具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有 指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理 解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，由于avian HEV的高变性，使得不同菌株同源性较低， 很难实现只免疫单一疫苗即可达到较好保护效果。

基于此，本发明选择两株不同来源且差异较大的禽戊型肝炎病毒，混合制备了亚单位 疫苗。这不仅解决了禽戊型肝炎疫苗的空白，也进一步扩大了疫苗的抗体保护范围。

本发明所选择的两株禽戊型肝炎病毒分别为VaHEV株和YT-aHEV株，其中：VaHEV株是从河北省某蛋鸡群鉴定的一株avian HEV，其全基因组序列已上传至NCBI GenBank，登录号为：MG976720.1；基于全基因组的遗传进化分析结果显示，VaHEV与所有目前已 知的avian HEVs不同，VaHEV处于一个单独的进化分支，属于新亚型。病鸡表现为产蛋 高峰期明显推迟，产蛋率下降约20％，病鸡胚胎孵化率下降18％以上。病死鸡剖检可见脾 脏肿大，肝脏出血肿大(图1)。

YT-aHEV株为从山东省某肉种鸡群分离的一株avian HEV，属于经典的基因3型，已完成全基因组测序及分析(NCBI GenBank，登录号为：MZ736614.1)。相关发病鸡群表 现典型的肝脾肿大与出血现象，发病高峰期为20周龄左右。

对上述两株不同来源的avian HEV进行同源性分析，结果显示两者之间全基因组核苷 酸序列同源性仅为82.2％，三个ORFs的核苷酸序列同源性分别为82.3％，81.7％，85.1％， 氨基酸序列同源性分别为86.3％，90.9％，72.4％。

本发明以YT-aHEV肉鸡株和VaHEV蛋鸡株为模板，设计了ORF2片段的引物，并进 行扩增和重组蛋白的表达，将VaHEV的ORF2重组蛋白和YT-aHEV的ORF2重组蛋白混 合，制备得到禽戊型肝炎病毒ORF2亚单位疫苗。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的 实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买 得到。

实施例1：重组蛋白的制备

针对VaHEV(蛋鸡来源)和YT-aHEV(肉鸡来源)的毒株序列，分别设计了ORF2 的扩增引物。其中，VaHEV株对应的上游引物序列和下游引物序列分别为：

Va-ORF2-F：5’-GGATTCATGTCGCTGCGTGGATTGCTG-3’；(SEQ ID NO.3)

Va-ORF2-R：5’-CTCGAGTTAGGGTGGTGAGGGGAATGT-3’。(SEQ ID NO.4)

YT-aHEV对应的上游引物序列和下游引物序列分别为：

YT-ORF2-F：5’-GGATTCATGTCGCTGCGTGGATTGCTG-3’；(SEQ ID NO.5)

YT-ORF2-R：5’-CTCGAGTTAGGGTGGTGAGGGAAATGT-3’。(SEQ ID NO.6)

Va-ORF2-F、Va-ORF2-R引物的扩增长度为1818bp，其序列如SEQ ID NO.7所示；YT-ORF2-F、YT-ORF2-R引物的扩增长度为1821bp，其序列如SEQ ID NO.8所示。

分别以Va-HEV株和YT-aHEV株全基因组质粒为模板，以Va-ORF2-F、Va-ORF2-R、YT-ORF2-F、YT-ORF2-R为引物，配制PCR体系，反应条件为预变性95℃5min，变性9 5℃30s，退火55℃30s，延伸72℃2min。扩增ORF2基因片段，扩增产物进行凝胶电泳分 析(图2，A)。扩增产物切胶回收目的片段，回收产物与酶切正确的片段(图2，B)连接在P ET-32a(+)表达载体上并转化入宿主菌Trans5α化学感受态细胞，挑取单个菌落，摇菌过 夜，并进行菌液PCR鉴定。鉴定为阳性的克隆送北京擎科生物科技有限公司进行序列测 定。

取测序正确的菌液接种于1.5ml液体LB培养基中(含100μg/ml氨苄青霉素)，37℃，220rpm，摇床培养过夜，次日将菌液加入200ml LB培养基中，37℃摇床摇菌约2h，检测 A₆₀₀OD值为0.8左右。加入IPTG，30℃摇床继续诱导6h，收集菌体，经超声破碎，离 心保留沉淀并溶解，取40μl溶解液与10μl 5×上样缓冲液混匀煮沸5min，-20℃迅速冷 却，10％SDS-PAGE电泳鉴定分析，确定电泳条带正确后(图2，C)，再用镍柱对目的蛋 白进行纯化(图2，D)。

通过上述方法分别制备得到VaHEV的ORF2重组蛋白和YT-aHEV的ORF2重组蛋白，其中，VaHEV的ORF2重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；YT-aHEV的ORF2 重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2：禽戊型肝炎病毒ORF2亚单位疫苗的制备

通过BCA蛋白定量法，对实施例1纯化好的VaHEV的ORF2重组蛋白和YT-aHEV 的ORF2重组蛋白进行定量，在波长562nm处，测定样品的吸光值，绘制标准曲线，计算 样品浓度。将VaHEV的ORF2重组蛋白和YT-aHEV的ORF2重组蛋白按照重量比1:1混 合后，然后将混合后的蛋白与弗氏完全佐剂按照1：1体积混合乳化，用三通注射器将二 者乳化完全(将免疫原滴一滴到冷水中，20min不扩散即为乳化完全)。保存于2-8℃， 备用。

对比例1：

将实施例1制备的YT-aHEV的ORF2重组蛋白与弗氏完全佐剂佐剂按照1：1体积混合乳化，YT-aHEV的ORF2重组蛋白的重量与实施例2中混合后的重组蛋白的重量相同， 用三通注射器将二者乳化完全(将免疫原滴一滴到冷水中，20min不扩散即为乳化完全)， 制备得到亚单位疫苗A。

对比例2：

将实施例1制备的VaHEV的ORF2重组蛋白与弗氏完全佐剂佐剂按照1：1体积混合，VaHEV的ORF2重组蛋白的重量与实施例2中混合后的重组蛋白的重量相同，用三通注 射器将二者乳化完全(将免疫原滴一滴到冷水中，20min不扩散即为乳化完全)，制备得 到亚单位疫苗B。

试验例1：

将1日龄SPF雏鸡随机分为4组，试验组各5只，空白对照组2只。试验1组为免疫 亚单位疫苗A，试验2组为免疫亚单位疫苗B，试验3组为免疫实施例2制备的禽戊型肝 炎病毒ORF2亚单位疫苗；空白对照组选用生理盐水。通过对鸡颈部皮下注射的方式进行 免疫试验，且每次免疫时将蛋白和佐剂进行1：1混匀。第一次免疫完成后间隔两周后进 行第二次免疫，且每次免疫完成后一周采血备用。两次免疫完成后用间接ELISA对保存 的鸡血清进行aHEV抗体检测(抗体检测所使用的试剂盒：Big Liver and Spleen Disease Antibodytest kit；厂家：Biocheck；生产系列编号：DRF070)，计算S/P值。S/P值大于 0.2判为抗体阳性。

通过ELISA试剂盒检测结果表明，SPF鸡两次免疫ORF2亚单位疫苗，均会产生抗体；与单独使用YT-aHEV的ORF2重组蛋白和单独使用VaHEV的ORF2重组蛋白制备的亚单 位疫苗相比，实施例2制备的禽戊型肝炎病毒ORF2亚单位疫苗在诱导抗体产生方面具有 更好的效果(表1)。

试验过程中鸡只生理状态正常，无发病或死亡情况，表明本发明所制备的亚单位疫苗 使用安全。

表1：免疫后抗体检测结果

试验例2：

对感染YT-aHEV的LMH细胞中蛋白的表达情况以间接免疫荧光方法检测。以免疫了YT-aHEV ORF2蛋白后采集的鸡血清作为一抗，分别用50×和100×两种不同稀释度， 利用FITC标记的兔抗鸡lgG抗体作为二抗。aHEV在感染LMH细胞时的荧光强度表示蛋 白的表达有无，在100×稀释下LMH细胞中可发现表达蛋白的特异性绿色荧光，说明鸡血 清中产生了ORF2抗体(图3)。证明免疫了YT-aHEV ORF2蛋白后，能够产生可识别病 毒的特异性抗体。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人 员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、 等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 禽戊型肝炎病毒ORF2亚单位疫苗

<130> 2021

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 605

<212> PRT

<213> VaHEV ORF2

<400> 1

Met Ser Ser Arg Gly Leu Leu Leu Met Leu Ala Met Cys Cys Gly Val

1 5 10 15

Ser Arg Gly Ser Gln Ala Leu Pro Ala Arg Asp Trp Arg Gly Gln Pro

20 25 30

Arg Arg Asp Asn Ser Ala Gln Trp Ser Ala Gln Glu Arg Pro Glu Gly

35 40 45

Ala Val Gly Pro Ala Ala Ser Thr Asp Val Val Thr Ala Ala Gly Thr

50 55 60

Arg Thr Val Pro Asp Val Asp Gln Ala Gly Ala Val Leu Val Arg Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Leu Val Thr Ser Pro Leu Gly Ser Ala Thr Leu Gly Ser Thr

85 90 95

Asn Ala Glu Leu Tyr Ala Ala Pro Val Ser Pro Leu Met Pro Leu Gln

100 105 110

Asp Gly Thr Thr Ser Asn Ile Met Ser Thr Glu Ser Ser Asn Tyr Ala

115 120 125

Gln Tyr Arg Val Arg Gly Leu Thr Val Arg Trp Arg Pro Val Val Pro

130 135 140

Asn Ala Val Gly Pro Phe Ser Ile Thr Met Ala Tyr Trp Pro Gln Thr

145 150 155 160

Thr Ser Thr Ala Thr Ser Ile Asp Met Asn Ser Ile Lys Ser Thr Asp

165 170 175

Val Arg Val Val Leu Gln Pro Gly Thr Ala Cys Leu Leu Thr Ile Pro

180 185 190

Pro Glu Arg Leu Asp Tyr Lys Asn Asn Gly Trp Arg Ser Val Glu Thr

195 200 205

Val Ser Val Pro Gln Glu Asp Ala Thr Ser Gly Met Leu Met Val Cys

210 215 220

Val His Gly Thr Pro Trp Asn Ser Tyr Thr Asn Thr Val Tyr Thr Ala

225 230 235 240

Pro Leu Gly Met Val Asp Phe Ala Ile Glu Leu Gln Leu Arg Asn Leu

245 250 255

Ser Pro Gly Asn Thr Tyr Ala Ser Val Ala Arg Val Lys Val Thr Ser

260 265 270

Pro His Thr Ile Lys Ala Asp Pro Thr Gly Ala Thr Ile Thr Thr Thr

275 280 285

Ala Ala Ala Arg Phe Met Ala Asp Val Arg Trp Gly Leu Gly Thr Ala

290 295 300

Asp Asp Gly Glu Ile Gly His Gly Ile Leu Gly Val Leu Phe Asn Leu

305 310 315 320

Ala Asp Thr Val Leu Gly Gly Leu Pro Ser Ala Leu Leu Ala Ala Ser

325 330 335

Gly Gln Tyr Met Tyr Gly Arg Pro Val Gly Asn Ala Asn Gly Glu Pro

340 345 350

Asp Val Lys Leu Tyr Met Ser Val Glu Asp Ala Val Asn Asp Lys Pro

355 360 365

Ile Met Val Pro His Asp Ile Asp Leu Gly Thr Ser Pro Val Thr Cys

370 375 380

Gln Asp Tyr Gly Asn Gln His Val Asp Asp Arg Pro Ser Pro Ala Pro

385 390 395 400

Ala Pro Asn Arg Ala Phe Gly Thr Leu Arg Ser Gly Asp Val Leu Arg

405 410 415

Ile Thr Gly Ser Met Gln Tyr Val Thr Lys Ala Glu Leu Leu Pro His

420 425 430

Ser Val Ser Gln Gly Tyr Phe Gly Ala Gly Asp Thr Met Met Val His

435 440 445

Asn Val Ile Thr Gly Val Arg Ala Pro Ala Ser Ser Val Glu Trp Thr

450 455 460

Lys Ala Thr Val Asp Gly Val Pro Val Lys Thr Val Asp Ala Ser Ser

465 470 475 480

Gly Ser Asn Ser Phe Ala Ala Leu Pro Ala Phe Gly Lys Pro Ala Val

485 490 495

Trp Glu Pro Gln Gly Ala Gly Tyr Phe Tyr Gln Tyr Asn Asn Thr His

500 505 510

Gln Glu Trp Ile Tyr Phe Leu Gln Asn Cys Ser Ser Val Val Trp Tyr

515 520 525

Ala Ser Thr Asn Met Leu Gly Gln Lys Ser Asp Thr Ser Ile Leu Leu

530 535 540

Glu Val Arg Pro Ile Gln Ala Ser Asp Gln Pro Trp Phe Leu Ala His

545 550 555 560

His Thr Gly Gly Asp Asp Cys Thr Thr Cys Leu Pro Leu Gly Leu Arg

565 570 575

Thr Cys Cys Arg Gln Ala Pro Glu Asp Gln Ser Pro Glu Thr Arg Arg

580 585 590

Leu Leu Asp Arg Leu Ser Lys Thr Phe Pro Ser Pro Pro

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<210> 2

<211> 606

<212> PRT

<213> YT-aHEV ORF2

<400> 2

Met Ser Leu Arg Gly Leu Leu Leu Met Leu Ala Met Cys Cys Gly Val

1 5 10 15

Ser Arg Gly Ser Gln Thr Leu Pro Ala Gly Ser Arg Arg Gly Gln Arg

20 25 30

Arg Arg Asp Asn Pro Ala Gln Trp Ser Ala Gln Gln Arg Pro Glu Gly

35 40 45

Ala Val Gly Pro Ala Pro Leu Thr Asp Val Val Thr Ala Ala Gly Thr

50 55 60

Arg Thr Val Pro Asp Val Asp Gln Ala Gly Ala Val Leu Val Arg Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Leu Val Thr Ser Pro Leu Gly Leu Ala Thr Leu Gly Ser Thr

85 90 95

Asn Ala Leu Leu Tyr Ala Ala Pro Val Ser Pro Leu Met Pro Leu Gln

100 105 110

Asp Gly Thr Thr Ser Asn Ile Met Ser Thr Glu Ser Ser Asn Tyr Ala

115 120 125

Gln Tyr Arg Val Gln Gly Leu Thr Val Arg Trp Arg Pro Val Val Pro

130 135 140

Asn Ala Val Gly Gly Ser Ser Ile Ser Met Ala Tyr Trp Pro Gln Thr

145 150 155 160

Thr Phe Tyr Pro His Ser Ile Asp Met Asn Ser Ile Thr Ser Thr Asp

165 170 175

Val Arg Val Val Leu Gln Pro Gly Ser Ala Gly Leu Leu Thr Ile Pro

180 185 190

His Glu Arg Leu Ala Tyr Lys Asn Asn Gly Trp Arg Ser Val Glu Thr

195 200 205

Val Ser Val Pro Gln Glu Asp Ala Thr Ser Gly Met Leu Met Val Cys

210 215 220

Val His Gly Thr Pro Trp Asn Ser Tyr Thr Asn Ser Val Cys Thr Gly

225 230 235 240

Pro Leu Gly Met Val Asp Phe Ala Ile Lys Leu Gln Leu Arg Asn Leu

245 250 255

Ser Pro Gly Asn Thr Asn Ala Arg Val Thr Arg Val Lys Val Thr Ala

260 265 270

Pro His Thr Ile Lys Ala Asp Pro Ser Gly Ala Thr Ile Thr Thr Ala

275 280 285

Ala Ala Ala Arg Phe Met Ala Asp Val Arg Trp Gly Leu Gly Val Ala

290 295 300

Glu Asp Gly Glu Ile Gly His Gly Ile Leu Gly Val Leu Phe Asn Leu

305 310 315 320

Ala Asp Thr Val Leu Gly Gly Leu Pro Ser Thr Leu Leu Arg Ala Ala

325 330 335

Ser Gly Gln Tyr Met Tyr Gly Arg Pro Val Gly Asn Ala Asn Gly Glu

340 345 350

Pro Glu Val Lys Leu Tyr Met Ser Val Glu Asp Ala Val Asn Asp Lys

355 360 365

Pro Ile Met Val Pro His Asp Ile Asp Leu Gly Thr Ser Thr Val Thr

370 375 380

Cys Gln Asp Tyr Gly Asn Gln His Val Asp Asp Arg Pro Ser Pro Ala

385 390 395 400

Pro Ala Pro Lys Arg Ala Leu Gly Thr Leu Arg Ser Gly Asp Val Leu

405 410 415

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Gln Ser Val Ser Gln Gly Tyr Phe Gly Ala Gly Ser Thr Met Met Val

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Ser Gly Ser Asn Arg Phe Ala Ala Leu Pro Ala Phe Gly Lys Pro Ala

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545 550 555 560

His His Thr Gly Gly Asp Asp Cys Thr Thr Cys Leu Pro Leu Gly Leu

565 570 575

Arg Thr Cys Cys Arg Gln Ala Pro Glu Asp Gln Ser Pro Glu Thr Arg

580 585 590

Arg Leu Leu Asp Arg Leu Ser Arg Thr Phe Pro Ser Pro Pro

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<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

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<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

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ctcgagttag ggtggtgagg ggaatgt 27

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<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggattcatgt cgctgcgtgg attgctg 27

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctcgagttag ggtggtgagg gaaatgt 27

<210> 7

<211> 1818

<212> DNA

<213> VaHEV ORF2

<400> 7

atgtcgtcgc gtggattgct gctcatgctt gcaatgtgct gcggggtgtc aaggggctcc 60

caagcgctcc cagcccgaga ttggcgcggc caaccccgcc gcgacaactc agcacagtgg 120

agcgctcaag aacgccctga aggagccgtc ggcccagctg cttccactga tgttgtcacc 180

gcggcaggta ctcgcacggt accagatgta gatcaggccg gcgctgtgct ggtgcgccag 240

tacaatctag tgacgagtcc cctggggtcg gccaccctcg gtagcactaa tgctgaactt 300

tatgctgcac cggtttcgcc gttaatgcca cttcaggacg gcacgacgtc taatattatg 360

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ccggttgtgc cgaatgctgt cggtcccttt tccatcacca tggcttactg gcctcagaca 480

acgtccacgg ccacgagtat tgatatgaat tctatcaagt ccactgatgt tcgagttgtg 540

cttcagcccg gtaccgcgtg tttgctgacc ataccacctg agcgcctgga ctacaagaat 600

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ctcatggttt gcgttcatgg gacaccctgg aacagttaca ccaatacagt ttataccgcg 720

ccgcttggga tggttgactt cgccatagag cttcagttgc ggaatctgtc acccggtaac 780

acttatgcca gtgttgcccg tgttaaggtt acgtccccac atactatcaa ggcggacccg 840

actggtgcta cgataactac tactgctgcg gcaaggttca tggcggatgt acgttggggt 900

ctgggtactg ctgatgatgg tgagattggc catggtatac taggtgtcct gtttaacctt 960

gctgatacag ttctcggcgg cctgccctca gcattgttgg cagccagtgg ccagtatatg 1020

tacggtcggc ccgttgggaa cgccaatggc gagccggatg tgaaacttta tatgtcagta 1080

gaggatgccg ttaatgataa gcctattatg gtcccacatg acatcgacct tggaactagc 1140

cctgtcactt gccaggatta tgggaaccag catgtggatg atcgcccgtc cccggctccg 1200

gcccccaatc gcgcttttgg tactctgcgg tcaggtgacg tgttgcgtat caccggctcg 1260

atgcagtatg tgactaaggc tgagctacta ccacatagtg tgtcgcaggg ctactttggg 1320

gccggtgaca ccatgatggt gcataatgtg attactggtg tgcgtgcccc tgctagttcg 1380

gtggagtgga ccaaggccac ggtggatgga gtcccggtca agaccgtcga tgctagttct 1440

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<210> 8

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<213> YT-aHEV ORF2

<400> 8

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caaacgctcc cagcaggaag caggcgcggt caacgccgcc gtgacaaccc agcccagtgg 120

agcgctcaac aacgccccga aggagccgtc ggccccgccc ctcttaccga cgttgtcacc 180

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tataatctcg tgaccagccc gcttgggctg gccacccttg gcagcactaa tgccctgctt 300

tacgctgcgc cggtgtcacc gttaatgcca cttcaggacg gtacaacatc caatataatg 360

agcacggaat ctagcaatta tgctcagtac cgtgtgcagg gtctgaccgt tcgctggcgg 420

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acattttacc cccacagcat agatatgaat tctattacat ccaccgacgt tcgtgtcgtg 540

cttcaaccag gttcggccgg cttgttaacc ataccgcatg aacgtttggc atacaagaat 600

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ctcatggttt gtgtccacgg tacaccctgg aacagttaca caaatagtgt gtgcaccggg 720

ccgctcggta tggttgactt tgctataaag cttcagttga ggaatttatc tcctggtaac 780

actaatgcta gggtcacccg tgtcaaggtg acagcccctc acactatcaa ggctgacccg 840

tcaggcgcca ccataacaac tgccgctgcg gctcggttta tggctgatgt gcgctggggt 900

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