一种调控蝴蝶兰花瓣蓝色生成的基因PeVIT及其应用
阅读说明：本技术 一种调控蝴蝶兰花瓣蓝色生成的基因PeVIT及其应用 (Gene PeVIT for regulating and controlling blue generation of butterfly orchid petals and application thereof ) 是由 明凤 马成昊 戴心悦 杨熠 张苏逸 于 2021-08-26 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种调控蝴蝶兰花瓣蓝色生成的基因PeVIT及其应用。本发明第一方面提供一种调控蝴蝶兰花瓣蓝色生成的基因,所述基因具有以下核苷酸序列中的一种：1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列通过一个或几个核苷酸的取代、缺失、或添加衍生产生的核苷酸序列；3)与SEQ ID NO.1具有至少80％同源性的核苷酸序列。本发明通过基因工程的手段有效调控了蝴蝶兰花瓣的颜色,在蝴蝶兰瞬时过表达株系中,其花瓣颜色在显微结构中出现蓝色色块,为蝴蝶兰的育种提供了理论基础。(The invention provides a gene PeVIT for regulating and controlling butterfly orchid petal blue generation and application thereof. The invention provides a gene for regulating and controlling the generation of blue color of butterfly orchid petals, which has one of the following nucleotide sequences: 1) a nucleotide sequence shown as SEQ ID NO. 1; 2) a nucleotide sequence derived from the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO.1 by substitution, deletion or addition of one or more nucleotides; 3) a nucleotide sequence having at least 80% homology with SEQ ID No. 1. The method effectively regulates and controls the color of the butterfly orchid petal by means of genetic engineering, and provides a theoretical basis for breeding of the butterfly orchid, wherein the color of the butterfly orchid petal appears as a blue color block in a microstructure in a transient overexpression strain of the butterfly orchid.)
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种调控蝴蝶兰花瓣蓝色生成的基因PeVIT及其应用。
背景技术
近年来随着我国经济实力的飞速提高，花卉行业也得到了前所未有的发展，如今人们已经不再满足于常见的花卉种类，而是追求具有一定观赏价值和收藏价值的奇特花卉和名贵花卉。
蝴蝶兰作为当代一种最具观赏性的兰科植物，因其艳丽的花色和独特的花型而受到大家的青睐，而蝴蝶兰的叶片色彩单一，没有蓝色的花瓣。如何通过基因工程手段改变蝴蝶兰花瓣的颜色受到了越来越多的关注。
发明内容
本发明提供一种调控蝴蝶兰花瓣蓝色生成的基因，通过基因工程的手段改变蝴蝶兰花瓣的颜色，从而使其具有独特的观赏价值。
本发明第一方面提供一种调控蝴蝶兰花瓣蓝色生成的基因，所述基因具有以下核苷酸序列中的一种：
1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列通过一个或几个核苷酸的取代、缺失、或添加衍生产生的核苷酸序列；
3)与SEQ ID NO.1具有至少80％同源性的核苷酸序列。
进一步地，所述蝴蝶兰为大辣椒蝴蝶兰或条纹蝴蝶兰。
本发明第二方面提供一种调控蝴蝶兰花瓣蓝色生成的蛋白，所述蛋白由本发明第一方面所述基因编码得到。
本发明第三方面提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明第一方面所述的核苷酸序列。
进一步地，所述重组表达载体为UBI1300-GFP或p416-TEF。
本发明第四方面提供一种重组表达转化体，所述重组表达转化体包含本发明第三方面所述的重组表达载体。
进一步地，所述重组表达转化体为农杆菌。
本发明第五方面提供第一方面提供的所述基因在调控蝴蝶兰花瓣颜色中的应用。
本发明第六方面提供一种调控蝴蝶兰花瓣颜色的方法，所述方法包括将本发明第四方面所述的重组表达转化体注射至蝴蝶兰花瓣中。
本发明第七方面提供第一方面提供的所述基因在调控铁元素转运能力中的应用。
本发明通过基因工程的手段有效调控了蝴蝶兰花瓣的颜色，在蝴蝶兰瞬时过表达株系中，其花瓣颜色在显微结构中出现蓝色色块，为蝴蝶兰的育种提供了理论基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1a为本发明一实施例提供的蝴蝶兰花瓣的不同组织部位；
图1b为本发明一实施例提供的蝴蝶兰花瓣中不同组织部位的PeVIT表达量；
图2为本发明一实施例提供的大辣椒蝴蝶兰实验组UBI1300-GFP-PeVIT和对照组UBI1300-GFP-EV在3天后花瓣显微结构下的表型图；
图3为本发明一实施例提供的条纹蝴蝶兰实验组UBI1300-GFP-PeVIT和对照组UBI1300-GFP-EV在3天后花瓣显微结构下的表型图；
图4为本发明一实施例提供的大辣椒蝴蝶兰实验组UBI1300-GFP-PeVIT和对照组UBI1300-GFP-EV中PeVIT的表达量检测结果；
图5为本发明一实施例提供的条纹蝴蝶兰实验组UBI1300-GFP-PeVIT和对照组UBI1300-GFP-EV中PeVIT的表达量检测结果；
图6为本发明一实施例提供的PeVIT在酵母菌株中的铁转运活性表达图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所采用的试剂，若无特殊说明，均为市售或公开渠道可以获得的试剂。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒等。
蝴蝶兰基因PeVIT的提取
1、使用试剂盒为RNAplant(市售)提取野生型蝴蝶兰花瓣总RNA，利用反转录试剂盒(市售)将总RNA反转录成cDNA；
2、根据转录组测序结果设计引物，引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，采用RT-PCR方法从蝴蝶兰cDNA中扩增出一条762bp的条带，将PCR产物回收，获取核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因，命名为PeVIT。该核苷酸序列编码的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示，由254个氨基酸残基组成，分子量为26.975千道尔顿。
PeVIT在大辣椒和条纹蝴蝶兰花瓣颜色的表达谱验证
1、使用试剂盒为RNAplant(市售)提取蝴蝶兰模式植物小兰屿蝴蝶兰不同组织部位的RNA，提取部位如图1a所示，利用反转录试剂盒(市售)将总RNA反转录成cDNA；
2、根据转录组测序数据设计引物，引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；
3、以不同组织部位的大辣椒蝴蝶兰和条纹蝴蝶兰反转录得到的cDNA为模板，对PeVIT基因进行表达谱验证。测试PeVIT的表达在不同组织部位的表达量，测试结果如图1b所示，PeVIT在花瓣中表达量较高，说明PeVIT可能参与蝴蝶兰花瓣颜色的形成。
UBI1300-GFP诱导大辣椒和条纹蝴蝶兰PeVIT基因瞬时过表达
1、将PeVIT基因的开放阅读框762bp可操作地连接于UBI1300-GFP载体，形成含有该基因片段的UBI1300-GFP-PeVIT载体，然后将载体转入农杆菌GV3101，得到重组表达转化体；构建的UBI1300-GFP载体以pCAMBIA1300载体为骨架对原先的启动子元件CAMV35S进行了改造，把原先的CAMV35S启动子替换成UbI启动子元件。
2、将重组表达转化体，在5ml含有100μM的乙酰丁香酮、50μg/ml卡那霉素以及10μg/ml利福平的LB培养基中，在28℃，200rpm培养过夜；
3、取步骤2中含有重组表达转化体的农杆菌菌液，在4℃，3700rpm下离心10分钟，离心后，除去上清液并用0.5M的MgCl2反复吹打重悬三次；
4、取步骤3中少许农杆重悬菌菌液，测量菌液OD值，并用0.5M的MgCl2稀释菌液使其OD值在0.6左右，然后加入总体积1.5倍的100μM乙酰丁香酮以及总体积20倍的MES(吗啉乙磺酸)，使细胞沉淀重悬，在室温下静置3-4h；
5、使用带有针头的1ml注射器吸取静置后的农杆菌转化液，分别注射于无病毒的大辣椒蝴蝶兰和条纹蝴蝶兰花瓣中；
6、注射后培养2-3天，观察大辣椒蝴蝶兰和条纹蝴蝶兰花瓣，处理后的蝴蝶兰为实验组，命名为UBI1300-GFP-PeVIT，同时设置对照组，命名为UBI1300-GFP-EV。
选取如图2中a所示的大辣椒蝴蝶兰实验组UBI1300-GFP-PeVIT花瓣以及b所示的大辣椒蝴蝶兰对照组UBI1300-GFP-EV花瓣，利用荧光显微镜在不同激发光的条件下对同一视野进行观察，观察结果如图2右侧所示，因为重组载体带有GFP标记，表明在绿色激发光下有绿色荧光的部位为PeVIT进行表达的部位；Bright Field是细胞在明场下的观测图，这种模式下无自发光，可以很直观的观察颜色的变化情况，例如，实验组花瓣在Bright Field模式下，箭头所指的区域可以看出有蓝色色块，但是前两者无法联系起来说明蓝色色块是由PeVIT的过表达所导致的，所以使用相应的软件进行Merged，即把GFP和Bright Field进行融合，表明蓝色色块是由PeVIT的过表达所导致的。
选取条纹蝴蝶兰的一朵花瓣的两瓣，如图3左侧所示，上花瓣为对照组UBI1300-GFP-EV花瓣，下花瓣为实验组UBI1300-GFP-PeVIT，取样后采用与大辣椒蝴蝶兰相同的手段进行观察，可以看出，实验组UBI1300-GFP-PeVIT花瓣相较于对照组UBI1300-GFP-EV花瓣在显微结构中观察到蓝色色块。
大辣椒和条纹蝴蝶兰突变株系中PeVIT基因的表达验证
1、使用试剂盒为RNAplant(市售)提取如图2-3所示花瓣的总RNA，利用反转录试剂盒(市售)将总RNA反转录成cDNA；
2、根据转录组测序数据设计引物，引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；
3、以如图2-3所示的花瓣的反转录得到的cDNA为模板，对PeVIT进行基因表达效率验证。验证结果如图4-5所示，观察到PeVIT的表达量在瞬时过表达突变株系的花瓣中的表达量均明显升高。
p416-TEF诱导酵母菌株突变体ΔCCC1和野生型酵母菌株DY150中，PeVIT基因的铁元素转运能力表达
1、将PeVIT基因的开放阅读框762bp可操作地连接于p416-TEF表达载体，形成含有该基因片段的p416-TEF-PeVIT载体；
2、将p416-TEF-PeVIT载体以及对照组p416-TEF-Vector载体分别转入酵母菌株突变体ΔCCC1和野生型酵母菌株DY150；
3、将步骤2中的四种酵母菌株在Ura选择缺陷型固体培养基上培养，将长出的四种酵母菌株在新的Ura选择缺陷型固体培养基划线，并待其长出后，再将长出的四种酵母菌株在Ura选择缺陷型液体培养基中进行复苏；
4、将步骤3复苏的含有四种酵母菌株的菌液在Ura选择缺陷型固体培养基以及含有7.5mM FeSO4的Ura选择缺陷型固体培养基上分别培养，观察其转入p416-TEF-PeVIT表达载体和对照组p416-TEF-Vector载体的酵母菌株突变体ΔCCC1以及野生型酵母菌株DY150。
实验结果如图6所示，发现转入p416-TEF-PeVIT表达载体的CCC1的Fe转运能力的被挽救，使其可以在7.5mM FeSO4的Ura选择缺陷型固体培养基上生长，表面PeVIT基因可以提高铁元素的转运能力。
此外，本发明还提供了如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列，其分别为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列衍生产生的核苷酸序列、与SEQ ID NO.1具有至少80％同源性的核苷酸序列，其具有与SEQ ID NO.1所示的序列相同的效果。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 上海师范大学
<120> 一种用于调控蝴蝶兰花瓣蓝色生成的基因PeVIT及其应用
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 738
<212> DNA
<213> 蝴蝶兰（Phalaenopsis aphrodite H. G. Reichenbach）
<400> 1
atggtgagag ctccatgctg cgagaagatg gggctaaaga aggggccatg gactgcagag 60
gaggaccaga ttctgatctc ttatatacaa aaccatggcc atggaaactg gagagctctc 120
ccaaagctag ctggattgtt gaggtgtggg aagagttgca gacttcggtg gacgaattat 180
ctcagacctg atattaaaag agggaacttt accagggaag aagaggatgc aatcattaac 240
ttgcatcaaa tgctgggaaa cagatggtct gcaattgcag cgaagctacc tggtagaaca 300
gataatgaga tcaaaaacgt atggcacact catctgaaga aaagattaac gagaaccgat 360
aaagagaccg gacaagaacg aatcagaaaa actcaaatag aaccaaagga agagatgccc 420
acacaatcat acagcagcac tccagaacca tcttcttcct ccagtactgt agacaacagt 480
cagaactcca tggaatcttt cagccatgaa gctgaagccc aagggatcga tgagagcttc 540
tggactgaag tgctgaaaat ggatagtaat gatgagtatt actgtaactc gtcggattca 600
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ggcgtgagag aagaggatga tgatttgagt ttttggttga ggatctttct gcaagctgaa 720
gaatttccac agatttga 738
<210> 2
<211> 245
<212> PRT
<213> 蝴蝶兰（Phalaenopsis aphrodite H. G. Reichenbach）
<400> 2
Met Val Arg Ala Pro Cys Cys Glu Lys Met Gly Leu Lys Lys Gly Pro
1 5 10 15
Trp Thr Ala Glu Glu Asp Gln Ile Leu Ile Ser Tyr Ile Gln Asn His
20 25 30
Gly His Gly Asn Trp Arg Ala Leu Pro Lys Leu Ala Gly Leu Leu Arg
35 40 45
Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Thr Asn Tyr Leu Arg Pro Asp
50 55 60
Ile Lys Arg Gly Asn Phe Thr Arg Glu Glu Glu Asp Ala Ile Ile Asn
65 70 75 80
Leu His Gln Met Leu Gly Asn Arg Trp Ser Ala Ile Ala Ala Lys Leu
85 90 95
Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Val Trp His Thr His Leu
100 105 110
Lys Lys Arg Leu Thr Arg Thr Asp Lys Glu Thr Gly Gln Glu Arg Ile
115 120 125
Arg Lys Thr Gln Ile Glu Pro Lys Glu Glu Met Pro Thr Gln Ser Tyr
130 135 140
Ser Ser Thr Pro Glu Pro Ser Ser Ser Ser Ser Thr Val Asp Asn Ser
145 150 155 160
Gln Asn Ser Met Glu Ser Phe Ser His Glu Ala Glu Ala Gln Gly Ile
165 170 175
Asp Glu Ser Phe Trp Thr Glu Val Leu Lys Met Asp Ser Asn Asp Glu
180 185 190
Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser Asp Ser Met Ala Met Glu Gly Phe Asn Ser
195 200 205
Ser Asp Phe Ser Tyr Asp Lys Phe Trp Leu Ser Ala Gly Val Arg Glu
210 215 220
Glu Asp Asp Asp Leu Ser Phe Trp Leu Arg Ile Phe Leu Gln Ala Glu
225 230 235 240
Glu Phe Pro Gln Ile
245
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成（Artificial Sequence）
<400> 3
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<210> 4
<211> 24
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<213> 人工合成（Artificial Sequence）
<400> 4
tcaaatctgt ggaaattctt cagc 24
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成（Artificial Sequence）
<400> 5
gcgaagctac ctggtagaac 20
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 6
attcgttctt gtccggtctc tc 22
<210> 7
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<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 7
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<213> 人工合成(Artificial Sequence)
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