，各株系叶片POD酶活性为：WT(19.32、20.73、22.06、38.33)，L1、L2分别为18.96、32.63、33.37、59.95和19.01、31.06、35.80、58.99。不同浓度氯化钠处理下，各株系叶片POD酶活性为：WT(22.20、33.35、32.75、64.08)，L1、L2分别为21.86、46.55、67.68、158.25和19.97、47.14、69.91、163.57。测定结果表明，随着PEG和氯化钠处理浓度升高，野生型和转基因拟南芥植株叶片POD酶活性都呈现逐渐上升的趋势，且在相同浓度的PEG处理及氯化钠处理下，转基因拟南芥植株叶片POD酶活性都高于野生型拟南芥植株。结果说明过表达CsNAC168基因提高了植株在高盐胁迫和高渗胁迫下SOD和POD酶的活性，增强了植株对细胞内活性氧的清除能力。

六、NBT和DAB染色

(1)染色液配制

于50ml锥形瓶中，蒸馏水配制终浓度为1mg/ml的DAB染色液50ml。用HCl/NaOH调节pH至3.8，使其能够尽可能溶解。用锡箔纸包裹，避光保存(现配现用)。

用蒸馏水配制0.1mg/mlNBT染色液，不需要调pH，现配现用，避光保存。

(2)染色

取经过不同浓度NaCl和PEG6000处理过的拟南芥成熟叶片放入小培养皿中，加入染色液使浸没叶片。找一个最大的培养皿，里面放上三张浸润的滤纸，再把放材料的小培养皿放到大培养皿中，盖上大玻璃皿皿盖，用黑塑料包裹避光，100rpm，28℃恒温摇床中振荡孵育过夜。孵育结束后移除染色液，用95％酒精浸泡脱色两小时后拍照观察(DAB与内源性H₂O₂反应形成的红棕色斑点，NBT与内源性O₂-反应而形成的深蓝色化合物)。

结果见图21。图21是DAB和NBT染色；图21A为拟南芥野生型及转基因植株在10％浓度PEG和100mM浓度氯化钠和处理下过氧化氢含量检测，图21B为拟南芥野生型及转基因植株在10％浓度PEG和100mM浓度氯化钠处理下超氧化物含量检测。WT：拟南芥野生型；L1、L2：拟南芥CsNAC168基因过表达株系；对PEG模拟渗透胁迫处理及氯化钠模拟盐胁迫处理后的野生型和转基因拟南芥植株叶片进行染色观察。结果发现，相同浓度PEG处理后，转基因拟南芥植株叶片经DAB染色后生成的红褐色物质及经NBT染色后生成的蓝色物质均少于野生型植株。在相同浓度氯化钠处理后，在相同浓度氯化钠处理后，转基因拟南芥植株叶片经DAB和NBT染色后形成的色斑面积均小于野生型植株，且染色后的色斑颜色深度相对野生型植株更浅。观测结果表明，过表达CsNAC168基因减少了植株在高盐胁迫和高渗胁迫下细胞活性氧的累积。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 云南大学

<120> 一种茶树干旱响应基因CsNAC168及其编码蛋白和应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3931

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaaaaaaatt gaaaaatttc ttagttttga taattataca ctgaaatcat tctctatttt 60

gaaattgaga atattctcag ttttggtgtt gatctagttt aacagcaatg ctattatata 120

tacacttgtt taggttaaag ggcaaaacgt ctttttacct gtaaatggga cttgttggtt 180

aaaaaacttt ttgacaggac ctaaactact actaaatatg tagctaggac ttttaggtaa 240

ttaatcctaa taaatataaa aaaacactca tcatcctccc atggttttac ctttctttac 300

aacaattttt ttttttaatt tcaaaaatat ctttttaata ttttttttgt taaattaatt 360

tatattttaa gaaaaattta tttcgaatta aatcaaatag atcaatgttt gaataagaaa 420

gcaaaagaat ttacttcaaa gcggttgata catgaatttt tcaagattct tgtcatacca 480

aatgtaaaat tgagaagagt taaaacataa caaacagtca agaatgtaag aatttgcttg 540

attcagttta cggtcatgca tgaagaatga cgaagaaatt tcaccataaa tatagatatt 600

acaatgagcc ggctctcact ctcaacaacc cttttataga atctcataaa atcatcataa 660

cctaaaacct tgaaacaatc caacatatgc acgaatttga aactaataaa atcatattaa 720

aatagatcca aatataaata accgatcata cgccaatgga taataagcat aatccaagct 780

gaattcgaaa cacaacaaca atcagtgggc ttcagtgagc catttcaaat tggatatcaa 840

acaatcattc gattgctttg agaatggtga attgacaatt tcatcagttg atttcaattc 900

aatttttaaa attgttttca attggactaa attgacgtaa tgtgccaaat ttaaatatat 960

attgatacaa ttaaaactac aatagccata ttgaaccaac taagctagtt cagtccttca 1020

gcatcgggtt agctactcat gtattctcct aactaaatgt cagggagtca atcattatca 1080

aaggcaagat tgattatttc tccccctatt gaggctttgt tgtattggat ttatttcctc 1140

tcattatgga cttgttctta tgttggtggt taatattgag ctgttgggtt agtttagtag 1200

ttggactatg attttccatt tgatgtaatt ctcttcttat acttataaat ttcttaccaa 1260

ttggcaaata ataaaataac aaaaacaaaa acaaaaacca aattgacata aaactatagg 1320

gcctaatttg ccatttgatt atgtggatat aatattcata aaaatattga gcaaatcaaa 1380

cacaaaaggt catgttggaa tatcatggcc tgttgtacca aatattatat agaaagtgat 1440

gggtggtctc tccaacacac aacaaaaatt tctcaaccca ttgcttgtta gcctttataa 1500

aaagagacac catggttttc aggatcacta agacaatagc ttatcccaca acttgggaaa 1560

cagagtctca aaattccttg agtaattgtc caatcagagg tcagattaga atgtgtagtc 1620

cacatctccc accaggcttt agatttcatc ccactgacga agagctcatc gtctattatc 1680

tgaagaaaaa ggtctcatca cctactagtc ctctgttctc tatcatagct gatattgatc 1740

tctacaagtt caatccatgg gagcttcctg gtattttcaa tttctttatc atctcttttc 1800

atatgtggtg atgcatatgt tggttggtgt tgtttgtgct tgtatttgca agagaaagat 1860

gcaaataata atgggttctt gtcttttgag gctcgggagg atcctctgtt ttgaaatctc 1920

cttatctttc tgttttaaat tgctcttaaa ttataaggta aaccaaactc gtaatctttg 1980

tagtatgcat cttgtgtcga tttgatcttt gtaattcgac tctatatcaa attttctctt 2040

gaatttttca cattgtgtca actttattca attgatagca cgccgtttaa aaattgaacc 2100

gatatcaagg gataaaacag tcaattcact atcttcaaag tgattggcag gttggcgtac 2160

aatttttttt taaaaacaat tattttcttt tgaagcgaga aatttgggaa cagagtttct 2220

taactgatca gttgaacatc tatttaaaca tttttttttt ccattcaatt tgcttataat 2280

agttgtctga atttctacag gcaaggctct gtttggcagt aacgagtggt ttttcttcac 2340

accgagagat aggaagtatc caaacggagc tcgtccaaac aggacagctg gagctgggta 2400

ctggaaagca actggtactg acaaaccgat cctaaactcg ggtgggttgc agtgtattgg 2460

tgtgaaaaag gctctggtct tctatcaagg ccgtcctcca aagggcgtga agactgattg 2520

ggtgatgcat gagtacagac ttctcgaaga ttcccattcg ctcccgagac tcaggggatc 2580

gatgcgggta agccaccatt gacaaaagct tctgctcttt tttctgtttc tgcaatcata 2640

agtgctttag cttttgaatc cactctgttt tcatctcccc tgtttttcat tacttctatg 2700

tcatatttca aaatatgatt ggttcgttgc gtgatagaaa ggtgatttga aacagaggat 2760

aagaatcgcg tgtgaatggt caattcaaaa gagaatgaat cattttgagt tgactttttt 2820

gacgttaacc actcgaatgg actattttat ttcattttac tctattttgt ttaaattgat 2880

acaatataaa aaattcaata gtaaacttga agcaattaaa actaaaataa ctaaattgat 2940

ataagaggca aattcaatgg acacgaatgc aatttgcccc aaaaaaacat aaagtatcta 3000

attggatttg cagtgtgctt ttaaactcgg tcacaataat gagtttgatc tacacattta 3060

aaaatatttt tctgagtacg tagcattgtt gccaatcatg ttagttttta gtacaactat 3120

gaaaacactt aacaaatcta gttaagattt tcaattttaa tcacaaattg ttctttcttg 3180

tgagatgctc tattttagac ttgtagtaat taacagtttc tccattgtat ttttcagttg 3240

gatgattggg tactatgccg agtacgccaa aaaaacaaca tcccacaaca aatcccagaa 3300

ttctcagaag aaagcagttt caattccatc cctggactca atttcccatt cttgaatgat 3360

ccacataaca aaaacacaat acactcaata gactctggca acgaaatcaa aactcatctc 3420

caatcgccca aagcgagaac aggactaaat gatcaagaac aagaacaagc acaagcacaa 3480

tggtacttaa actttcaagg aggaccatcc atgtcttcaa gcacagatgg aagttctcag 3540

tacgcaaatg aagaatcggt ttcgccaatc aaagatgttt tcaaatccct caaaagatcg 3600

atctctgtcg tgtcttttgg cgaagaattt ccattctcac caagtaataa caagaggctg 3660

cacgcagtac caactgatag catggaggat tcaagcattt tccaaatctg ttatcttgct 3720

aactgtgtat gaatgaaatg aaagcattct aagtgttctt gaaaatgcgc gatgacgctt 3780

taaaacaact ttatgatggt gttagatatt tgccctgtgt ttttcattta ttttcttgtc 3840

tattagttct ttctgttcct agaaagagat taagaggaac tgagatttgt agaaaggaaa 3900

atagatgtag ttagatatat tactgtgaga t 3931

<210> 2

<211> 346

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Val Phe Arg Ile Thr Lys Thr Ile Ala Tyr Pro Thr Thr Trp Glu

1 5 10 15

Thr Glu Ser Gln Asn Ser Leu Ser Asn Cys Pro Ile Arg Gly Gln Ile

20 25 30

Arg Met Cys Ser Pro His Leu Pro Pro Gly Phe Arg Phe His Pro Thr

35 40 45

Asp Glu Glu Leu Ile Val Tyr Tyr Leu Lys Lys Lys Val Ser Ser Pro

50 55 60

Thr Ser Pro Leu Phe Ser Ile Ile Ala Asp Ile Asp Leu Tyr Lys Phe

65 70 75 80

Asn Pro Trp Glu Leu Pro Gly Lys Ala Leu Phe Gly Ser Asn Glu Trp

85 90 95

Phe Phe Phe Thr Pro Arg Asp Arg Lys Tyr Pro Asn Gly Ala Arg Pro

100 105 110

Asn Arg Thr Ala Gly Ala Gly Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Thr Asp Lys

115 120 125

Pro Ile Leu Asn Ser Gly Gly Leu Gln Cys Ile Gly Val Lys Lys Ala

130 135 140

Leu Val Phe Tyr Gln Gly Arg Pro Pro Lys Gly Val Lys Thr Asp Trp

145 150 155 160

Val Met His Glu Tyr Arg Leu Leu Glu Asp Ser His Ser Leu Pro Arg

165 170 175

Leu Arg Gly Ser Met Arg Leu Asp Asp Trp Val Leu Cys Arg Val Arg

180 185 190

Gln Lys Asn Asn Ile Pro Gln Gln Ile Pro Glu Phe Ser Glu Glu Ser

195 200 205

Ser Phe Asn Ser Ile Pro Gly Leu Asn Phe Pro Phe Leu Asn Asp Pro

210 215 220

His Asn Lys Asn Thr Ile His Ser Ile Asp Ser Gly Asn Glu Ile Lys

225 230 235 240

Thr His Leu Gln Ser Pro Lys Ala Arg Thr Gly Leu Asn Asp Gln Glu

245 250 255

Gln Glu Gln Ala Gln Ala Gln Trp Tyr Leu Asn Phe Gln Gly Gly Pro

260 265 270

Ser Met Ser Ser Ser Thr Asp Gly Ser Ser Gln Tyr Ala Asn Glu Glu

275 280 285

Ser Val Ser Pro Ile Lys Asp Val Phe Lys Ser Leu Lys Arg Ser Ile

290 295 300

Ser Val Val Ser Phe Gly Glu Glu Phe Pro Phe Ser Pro Ser Asn Asn

305 310 315 320

Lys Arg Leu His Ala Val Pro Thr Asp Ser Met Glu Asp Ser Ser Ile

325 330 335

Phe Gln Ile Cys Tyr Leu Ala Asn Cys Val

340 345

<210> 3

<211> 1041

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggttttca ggatcactaa gacaatagct tatcccacaa cttgggaaac agagtctcaa 60

aattccttga gtaattgtcc aatcagaggt cagattagaa tgtgtagtcc acatctccca 120

ccaggcttta gatttcatcc cactgacgaa gagctcatcg tctattatct gaagaaaaag 180

gtctcatcac ctactagtcc tctgttctct atcatagctg atattgatct ctacaagttc 240

aatccatggg agcttcctgg caaggctctg tttggcagta acgagtggtt tttcttcaca 300

ccgagagata ggaagtatcc aaacggagct cgtccaaaca ggacagctgg agctgggtac 360

tggaaagcaa ctggtactga caaaccgatc ctaaactcgg gtgggttgca gtgtattggt 420

gtgaaaaagg ctctggtctt ctatcaaggc cgtcctccaa agggcgtgaa gactgattgg 480

gtgatgcatg agtacagact tctcgaagat tcccattcgc tcccgagact caggggatcg 540

atgcggttgg atgattgggt actatgccga gtacgccaaa aaaacaacat cccacaacaa 600

atcccagaat tctcagaaga aagcagtttc aattccatcc ctggactcaa tttcccattc 660

ttgaatgatc cacataacaa aaacacaata cactcaatag actctggcaa cgaaatcaaa 720

actcatctcc aatcgcccaa agcgagaaca ggactaaatg atcaagaaca agaacaagca 780

caagcacaat ggtacttaaa ctttcaagga ggaccatcca tgtcttcaag cacagatgga 840

agttctcagt acgcaaatga agaatcggtt tcgccaatca aagatgtttt caaatccctc 900

aaaagatcga tctctgtcgt gtcttttggc gaagaatttc cattctcacc aagtaataac 960

aagaggctgc acgcagtacc aactgatagc atggaggatt caagcatttt ccaaatctgt 1020

tatcttgcta actgtgtatg a 1041

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agaagaagat gttggcgacc t 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctcctgcggg taaatagctg 20