一种基于棘突蛋白基因修饰干细胞的新型冠状病毒疫苗
阅读说明：本技术 一种基于棘突蛋白基因修饰干细胞的新型冠状病毒疫苗 (Novel coronavirus vaccine based on spinous process protein gene modified stem cells ) 是由 张建立 曾琼 霍凯兵 于 2020-08-18 设计创作，主要内容包括：本发明涉及疫苗技术领域,公开了一种基于棘突蛋白基因修饰干细胞的新型冠状病毒疫苗,其活性成分为三聚体形式的棘突蛋白基因修饰的间充质干细胞,可应用于预防新型冠状病毒；同时公开了一种基于棘突蛋白基因修饰干细胞的新型冠状病毒疫苗的制备方法：构建表达棘突蛋白的腺病毒载体、制备棘突蛋白重组腺病毒颗粒、纯化富集腺病毒颗粒、获取间充质干细胞、获取棘突蛋白编码基因修饰的人脐带间充质干细胞。本发明的疫苗通过棘突蛋白的基因重组型间充质干细胞表达棘突蛋白来启动人体针对新型冠状病毒的免疫反应,产生病毒中和性抗体,从而避免病毒对人体的感染,安全、可靠、有效,具有良好的应用前景,为新型冠状病毒的预防提供了全新的选择。(The invention relates to the technical field of vaccines, and discloses a novel coronavirus vaccine based on a spinous process protein gene modified stem cell, wherein the active component of the novel coronavirus vaccine is a trimeric form spinous process protein gene modified mesenchymal stem cell, and the novel coronavirus vaccine can be applied to prevention of novel coronavirus; simultaneously discloses a preparation method of the novel coronavirus vaccine based on the spinous process protein gene modified stem cells, which comprises the following steps: the method comprises the steps of constructing an adenovirus vector for expressing the spinous process protein, preparing spinous process protein recombinant adenovirus particles, purifying and enriching the adenovirus particles, obtaining mesenchymal stem cells and obtaining the human umbilical cord mesenchymal stem cells modified by the encoding gene of the spinous process protein. The vaccine provided by the invention starts the immune reaction of a human body to the novel coronavirus through expressing the spinous process protein by the genetic recombinant mesenchymal stem cell of the spinous process protein, and generates a virus neutralizing antibody, so that the infection of the virus to the human body is avoided, and the vaccine is safe, reliable and effective, has a good application prospect, and provides a brand-new choice for the prevention of the novel coronavirus.)
技术领域
本发明涉及疫苗技术领域，具体的说涉及一种基于棘突蛋白基因修饰干细胞的新型冠状病毒疫苗。
背景技术
2019-nCov病毒感染者的症状一般为发热、乏力、干咳、头疼，逐渐出现呼吸困难，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍，甚至死亡。病毒潜伏期最短有1天发病，最长的潜伏期是14天，潜伏期具有传染性，目前所致疾病还没有特异有效的治疗方法。
然而，目前没有特别有效的治疗手段，对患者主要采用先隔离，然后雾化吸入α-干扰素，口服洛匹那韦/利托那韦，及短期内使用糖皮质激素。然而这些治疗方法的有效率并不高。病毒感染造成的肺纤维化(pulmonary fibrosis)也是发病中重要的临床表现，肺纤维化可对肺造成不可逆的伤害，可导致进行性呼吸困难，肺功能受损，严重者可致死亡。
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，MSCs最初在骨髓中发现，随后还发现存在于人体发生、发育过程的许多种组织中。因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。
研究发现，MSCs是一种幼稚的发育早期的具有分化潜能的细胞，它具有以下几种特性： 1)具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下具有分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞的能力；2)具有免疫调节功能，通过细胞间的相互作用及产生细胞因子抑制T细胞的增殖及其免疫反应，从而发挥免疫重建的功能；3)趋化性：MSCs可以向受损组织、肿瘤部位迁移；4)具有来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性；5)由于无主要组织相容性复合体的表达，几乎无免疫排斥，异体移植免疫排异较轻，配型要求不严格。正是由于间充质干细胞所具备的这些独特的免疫学特性，使其在临床治疗方面具有广阔的临床应用前景。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明要解决的技术问题在于提供了一种基于棘突蛋白基因修饰干细胞的新型冠状病毒疫苗，该干细胞可在体内长时间滞留，高效分泌新型冠状病毒棘突蛋白，启动人体针对新型冠状病毒的免疫反应，产生病毒中和性抗体，避免病毒对人体的感染。
为解决上述技术问题，本发明通过以下方案来实现：一种基于棘突蛋白基因修饰干细胞的新型冠状病毒疫苗，所述新型冠状病毒疫苗的活性成分为三聚体形式的棘突蛋白基因修饰的间充质干细胞，所述新型冠状病毒疫苗可应用于预防新型冠状病毒。
进一步的，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞，其经过棘突蛋白重组腺病毒感染来获得棘突蛋白编码基因修饰，能够表达棘突蛋白，并以三聚体形式表达于细胞的表面。
进一步的，所述棘突蛋白由腺病毒表达载体pAd/CMV/V5-DEST的CMV启动子调控表达。
进一步的，所述棘突蛋白与新型冠状病毒的表面糖蛋白相同，新型冠状病毒的表面糖蛋白编码核苷酸序列为Seq ID No.1。
本发明的另一目的在于提供一种基于棘突蛋白基因修饰干细胞的新型冠状病毒疫苗的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(1)构建表达棘突蛋白的腺病毒载体：通过自由重组分别构建表达棘突蛋白的腺病毒载体；
(2)制备棘突蛋白重组腺病毒颗粒：用步骤(1)中的腺病毒载体分别转染人胚肾细胞 HEK293T制备腺病毒颗粒；
(3)纯化富集腺病毒颗粒：把步骤(2)中可表达棘突蛋白的腺病毒颗粒进行纯化富集；
(4)获取间充质干细胞：从脐带分离间充质干细胞，选择第2-3代处于对数生长期的间充质干细胞；
(5)获取棘突蛋白编码基因修饰的人脐带间充质干细胞：待步骤(4)中的间充质干细胞生长至70-80％汇合度时，用富集的腺病毒颗粒混合物进行感染。
相对于现有技术，本发明的有益效果是：
(1)本发明将细胞治疗和基因治疗相结合，以三聚体形式的棘突蛋白修饰的间充质干细胞作为疫苗的活性成分，具有方便获取的优势，其可以补充局部干细胞数量，并高效分泌三聚体棘突蛋白及人源性生长因子(如EGF、bFGF等)，在来改善局部微环境及免疫调节的同时，刺激机体产生针对新型冠状病毒的中和性抗体，安全、可靠、有效，具有良好的应用前景。
(2)本发明通过基因修饰的手段使得脐带来源间充质干细胞高效表达三聚体棘突蛋白，以最接近病毒棘突蛋白的天然形态对个体进行免疫，从而有效防御病毒。
(3)本发明从脐带中分离间充质干细胞，能大量扩增治疗用细胞的数量，并克服从骨髓获取间充质干细胞数量少、取材具有创伤性等特点，降低了生产及使用成本。
附图说明
图1为本发明实施例新型冠状病毒棘突蛋白的结构域示意图；
图2为本发明实施例新型冠状病毒棘突蛋白的RBD区域抗原性分析图；
图3为本发明实施例腺病毒载体pAD/CMV/Spike的结构示意图；
图4为本发明实施例新型冠状病毒疫苗的制备流程示意图；
具体实施方式
下面结合附图对本发明的优选实施例进行详细阐述，以使发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
实施例1
本发明的一种基于棘突蛋白基因修饰干细胞的新型冠状病毒疫苗，所述新型冠状病毒疫苗的活性成分为三聚体形式的棘突蛋白基因修饰的间充质干细胞，所述新型冠状病毒疫苗可应用于预防新型冠状病毒。
其中，间充质干细胞为脐带间充质干细胞，其经过棘突蛋白重组腺病毒感染来获得棘突蛋白编码基因修饰，能够表达棘突蛋白，并以三聚体形式表达于细胞的表面。
参照附图1～2，棘突蛋白为新型冠状病毒的表面糖蛋白(Surfaceglycoprotein)，该蛋白不包含TMPRSS2蛋白酶切割位点，其密码子经过优化，在真核细胞内可高效翻译，具体核苷酸序列如Seq ID No.1所示，新型冠状病毒的氨基酸序列为： RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKC YGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSN NLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQP TNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKF LPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVP VAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPR RARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGD STECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILP DPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMI AQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAI GKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQI DRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFP QSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEP QIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINA SVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWP。
参照附图3，棘突蛋白由腺病毒表达载体pAd/CMV/V5-DEST的CMV启动子调控表达。具体的，表达棘突蛋白的表达序列从5’端到3’端依次为CMV启动子、密码子优化的棘突蛋白基因开放读码框、HBB基因3`-UTR、胸苷激酶(thymidine kinase，TK)的加尾信号(TK pA)。
参照附图4，本发明的一种基于棘突蛋白基因修饰干细胞的新型冠状病毒疫苗的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(1)构建表达棘突蛋白的腺病毒载体：从NCBI GenBank中下载棘突蛋白的基因序列 (MN908947：nt21563-25384)，用GeneOptimizer对棘突蛋白的开放读码框进行密码子优化，把优化后的棘突蛋白编码序列通过人工合成的方法导入pENTR1A载体(A10462，ThermoFisher)的BamHI和XhoI酶切位点之间，分别命名为pENTR1A-COV19Spike；使用Gateway LR Clonase II Enzyme(11791-020，ThermoFisher)把棘突蛋白从 pENTR1A-COV19Spike转移到pAd/CMV/V5-DEST腺病毒表达载体(V493-20，ThermoFisher) 中，分别命名为pAd-CMV-COV19Spike。
(2)制备棘突蛋白重组腺病毒颗粒：用限制性内切酶PacI(R0547S，New EnglandBiolabs)分别对5μg pAd-CMV-COV19Spike进行酶切，使质粒线性化，用异丙醇纯化线性化的DNA片段。利用Lipofectamine 2000(11668-019，ThermoFisher)把线性化 pAd-CMV-COV19Spike转染HEK293细胞；转染的HEK293在培养过程中要观察细胞生长情况，约2周后可观察到细胞病变(cytopathic effect，CPE)出现。转染10-14天后，收集细胞沉淀，加入2ml灭菌的PBS混悬，反复冻融细胞，离心后收集上清保存于-80℃；取30-50％上清，感染70％汇合度的T25细胞培养瓶中的293细胞，培养2-3天后出现明显细胞病变；3-5天后，当1/3的细胞漂浮时收集细胞沉淀，PBS重悬后反复冻融，离心后收集上清并保存于-80℃环境中；
(3)纯化富集腺病毒颗粒：取5μl病毒上清加入5μl 2×PBS，煮沸5分钟，离心后取1-2μl作为模板进行PCR，检测棘突蛋白的编码基因，然后将步骤(2)中可表达棘突蛋白的腺病毒颗粒进行纯化富集；
(4)获取间充质干细胞：无菌条件下，用无血清低糖DMEM培养基(11885092，Lowglucose DMEM，ThermoFisher)冲洗5-10克正常脐带组织，去除血污，在灭菌处理过的培养皿中把脐带组织剪碎为细颗粒状，再用低糖DMEM培养基清洗3次，直至组织碎块变为灰白色。将剪碎的组织碎块转入含有1mg/ml胶原酶(C1639，Collagenase，Sigma)的低糖 DMEM培养基中，完全浸没组织碎块，置于37℃细胞培养箱中充分消化2小时。常温下 1000rpm离心5分钟，弃上清，用低糖DMEM重悬沉淀。将组织碎块悬液转入T25细胞培养瓶(430168，Corning)，用含20％胎牛血清(10438026，Fetal Bovine Serum， ThermoFisher)的低糖DMEM培养，置于37℃5％CO2恒温细胞培养箱。当细胞约80％汇合时用0.25％胰酶消化细胞进行传代培养。取第2-3代细胞，使用流式细胞术检测细胞表面分子标志(CD14-、CD34-、CD45-、CD73+、CD90+、CD105+)，来验证所培养的细胞是否具有间充质干细胞的表型。本发明中脐带间充质干细胞高表达CD73、CD90、CD105，不表达CD14-、CD34-和CD45-，由此可见培养的细胞为间充质干细胞。
(5)获取棘突蛋白编码基因修饰的人脐带间充质干细胞：用T175 cm2培养瓶(431080， Corning)培养人脐带间充质干细胞，当细胞汇合度达到70％时，把表达棘突蛋白的腺病毒颗粒加入到T175 cm2培养瓶中，混匀，37℃、5％CO2恒温培养箱中继续培养24-48小时，加入胰酶进行消化，制备细胞悬液。
实施例2
本优选实施例通过小鼠实验来对本发明做进一步说明。
将10只小鼠分成两组，A组5只，B组5只，将它们放置在相同的环境下生活：
A组注射疫苗：把1×107个棘突蛋白编码基因修饰人脐带间充质干细胞用胰酶消化，充分吹打成单细胞悬液，2000rpm离心收集细胞沉淀，用2ml医用生理盐水把沉淀重新悬浮；用微量注射器把棘突蛋白编码基因修饰间充质干细胞分别注入5只小鼠腹腔，每次注射100μl，每隔1-2周注射一次，注射3次；
B组注射生理盐水：用微量注射器把医用生理盐水分别注入另外5只小鼠腹腔，每次注射100μl，每隔1-2周注射一次，注射3次；
最后，分别取A、B组的小鼠血清，通过ELISA法检测中和抗体，其抗体检测情况如表1所示：
表1：中和抗体浓度检测结果
由上表数据可看出，注射本发明的新型疫苗，能够有效地对机体进行免疫，诱导机体产生针对棘突蛋白的中和抗体，并且抗体能够长期稳定保存在机体内，本发明的疫苗通过棘突蛋白的基因重组型间充质干细胞表达棘突蛋白来启动人体针对新型冠状病毒的免疫反应，产生病毒中和性抗体，从而避免病毒对人体的感染，安全、可靠、有效，具有良好的应用前景，为新型冠状病毒的预防提供了一个全新的选择。
以上所述仅为本发明的优选实施方式，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
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