茶树CsERF3基因及其应用
阅读说明：本技术 茶树CsERF3基因及其应用 (Tea tree CsERF3 gene and application thereof ) 是由 潘晓雪 胡明瑜 王忠伟 白文钦 吴红 雷开荣 于 2021-07-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了茶树CsERF3基因及其应用。本发明从茶树中分离出编码ERF转录因子CsERF3基因的完整cDNA,连接到植物表达载体上,利用农杆菌侵染法转化植物,获得的转基因植株,对转基因植株进行了抗逆性分析,结果表明CsERF3基因能够响应逆境信号,正调控植物的耐高盐胁迫等能力,并且促进植株的矮化。因此CsERF3基因可以应用于植物遗传改良。(The invention discloses a tea tree CsERF3 gene and application thereof. The invention separates the complete cDNA of the coding ERF transcription factor CsERF3 gene from the tea tree, connects the cDNA to the plant expression vector, transforms the plant by using the agrobacterium infection method, obtains the transgenic plant, analyzes the stress resistance of the transgenic plant, and the result shows that the CsERF3 gene can respond the stress signal, positively regulates the high salt stress resistance and other capabilities of the plant, and promotes the dwarfing of the plant. Therefore, the CsERF3 gene can be applied to the genetic improvement of plants.)
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及茶树CsERF3基因及其应用。
背景技术
茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)是我国重要的经济作物之一，也是我国重要的特色农业支柱产业。2017年我国茶叶的生产总量约达260.9万吨，出口量约为35.53万吨，均位居世界第一。茶树是典型的喜酸性土壤的农业经济作物，其最适土壤pH为4.5～5.5，在弱碱性乃至中性土壤中均难以生长或无法形成有效经济产量(骆耀平等，2008)。土壤盐渍化是影响作物产量及品质主要的因素之一，是世界性的生态问题和资源问题。全世界受盐害影响的土地面积大约共有11.25亿公顷，其中中东地区接近1.8亿公顷的土壤受到不同程度的盐害，而我国受盐害影响的土地面积超过1亿公顷，约占全国土地面积的11％(Hossain 2019)。近年来，土壤盐渍化愈演愈烈，盐胁迫对茶树生长发育造成的影响日趋严重，极大地制约了茶树产业的发展。因此，提高茶树品种的耐盐胁迫能力是目前茶树育种工作者面临的艰巨而亟待解决的重要任务。
目前，提高茶树耐盐胁迫能力主要通过传统的田间措施，如加强田间管理、改善栽培条件及人工补偿等，但由于逆境胁迫的不确定性常常导致防御应对不及时、不准确而造成严重的经济损失。因此，选育耐盐胁迫品种是解决茶树抗热问题的根本途径，然而茶树传统育种方法，如自然杂交、人工杂交、芽变选种和组织培养等，选育周期长且品种鉴定困难，使茶树遗传改良工作进展缓慢。随着生物技术的快速发展，基于细胞工程和转基因工程的分子育种技术日益成熟，已成为植物新品种选育的重要手段，其通过外源或内源基因的导入或沉默从而具有针对性地赋予或改善植物目标性状并保留原有的优良性状，这为茶树抗性育种工作提供了全新的思路和手段。
为了应对生物或者非生物胁迫，植物体经过长时间的进化形成了复杂的机制感知逆境信号。常见的激素如ABA、ETH、GA等作为信号分子参与调节植物生长发育、逆境调控等生物学过程(高春艳等，2017)。一些转录因子依赖激素介导的信号通路参与调控植物非生物胁迫响应，当然还有一些不依赖激素信号通路参与调控，分析转录因子的功能可以更好了解植物应对非生物胁迫的分子机制(Kavas et al 2015)。AP2/ERF是植物特有的转录因子家族之一，在植物应对低温、干旱、高盐等多种非生物胁迫方面发挥着重要作用(尤其是ERF亚族成员)，能够参与多种激素信号通路影响植物逆境应答反应(Tao et al，2015)。因此，在茶树中发掘新的ERF类转录因子基因及其生物学特性和功能，可为整个植物抗逆基因调控网络及胁迫应答反应机理提供理论基础，并为改良植物抗逆性提供一定的物质基础。
发明内容
本发明的目的是提供茶树CsERF3基因及其应用。
本发明提供了一种编码茶树ERF转录因子的CsERF3基因及其应用，其中编码茶树ERF转录因子的CsERF3基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，由594个碱基组成。本发明从茶树中分离出编码CsERF3基因的完整cDNA，连接到植物表达载体上，利用农杆菌侵染法转化植物，获得转基因植株，对转基因植株进行了抗逆性分析，结果表明茶树ERF转录因子CsERF3能够响应逆境信号，正向调控植物的耐高盐胁迫能力，并且转基因植株变矮。
本发明的第一个目的是提供CsERF3基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
本发明的第二个目的是提供所述的CsERF3基因编码的蛋白质。
本发明的第三个目的是提供一种含有所述的CsERF3基因的表达载体。
本发明的第四个目的是提供一种含有所述的CsERF3基因的表达载体的宿主细胞。
本发明的第五个目的是提供所述的CsERF3基因在调控植物株型中的应用。
优选，所述的应用，为超表达CsERF3基因在促进植物矮化中的应用。
本发明的第六个目的是提供所述的CsERF3基因在调控植物抗逆性中的应用。
优选，所述的应用，为超表达CsERF3基因在增强植物耐盐性中的应用。
优选，所述的植物为茶树或烟草。
本发明的优点：
本发明从茶树中分离出编码ERF转录因子CsERF3基因的完整cDNA，连接到植物表达载体上，利用农杆菌侵染法转化植物，获得的转基因植株，对转基因植株进行了抗逆性分析，结果表明CsERF3基因能够响应逆境信号，正调控植物的耐高盐胁迫等能力，并且促进植株的矮化。因此该基因可以应用于植物遗传改良。
附图说明
图1是CsERF3的表达特性图，其中，图A为CsERF3在不同组织中的表达水平；图B为CsERF3在非生物胁迫下的表达水平。
图2是PCR分析不同CsERF3转基因烟草株系，其中，图A为不同转基因烟草的PCR检测；图B为不同转基因烟草的RT-PCR检测；WT：野生型；L1～L3：转基因株系。
图3是野生型和转CsERF3基因植株在不同浓度的NaCl胁迫下培养三周后的表型观察；WT：野生型，L2、L3：超表达CsERF3的转基因株系。
图4为超量表达CsERF3基因对烟草发育的影响的结果图；超量表达CsERF3的烟草与对照的植株比较；WT：野生型，L2、L3：超表达CsERF3的转基因株系。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
茶树中ERF转录因子CsERF3基因序列获得，具体如下：
以“福鼎大白茶”二年生扦插幼苗为试验材料，种植于自然环境下。选一无病害植株,摘取幼嫩叶片，根据RNA prep Pure Plant Kit(Polysaccharides&Polyphenolice-rich)(天根)试剂盒说明书提取RNA，用微量紫外检测仪NanoDrop测定提取的RNA样品浓度。然后利用One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix Kit(全式金)试剂盒将提取的RNA反转录成cDNA，设计一对特异引物，扩增出一条594bp长的序列，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示(对应的基因组DNA序列如SEQIDNO.2的第71-762位所示，其中第154-251位为内含子)，经过测序确定该序列含有翻译起始位点ATG和终止密码子，可以编码一个含197个氨基酸残基的蛋白质，即茶树ERF转录因子CsERF3基因。
其中，特异引物的核苷酸序列如下：
上游引物：5'AACACCTTGCCACAAGAAAC3'；
下游引物：5'TGAGATGCTTTGGACTTCGT3'。
实施例2
茶树CsERF3基因组织特异性表达和非生物胁迫响应表达模式分析：
以2年生“福鼎大白茶”为材料，取其根、茎、嫩叶、成熟叶和花，用于CsERF3组织表达模式分析。剪取2年生“福鼎大白茶”25cm的苗，并保留3张完全展开叶，放入1/2Hogland营养液中，在25℃，长日照(14h/10h，白天/黑夜)条件下培养15天，分别进行如下处理：20％(w/V)PEG-6000溶液，200mmol/L NaCl，低温(4℃)和高温(40℃)处理0、2、12、24和48h，取3个重复，液氮速冻后存于-80℃冰箱。提取RNA并反转成cDNA，方法如实施例1所述。按照SYBRPremix Ex Taq试剂盒(大连TaKaRa公司)操作说明进行实时定量PCR(quantitativerealtime RT-PCR)，反应在Bio-Rad CFX96 Touch荧光定量PCR仪上进行。分析各个样品CT值的相对定量参照基因的ΔΔCT法，表达差异等于2–ΔΔCT,ΔCT＝CT目标基因-CT Actin,ΔΔCT＝(CT目标基因-CT Actin)处理组-(CT目标基因-CT Actin)对照组，茶树Actin基因作为内参基因,与目标基因CsERF3一起扩增，扩增程序为95℃5min；95℃5s,55℃30s,65℃10s,35个循环。每个样品设3次重复。Actin引物序列(F：5'TGGTTAAGGCTGGATTTGCT 3'；R：5'TGCATGCTTTGACCCATAC 3')；CsERF3引物序列(F：5'GCCAGACCACAACAGCGATAC 3'；R：5'CGGATTGTAAGGGAAGTTGGTT 3')。
结果发现CsERF3在在根、成熟叶和花中较低，在嫩叶和茎中有较高表达水平(图1A)。CsERF3在干旱(PEG)、高盐(NaCl)、低温和高温胁迫下的表达的总体趋势是上调，其中NaCl诱导CsERF3上调表达的速度明显快于干旱、低温和高温诱导(图1B)。
实施例3
双元植物表达载体pCAMBIA1301-35s-CsERF3的构建，具体如下：
以pEASY-Blunt-CsERF3质粒(将SEQIDNO.1所示的CsERF3基因cDNA插入pEASY-Blunt载体得到的)为模板，采用引物CsERF3-PstI(F)：5'ctgcagAACACCTTGCCACAAGAAAC3'和CsERF3-BamHI(R)：5'cctaggTGAGATGCTTTGGACTTCGT3'在CsERF3前后分别引入酶切位点PstI和BamHI，然后该PCR产物和pCAMBIA1301空载体质粒分别用BamHI和PstI双酶切，将二者的酶切产物连接，连接产物转化E-Coli.DH5α，涂布于含50mg/ml浓度卡纳霉素抗性的LB平板上。37℃培养，12h后挑取单菌落进行菌落PCR验证，将菌落PCR验证阳性的菌，摇菌提取质粒，酶切鉴定得到目的条带，最后送上海生工测序，结果表明载体pCAMBIA1301-35s-CsERF3构建正确。
实施例4
用于植物转基因的农杆菌菌种EHA105:pCAMBIA1301-35s-CsERF3的构建，具体如下：
使用的农杆菌菌株为EHA105。采用的是液氮冻融法将构建好的表达载体转入农杆菌。具体过程为：1)冰浴融化EHA105感受态细胞，加入至少100ng回收纯化的pCAMBIA1301-35s-CsERF3表达载体质粒，轻轻混匀，冰浴30min；2)液氮速冻5min，37℃水浴5min，迅速置于冰上1min；3)加入800μL无抗生素的YEB培养基，28℃，200rpm复苏2h；4)6000rpm离心2min，吸掉培养基；5)混匀剩余菌液，涂抹于添加50mg/ml卡纳霉素和50mg/ml利福平的固体YEB培基上；6)28℃倒置培养48-72h；7)PCR检测阳性克隆，得到EHA105:pCAMBIA1301-35s-CsERF3，4℃保存备用。
实施例5
CsERF3基因转化烟草，具体如下：
烟草种子用1％的次氯酸钠消毒后，在灭菌的三角瓶中用无菌水摇瓶培养，约2天后种皮破裂露出胚根。把萌发的烟草种子移到1/2MSB固体培养基上生长，培养条件为25℃、16h光照/8h黑暗的光周期。约一个月后，生长健壮的无菌苗即可切取叶片用作转化的外植体。
用农杆菌介导的叶盘转化法对烟草进行遗传转化。转化用农杆菌菌株接种于液体YEB培养基，28℃200rpm摇床培养过夜。将菌液吸取1mL接种于20-25mL的液体YEB中，28℃200rpm摇床培养作二次活化，菌液摇至OD600为0.6-0.8时，离心收集菌体，用等体积的液体YEB重悬备用。将无菌苗叶片切成约0.5cm×0.5cm大小，放入制备好的农杆菌菌液中侵染10min，倒去菌液，将外植体放在表面铺有一层滤纸的共培养基上，24℃暗培养2-3天。
共培养后，外植体接入筛选培养基中诱导分化，每2-3周继代一次。出现不定芽后，将生长健壮的不定芽切下，转入生根培养基中生根。当抗性苗生长健壮、根系发达的时候，洗净根部琼脂，炼苗2-3天后移栽到花钵中生长。
其中，
YEB培养基：0.5％蔗糖(W/V)，1％细菌用胰化蛋白胨(W/V)，0.1％细菌用酵母提取物(W/V)，0.05％MgSO4·7H2O(W/V)，pH 7.0。固体培养基灭菌前加入1.5％的琼脂粉(W/V)；
MSB培养基：MS无机盐+B5有机+2.4g/L Gelrite+30g/L蔗糖，pH 5.8。
其中，MS无机盐采用下述记载的稀释倍数稀释MS无机母液后获得；
MS无机母液的配方(1000ml)：
50×母液I：82.5g NH4NO3、95g KNO3、8.5g KH2PO4，
50×母液II：18.5g MgSO4·7H2O，
50×母液III：16.612g CaCl2，
50×母液IV：1.39g FeSO4·7H2O、1.866g Na2EDTA，
200×母液V：1.24g H3BO3、0.166g KI、0.05g Na2MoO4·2H2O、4.46g MnSO4·4H2O、3.3802gMnSO4·H2O、1.72g ZnSO4·7H2O、0.005g CuSO4·5H2O、0.005g CoCl2·6H2O。
B5有机：肌醇100mg/L+烟酸1mg/L+盐酸吡哆醇1mg/L。
烟草共培养培养基：1×MSB+0.5mg/L IAA+2mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+2.4g/LGelrite，pH 5.4；
烟草筛选培养基：1×MSB+0.5mg/L IAA+2mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+50mg/L Km+200mg/L CEF+2.4g/L Gelrite，pH5.8；
生根培养基：1×MSB+30g/L蔗糖+50mg/L Km+200mg/L CEF+2.4g/L Gelrite，pH5.8。
本实施例中，用根癌农杆菌介导的方式将CsERF3基因转入到烟草中，再生植株DNA使用CsERF3基因的特异性引物扩增。转CsERF3基因烟草的3个株系(L1、L2、L3)中均扩增出一条约594bp的特异性带，在野生型植株中未检测到相同的条带，表明CsERF3基因已成功整合到烟草基因组中。然后提取植株RNA，进行RT-PCR检测，结果显示CsERF3基因能够在烟草中正常表达，如图2所示。
实施例6：超量表达CsERF3提高耐高盐胁迫能力
将灭菌后的CsERF3过表达烟草株系(L2和L3)和野生型烟草种子放于分别添加含有0、100mmol/L和200mmol/L NaCl的1/2MS固体培养基上，在25℃，长日照(14h/10h，白天/黑夜)条件培养21天，做3个重复。结果显示，高盐处理L2和L3后，其存活率显著高于野生型(图3)。因此，在烟草中过表达CsERF3可以正向调控烟草对高盐胁迫的响应。
实施例7：超量表达CsERF3抑制烟草植株生长
与野生型烟草相比，超量表达CsERF3基因的转基因烟草株系L2和L3的植株高度明显降低，如图4所示。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 重庆市农业科学院
<120> 茶树CsERF3基因及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 594
<212> DNA
<213> 茶树(Camellia sinensis (L.) O. Kuntze)
<400> 1
atggccagac cacaacagcg ataccgcgga gtccgacaaa ggcattgggg ttcttgggtc 60
tccgaaattc gccacccgtt actaaagact agaatttggc taggaacatt cgaaacggca 120
gaggatgcgg ctcgagccta cgacgaggcc gcaaggctaa tgtgtgggcc cagggcccga 180
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<211> 800
<212> DNA
<213> 茶树(Camellia sinensis (L.) O. Kuntze)
<400> 2
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agcaccaacc atggccagac cacaacagcg ataccgcgga gtccgacaaa ggcattgggg 120
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tcacaaagaa ttccaattcc aaatgttgtt gacaccaatt gcattattcg caatgggaat 540
gaaatggttg ggtggttgcc ggagatgaaa ccggtggtgg cggtggcgcc gccacagaag 600
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