具体实施方式

以下、将描述本发明的实施方式。本发明的范围不限于这些说明，除了以下的示例以外，可在不损害本发明的主旨的范围内进行适当地变更和实施。

1.定义

在本文中，“氨基酸残基”是指对应于从氨基酸羧基去除羟基的剩余部分结构(酰基)的结构。并且，“氨基酸”可以使用任何化合物，只要同时具有氨基和羧基的化合物，包含天然和非天然化合物。可以是中性氨基酸、碱性氨基酸、或酸性氨基酸中的任一个，除了本身作为递质如神经递质作用的氨基酸之外，可以使用作为多肽化合物如生物活性肽(除二肽、三肽及四肽之外，包括寡肽)和蛋白质等的多肽化合物的成分的氨基酸，例如，还可以是α氨基酸、β氨基酸、γ氨基酸等。作为氨基酸，优选使用光学活性氨基酸。例如，α氨基酸可以使用D-或L-氨基酸中的任一种，但优选选择在生物体中起作用的光学活性氨基酸。

在本文中，“卤原子”是指氟原子、氯原子、溴原子、或碘原子。

在本文中，“烷基”可以是由直链、支链、环状、或它们的组合组成的脂肪族烃基中的任一种。烷基的碳原子数没有特别限制，但例如，碳原子数为1-20个(C_1-20)，碳原子数为3-15个(C_3-15)，碳原子数为5-10个(C_5-10)。在指定碳原子数时，指具有其数量范围内的碳原子数的“烷基”。例如，C_1-8烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、异己基、正庚基及正辛基等。在本文中，烷基可具有一个或多个任一取代基。该取代基的实例包括但不限于烷氧基、卤原子、氨基、单或二取代的氨基、取代的甲硅烷基、或酰基等。烷基具有两个或多个取代基时，它们可以相同或不同。这同样适用于包含烷基部分的其他取代基(例如，烷烃基、芳烷基等)的烷基部分。

在本文中，当定义特定官能基“可以具有取代基”时，取代基的类型、取代位置、及取代基的数量没有特别限制，当具有两个或更多取代基时，它们可以相同或不同。取代基的实例包括但不限于烷基、烷氧基、羟基、羧基、卤原子、磺基、氨基、烷氧基羰基、氧代基等。在这些取代基中还可以存在取代基。这种实例包括但不限于卤化烷基、二烷基氨基等。

在本文中，“亚烷基”是由直链或支链饱和烃组成的二价基团，例如，包括亚甲基、1-甲基亚甲基、1，1-二甲基亚甲基、乙烯、1-甲基乙烯、1-乙基乙烯、1，1-二甲基乙烯、1，2-二甲基乙烯、1，1-二乙基乙烯、1，2-二乙基乙烯、1-乙基-2-甲基乙烯、三亚甲基、1-甲基三亚甲基、2-甲基三亚甲基、1，1-二甲基三亚甲基、1，2-二甲基三亚甲基、2，2-二甲基三亚甲基、1-乙基三亚甲基、2-乙基三亚甲基、1，1-二乙基三亚甲基、1，2-二乙基三亚甲基、2，2-二乙基三亚甲基、2-乙基-2-甲基三亚甲基、四亚甲基、1-甲基四亚甲基、2-甲基四亚甲基、1，1-二甲基四亚甲基、1，2-二甲基四亚甲基、2，2-二甲基四亚甲基、2，2-二正丙基三亚甲基等。

在本文中，“烷氧基”是上述烷基与氧原子键合的结构，例如，可以包括直链、支链、环状或它们的组合的饱和烷氧基。例如，作为优选的实例可包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、环丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、环丁氧基、环丙基甲氧基、正戊氧基、环戊氧基、环丙乙氧基、环丁甲氧基、正己氧基、环己氧基、环丙基丙氧基、环丁基乙氧基或环戊基甲氧基等。

在本文中，“芳基”可以是单环或稠合多环芳香烃基中的任一个，也可以是含有一个或多个杂原子(例如，氧原子、氮原子、或硫原子等)作为成环原子的芳香族杂环。在这种情况下，这可称为“杂芳基”或“杂芳族”。无论芳基是单环还是稠环，均可以键合在所有可能的位置。单环芳基的非限制性实例可包括苯基(Ph)、噻吩基(2-或3-噻吩基)、吡啶基、呋喃基、噻唑基、恶唑基、吡唑基、2-吡嗪基、嘧啶基、吡咯基、咪唑基、哒嗪基、3-异噻唑基、3-异恶唑基、1，2，4-恶二唑-5-基或1，2，4-恶二唑-3-基等。稠合多环芳基的非限制性实例可包括1-萘基、2-萘基、1-茚基、2-茚基、2，3-二氢茚-1-基、2，3-二氢茚-2-基、2-蒽基、吲唑基、喹啉基、异喹啉基、1，2-二氢异喹啉基、1，2，3，4-四氢异喹啉基、吲哚基、异吲哚基、酞嗪基、喹喔啉基、苯并呋喃基、2，3-二氢苯并呋喃-1-基、2，3-二氢苯并呋喃-2-基、2，3-二氢苯并噻吩-1-基、2，3-二氢苯并噻吩-2-基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、芴基或噻吨基等。在本文中，芳基可以在其环上具有一个或多个任意取代基。该取代基的实例包括但不限于烷氧基、卤原子、氨基、单或二取代的氨基、取代的甲硅烷基、或酰基等。当芳基具有两个或多个取代基时，他们可以相同或不同。这同样适用于包含芳基部分的另一取代基(例如，芳氧基或芳烷基等)的芳基部分。

在本文中，“烷基氨基”及“芳氨基”是指-NH₂基团的氢原子被一个或两个上述烷基或芳基取代的氨基。例如，可包括甲氨基、二甲氨基、乙氨基、二乙氨基、乙甲氨基、苄氨基等。同样，“烷硫基”及“芳硫基”是指-SH基团的氢原子被上述烷基或芳基取代的基团。例如，可包括甲硫基、乙硫基、苄硫基等。

本文中所使用的“酰胺”包含RNR’CO-(在R＝烷基的情况下，烷基氨基羰基-)及RCONR’-(在R＝烷基的情况下，烷基羰基氨基-)两者。

本文中所使用的“酯”包含ROCO-(在R＝烷基的情况下，烷氧基羰基-)及RCOO-(在R＝烷基的情况下，烷基羰基氧基-)两者。

在本文中，当由两个取代基的组合形成时，术语“环结构”是指杂环或碳环基团，这种基团可以是饱和的、不饱和的、或芳香族的。因此，包括在上述中定义的环烷基、环烯基、芳基、及杂芳基。例如，可包括环烷基、苯基、萘基、吗啉基、哌啶基、咪唑基、吡咯烷基、及吡啶基等。在本文中，取代基可与另一个取代基形成环结构，当这种取代基彼此键合时，本领域技术人员可以理解形成某些取代，例如与氢的键。因此，当描述特定的取代基一起形成环结构时，本领域技术人员可以理解，该环结构可通过通常的化学反应形成或容易地形成。相关环结构及其形成过程均在本领域技术人员的认知范围内。

2.荧光探针分子

本发明的用于检测脑肿瘤的荧光探针的特征在于，具有作为特定蛋白酶的底物的二肽位点作为侧链导入类呫吨骨架的结构，一方案中，包含具有下式(I)所示的结构的化合物或其盐。

化学式2：

在上述通式(I)中，P1表示精氨酸残基、组氨酸残基、或酪氨酸残基，P2表示脯氨酸残基或甘氨酸残基。如下述的实施例中所证实，在座位脑肿瘤的一种的胶质母细胞瘤中，由P1与P2构成的二肽位点是从某些类型的蛋白酶(肽酶)特异性表达且容易被相关蛋白酶选择性水解的氨基酸残基组合的观点来选择的。切断由P1与P2构成的二肽位点的蛋白酶优选为钙蛋白酶1或组织蛋白酶D。因此，在P1与P2的组合中，优选地，P1为精氨酸残基、组氨酸残基、或酪氨酸残基，P2为脯氨酸残基或甘氨酸残基，更优选地，P1为精氨酸残基，P2为脯氨酸残基。

其中，P1通过与相邻的式中的NH形成酰胺键来连接，即，通过氨基酸残基P1的羰基部分与式(I)中的NH形成酰胺键来呫吨骨架相连。另外，P1能够以与通常的肽链相同的方式连接到P2，其结果，P2与P1形成酰胺键并连接。如上所述，“氨基酸残基”是指对应于从氨基酸的羧基出去羟基的剩余部分结构的结构。因此，P2具有与所谓的N端残基相同的结构，作为中间氨基酸残基的P1可以与通常的肽链相同的方式与P2连接。

在上述通式(I)中，R¹表示1-4个相同或不同的取代基，独立地选自由氢原子、或可分别被取代的烷基、羧基、酯基、烷氧基、酰胺基、及叠氮基组成的组。在苯环上具有两个或多个取代基的情况下，他们可以相同或彼此不同。优选氢原子作为R¹。

R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、及R⁷各自独立地表示氢原子、羟基、烷基、或卤原子。优选地，R³及R⁴为氢原子。并且，还优选地，R²、R⁵、R⁶、及R⁷为氢原子。更优选地，R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、及R⁷均为氢原子。

R⁸及R⁹各自独立地表示氢原子或烷基。在R⁸及R⁹均表示烷基的情况下，他们可以相同或不同。例如，在R⁸及R⁹均为氢原子的情况下，优选地，R⁸为烷基且R⁹为氢原子。更优选地，R⁸及R⁹均为氢原子。

在上述式(I)中，X表示O、Si(R^a)(R^b)、Ge(R^a)(R^b)、Sn(R^a)(R^b)、C(R^a)(R^b)、或P(＝O)(R^a)。其中，R^a及R^b各自独立地表示氢原子、烷基、或芳基。在R^a及R^b为烷基的情况下，它们可以具有一个或多个取代基，作为这种取代基，例如可以具有一个或多个烷基、烷氧基、卤原子、水酸基、羧基、氨基、磺基等。R^a及R^b可以为具有每个均能够被取代的1-6个碳原子的烷基，两者均优选为甲基。并且，在某些情况下，R^a及R^b可以彼此键合形成环结构。例如，在R^a及R^b均为烷基的情况下，R^a及R^b可以彼此键合形成螺碳环。所形成的环优选为例如约5至8元环。X优选为O(氧原子)。

Y表示C₁-C₃。亚烷基可以为直链亚烷基或支链亚烷基中的一个。例如，除了亚甲基(-CH₂-)、亚乙基(-CH₂-CH₂-)、亚丙基(-CH₂-CH₂-CH₂-)之外，-CH(CH₃)-、-CH₂-CH(CH₃)-、-CH(CH₂CH₃)等也可用作支链亚烷基。其中，优选为亚甲基或亚乙基，更优选为亚甲基。

上述通式(I)所示的化合物能够以盐的形式存在。这种盐可包括碱加成盐、酸加成盐、氨基酸盐等。碱加成盐可包括诸如钠盐、钾盐、钙盐、镁盐等的金属盐、铵盐、或诸如三乙胺盐、哌啶盐、吗啉盐等的有机胺盐等，酸加成盐可包括诸如盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐等的无机酸盐、诸如羧酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、草酸盐等的有机酸盐等。氨基酸盐可包括甘氨酸盐等。然而，并不局限于这些盐。

式(I)所示的化合物根据取代基的种类可具有1个或2个以上的不对称碳，可存在光学异构体或非对映异构体等的立体异构体。纯形式的立体异构体、立体异构体的任意混合物、外消旋体等均包括在本发明的范围内。

式(I)所示的化合物或其盐能够以水合物或溶剂化物的形式存在，这些物质均包括在本发明的范围内。形成溶剂化物的溶剂的种类没有特别限制，但可例举乙醇、丙酮、异丙醇等的溶剂。

通式(I)所示的化合物可通过如下方法容易地制备：将诸如第3位及第6位具有氨基且第9位中具有2-羧基甲苯基或2-烷氧基羰基苯基的呫吨化合物等用作原料，将第9位的2-羧基甲苯基或2-烷氧基羰基苯基转化为羟烷基，将第3位的氨酰化。可用作原料的3，6-二氨基呫吨化合物可包括例如市售的若丹明(Rhodamine)110或若丹明123等，但并不局限于此，可根据目标化合物的结构选择合适的呫吨化合物。并且，也可通过使用具有通式(I)所示的化合物中的呫吨骨架部分的氧原子被具有特定取代基的C原子或Si原子、或者Ge原子、Pb原子取代的骨架的化合物来制备具有与本发明中通式(I)相同功能的荧光探针。

并且，由于本文的实施例中具体示出了通式(I)所示的本发明的化合物中所包含的代表性化合物的制备方法，因此本领域技术人员可通过参考本文的公开并根据需要适当地选择起始原料、试剂、反应条件等来容易地制备通式(I)中所包含的任意化合物。

上述荧光探针可根据需要通过配合糖厂用于制备试剂的添加剂作为组合物使用。例如，作为用于生理环境的添加剂可使用诸如溶解辅助剂、pH调节剂、缓冲剂、张度剂(tonicity agent)等的添加剂，其混合两可通过本领域技术人员适当地选择。这些组合物可以作为诸如粉末形式的混合物、冻干物、颗粒剂、片剂、液体等适当形式的组合物提供。

3.荧光探针分子的发光机理

以下、对本发明的荧光探针的荧光发光机理进行说明。

上述式(I)所示的化合物为因其水溶性高、荧光量子产率高等而被广泛用于生物成像的呫吨系荧光色素的骨架，但当呫吨骨架上部处于闭环状态时，中性区域(例如，pH5至9的范围)中该荧光探针本身为基本上不吸收且不发荧光(荧光响应为关闭(Off)状态)。针对这些，如下图所示，P2-P1-NH中的二肽位点被蛋白酶水解，当从呫吨骨架上裂解时，迅速变成开环的互变异构体而生成强荧光化合物(II)。

化3：

即，含有通式(I)所示的化合物或其盐作为有效成分的本发明的荧光探针具有使上述开环化合物(II)被脑肿瘤组织中表达的蛋白酶水解并发出强荧光的性质。因此，通过使用本发明的荧光探针，可检测或标记表达该蛋白酶的脑肿瘤的存在。相关蛋白酶可包括如上所述的钙蛋白酶1或组织蛋白酶D。

更详细地，例如，X为O原子的通式(I)所示的化合物或其盐当在中性区域中使用例如约440-510nm的激发光照射时几乎不发光，但是上述开环化合物具有在相同条件下发出强荧光(例如，发射(emission)：524nm)的性质。因此，在使用本发明的荧光探针进行检测的情况下，通常照射约440-510nm的可视光即可。应观察的荧光波长通常为约510-800nm，例如，优选观察约516-556nm的荧光。

4.使用荧光探针的检测/可视化方法

根据相关的发光机理，还可通过使用上述荧光探针来特异性检测或可视化表达特定蛋白酶的脑肿瘤。

具体地，本发明的方法的特征在于，包括：

A)使上述荧光探针与靶组织接触的步骤；以及

B)对在上述靶组织中表达的蛋白酶与上述荧光探针之间反应的荧光响应进行观察步骤。只有表达特定蛋白酶的靶组织(或靶细胞)才能被特异性检测或可视化为荧光信号。此外，本文中术语“检测”应以最广泛的含义来解释，包括用于各种目的的检测，例如，定量及定性等。

如上所述，特定蛋白酶可优选地为钙蛋白酶1或组织蛋白酶D。然而，并不局限于此。并且，上述靶组织为脑肿瘤组织。脑肿瘤可包括胶质母细胞瘤和神经胶质瘤。也可以靶向存在于脑肿瘤组织中的肿瘤细胞。

并且，本发明的方法还可包括使用荧光成像装置观察上述荧光响应的步骤。在上述观察荧光响应的步骤中，可以使用具有宽测量波长的荧光光度计，但是也可通过使用能够将上述荧光响应显示为二维图像的荧光成像装置来对荧光响应进行可视化。通过利用荧光成像的步骤，可以二维可视化荧光响应，从而可以瞬间识别表达上述蛋白酶的靶组织(或细胞)。作为荧光成像装置，可以使用该技术领域已知的装置。此外，根据需要，还可以通过紫外可见吸收光谱的变化(例如，特定吸收波长处的吸光度的变化)来检测上述蛋白酶与荧光探针的反应。

在上述步骤A)中，作为使待测样品与荧光探针接触的方法，代表性地，可包括将含有荧光探针的溶液喷雾、添加、或涂布到样品的步骤，但是可根据上述样品的形式和测量环境等来适当地选择。在将含有荧光探针的溶液喷雾到样品上的情况下，例如，可使用包括：药液收容部，用于收容含有荧光探针的药液；以及药液喷雾部，被配置为能够将该化学溶液喷射到待测样品上。相关装置可以为内窥镜。具有这种功能的内窥镜可包括具有在日本特开2010-240188号公报及特开2015-23904号公报中公开的结构的内窥镜。并且，由于该装置通过荧光探针观察荧光响应，因此可进一步包括如上所述的荧光成像方法。

本发明的荧光探针的使用浓度没有特别限制，但例如可适用浓度约为0.1-10μM的溶液。

作为本发明的荧光探针，可直接使用上述式(I)所示的化合物或其盐，但是也可以根据需要添加通常用于制备试剂的添加剂作为组合物。例如，作为在生理环境中使用试剂的添加剂，可适用诸如溶解辅助剂、pH调节剂、缓冲剂、张度剂等的添加剂，其混合量可通过本领域技术人员适当地选择。这些组合物通常以适当形式的组合物提供，例如粉末形式的混合物、冻干物、颗粒剂、片剂、液体等，但当使用时，可将其溶解于注射用蒸馏水或适当的缓冲液中适用。

根据本发明方法的脑肿瘤的检测或可视化通常可在中性条件下进行，例如，可在pH5.0-9.0的范围内，优选在pH6.0-8.0的范围内，更优选在pH6.8-7.6的范围内进行。作为调节pH的方法，例如，可适用该技术领域中已知的任何pH调节剂或缓冲溶液，例如，磷酸缓冲液。

通过本发明的方法检测或可视化脑肿瘤，可用于诊断这些肿瘤。本文中术语“诊断”需要从最广泛的含义上进行解释，包括用肉眼或显微镜确认任何生物部位中肿瘤组织的存在。

本发明的检测方法可以再诸如手术中或检查中使用。本文中术语“手术”是用于诊断和治疗肿瘤的任何应用，除了诸如开放性伤口开颅手术、穿刺手术、开胸手术、或开腹手术、或皮肤手术等之外，包括内窥镜手术，例如神经内窥镜、胃镜、结肠镜、腹腔镜、或胸腔镜等。并且，术语“检查”包括使用内窥镜的检查、与检查相关的组织的切除和收集等的处置，以及对从货梯分离/收集的组织进行的体外检查等。

作为优选的方式之一，例如，本发明的荧光探针在肉眼或显微镜下通过适当的方法如喷雾、涂布或注入，适用于部分或全部手术领域，在几十秒至几分钟后，发出波长约为50nm的光，可照射适用部位。当其适用部位包含肿瘤组织的情况下，由于其组织发出荧光，因此其组织被识别为肿瘤组织，并与包括肿瘤组织在内的周围组织一起切除。例如，在肿瘤的手术治疗时，除了对肿瘤组织进行肉眼可以确认的确诊外，还可以对淋巴结等淋巴组织及周围器官组织的浸润和转移等进行诊断，可进行手术中快速诊断而确定切除范围。

并且，作为另一优选的方式，例如，在内窥镜检查中将本发明的荧光探针通过适当的方法，例如喷雾、涂布、或注入等，适用于检查位点，在几十秒至几分钟后，发出波长约为500nm的光照射适用部位，当发荧光的组织被确认时，其可以被识别为肿瘤组织。在内窥镜检查中可确认到肿瘤组织的情况下，可对其组织进行检查性切除或治疗性切除。

[实施例]

以下、将参考实施例更详细地描述本发明，但本发明并与局限于此。

[实施例1]

1.荧光探针的合成

根据国际公开公报WO2016/006678的实施例1所述的反应方案合成具有各种二肽位点的羟甲基若丹明绿(HRMG)。通过对该实施例1中化合物A7合成中所使用的的Fmoc-氨基酸进行各种改变，获得具有不同二肽位点的化合物。

在所合成的化合物中，上述通式(I)中的R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸及R⁹均为氢原子，X＝O，Y＝亚甲基，P1及P2为以下的组合。

表1

实施例2

2.通过荧光探针的筛选

将含有实施例1中合成的YK190、YK213、YK19及YK281的荧光探针化合物组加入到肿瘤和肿瘤周围部的新鲜生标本中，进行荧光强度的比较。样本使用胶质母细胞瘤。作为比较例，使用没有二肽位点的羟甲基若丹明绿(HRMG)。

将各种荧光探针的0.5μLDMSO溶液(10mM)溶解在100μL的RPMI1640(无酚红(phenolred-free))(探针终浓度为50μM)、每个样本中滴加200μL之后，使用Maestro InVivo Imaging System Ex随时间测量荧光强度。

·激发波长：465nm

·发光波长：515nm

如图1及图2所示，其结果发现，(1)YK190和(2)YK213与周围部组织相比被肿瘤特异性荧光标记，而(3)YK218与周辺组织相比没有太大差异。(5)的HRMG为侧链中没有二肽位点的比较例。如图2所示，发现YK190和YK213在肿瘤中均获得了较高的荧光强度，但YK190可以说是更好的荧光探针，因为它显示出了几乎2倍的荧光强度。并且，(4)YK19也获得了优异的肿瘤特异性荧光响应。

图3为总结了对这些荧光探针化合物进行了荧光响应筛选的结果(横轴为样品，纵轴为探针名称，未观察到荧光响应的以灰色表示)。

实施例3

3.蛋白酶的鉴定

接着，鉴定与实施例2中获得的荧光响应有关的蛋白酶。

使用DEG(电泳凝胶(Diced electrophoresis gel))测定和LC MS/MS通过肽质量指纹图谱进行蛋白酶分析，组织蛋白酶D、细胞溶胶非特异性二肽酶、钙蛋白酶1、细胞溶胶氨肽酶被确定为候选酶。

针对这些候选酶，使用抑制药(SNJ-1945及Amastatin)测量荧光强度变化的结果发现，钙蛋白酶1及组织蛋白酶D的荧光被SNJ-1945抑制。

针对这些钙蛋白酶1及组织蛋白酶D，当测量由于与荧光探针YK190反应引起的荧光强度变化时，如4所示，观察到荧光强度显著增加，表明实施例2中胶质母细胞瘤的荧光响应是由这些酶与荧光探针的反应引起的。

并且，在通过实时PCR寻找表达酶中，与肿瘤周围部相比，发现肿瘤裂解物中钙蛋白酶1及组织蛋白酶D的基因表达增加，这与上述结果一致。

实施例4

4.使用通过SiRNA的U87细胞系进行验证

在细胞系中通过SiRNA敲除钙蛋白酶1及组织蛋白酶D，并确认了与荧光探针YK190的反应。实验以如下所示的步骤进行。

使用U87胶质母细胞瘤细胞系，用脂质体转染SiRNA，培养48小时候，确认了与荧光探针的反应。

其结果、与对照SiRNA细胞系相比，U87细胞系中钙蛋白酶1和组织蛋白酶D的表达均降低(图5)。其结果还表明，实施例2中对胶质母细胞瘤的荧光响应是由这些酶与荧光探针的反应引起的。此外，作为支持这一点的实验，通过实时PCR确认了酶表达水平，与其结果一致(图6)。