具体实施方式

以下对于本发明的胶囊蛋白质，示出附图以及实施例进行说明。另外，以下的说明例示了本发明的一实施方式以及一实施例，本发明不受以下的说明所限。以下的说明可在不脱离本发明的技术思想的范围内改变。

本发明的胶囊蛋白质将人脂质运载蛋白型前列腺素D合成酶(L-PGDS)作为基础。表1中，示出了L-PGDS的氨基酸序列(序列编号1)。L-PGDS由从N末端的丙氨酸起第168个的谷氨酰胺为止的168个氨基酸构成。

[表1]

将使大肠杆菌转化而得的L-PGDS称为“突变体L-PGDS”或简称为“突变体”。表2中，示出了突变体L-PGDS的氨基酸序列(序列编号2)。为了便于人工制造，在N末端上添加甘氨酸-丝氨酸(GS)，与表1的情况相比，增加了2个氨基酸。以下，在指定突变体L-PGDS的氨基酸的情况下，用在L-PGDS的序列的N末端上添加甘氨酸-丝氨酸(GS)的序列表示。

[表2]

突变体L-PGDS由于丧失了酶活性位点，从N末端起第45个(序列编号1中为第43个)的半胱氨酸(C)被丙氨酸(A)取代。此外，为了防止产生不正确的二硫键，第147个(序列编号1中为第145个)的半胱氨酸(C)也被丙氨酸(A)取代。表2(以下的胶囊蛋白质的序列中也相同。)中，这2处用矩形包围。该突变体L-PGDS也称为“C45A/C147A”。

图1中示出了突变体L-PGDS的晶体结构。把图1(a)旋转90°的状态示于图1(b)。另外，L-PGDS也是相同形状。此外，图2中，示出了突变体L-PGDS(C45A/C147A)的氨基酸序列(序列编号2)与β链以及α螺旋的对应。

突变体L-PGDS具有从符号A到H的8根β链、和从符号H1到符号H3的α螺旋。另外，β链之间存在环，存在短链I和短螺旋H4、H5。

β链A到β链H以在中心部包围空间的方式配置为螺旋形状。将其称为桶状结构。在突变体L-PGDS保持药物时，认为药物收纳于桶状结构内。此外，参照图1(b)，在β链D和α螺旋H2之间形成有针对桶状结构的大开口10。

如果开口10就这样打开，则即使药物一度被收纳，其在到达规定的细胞前被释放的可能性也很高。于是，在开口10设有盖(专利文献4)。此处，连结β链E和β链F的环(称为“E-F环”。)与α螺旋H2之间产生二硫键。

再次参照图2，E-F环是突变体L-PGDS的从N末端起第90个的脯氨酸(P)到第93个的甘氨酸(G)为止的4个氨基酸。此外，α螺旋H2同样地是从N末端起到第32个的丝氨酸(S)到第41个的丙氨酸(A)为止的10个氨基酸。通过将这些中的之一变更为半胱氨酸(C)，可得到二硫键。将其称为“二硫回形针”或者“D回形针”。

例如，图3中，示出了将α螺旋H2的赖氨酸(从N末端起第38个的K)和E-F环的组氨酸(H)分别用半胱氨酸(C)取代了的突变体L-PGDS的建模结构。已知通过半胱氨酸(C)之间形成的二硫回形针12，开口10的一部分被关闭。该突变体L-PGDS称为“D回形针突变体”。专利文献4中，公开了D回形针突变体。

但是，已知二硫回形针12将开口10的端部夹住，收容于桶状结构内部的药物从二硫回形针12和β链D的间隙14被释放。于是，为了阻塞β链D上的间隙14，本发明中，设有隔断氨基酸。隔断氨基酸是指可减少开口10的面积的氨基酸。通过设有隔断氨基酸，不仅阻塞了间隙14，还能够有效地使开口10狭窄。

再次参照图2，β链D是突变体L-PGDS的从N末端起第68个的谷氨酰胺(Q)到第78个的脯氨酸(P)的11个氨基酸序列。隔断氨基酸理想的是具有在空间上占大范围的官能团。这是为了尽可能阻塞间隙14。此外，通过在β链D上导入隔断氨基酸，需要突变体L-PGDS的晶体结构没有大的变化。这是由于需要维持桶状结构。

例如，隔断氨基酸可合适地使用赖氨酸(K)、组氨酸(H)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)等。此外，取代也可以不止1处。此外，隔断氨基酸也可以插入到构成β链的氨基酸序列中。

图4中，示出了β链D上的甲硫氨酸(M：从N末端起第74个，参照图2)取代为色氨酸(W)的突变体L-PGDS的建模结构。图中作为“74W”示出。示出了通过在β链D上配置色氨酸，间隙14被阻塞的状态。将这样设有隔断氨基酸的突变体L-PGDS称为“带隔断的突变体”。

另外，带隔断的突变体中也可设有二硫回形针。将同时设有隔断氨基酸和二硫回形针的突变体L-PGDS称为“带隔断的D回形针突变体”。

而且，如专利文献3所示，可在N末端或者C末端或两个末端上附加识别靶细胞的肽(标识肽)。此外，不仅可附加在末端部分上，也可以使一部分重叠。对标识肽没有特别限定，例如可选择特异性结合在新生血管内皮细胞中表达的膜蛋白质(CD13)的肽序列NGR。此外，可以是识别αvβ3以及αvβ5整合素的内化-Arg-Gly-Asp(iRGD)基序，也可以是识别神经毡蛋白1的Cys-Arg-Gly-Asp-Lys(CRGDK)基序。

此外，也可合适地使用识别胃癌的腹膜肿瘤的Lys-Leu-Pro(KLP)基序(CancerRes，97，1075-81，2006)、识别转移性癌细胞的Asn-Val-Val-Arg-Gln(NVVRQ)基序(Cl inCancer Res，14，5494-502，2008)、识别肝癌细胞的Phe-Gln-His-Pro-Ser-Phe-I le(FQHPSFI)基序(Mol Med，13，246-54，2007)等。

将作为本发明的胶囊蛋白质的、在带隔断的突变体上附加了标识肽的称为“标识了的带隔断的突变体”。此外，将还附加了二硫回形针的称为“标识了的带隔断的D回形针突变体”。此外，本发明的胶囊蛋白质中，为了便于通过基因重组来制造，在上述的GS以外，多个的氨基酸也可结合在N末端或者C末端。

本发明的胶囊蛋白质可将约800Da左右为止大小的化合物放入桶状结构。此处化合物是指药物或其它化合物。此处，其它化合物是指作为辅助营养的化合物，也可指来源于天然物的化合物。

此外，已知DDS中，由于EPR(Enhanced Permeability and Retention)效果，在提高对癌细胞的侵入的选择性的同时，残留期间变长，可期待长期药物效果。因此，作为本发明的胶囊蛋白质的带隔断的突变体也可制成多聚体组合物使用。另外，为了期待EPR效果，整体的大小可设为10nm以上的大小。此外，也可在多聚体组合物上附加标识肽。

在将胶囊蛋白质制成多聚体组合物的情况下，可合适地使用将多个的胶囊蛋白质的C末端与N末端之间结合、直线连接的多聚体组合物。但是，如果能够放射状连接胶囊蛋白质，则是更优选的。图5中示出了本发明所采用的胶囊蛋白质的多聚体组合物的结构的概念图。

图5(a)中示出了胶囊蛋白质的多聚体组合物(以下简称为“多聚体组合物”。)的概念图。图5(b)是多聚体组合物21的一部分分解图。多聚体组合物21是在链霉亲和素30的四聚体32上通过生物素38结合二聚体36形成的形状，其中，二聚体36是胶囊蛋白质34通过连接基35结合而成的二聚体。因此，多聚体组合物21形成胶囊蛋白质34的八聚体组合物。

胶囊蛋白质34可合适地使用突变体L-PGDS、或者带隔断的突变体。此处，对使用带隔断的突变体的情况进行说明。

如果生物素38和链霉亲和素30的结合的解离定数(Kd)是10^-15M，则这是已知的蛋白质和配体之间的非共价结合性相互作用中最强的。此外，该相互作用形成得非常迅速，形成后不易受pH、温度、变性剂，以及有机溶剂等的影响。此外，由于生物素是低分子，因此不阻碍修饰的分子的功能性。因此，认为图5(a)所示的八聚体非常稳定地存在。

另外，图5(c)中，示出了在链霉亲和素30的四聚体32中，介由生物素38，结合了胶囊蛋白质34的单体的多聚体组合物22。这形成了胶囊蛋白质34的四聚体。

如后所述，胶囊蛋白质34的八聚体的多聚体组合物21的直径在10nm以上，比四聚体或单体大。因此，能够从与正常细胞相比在内皮细胞之间产生较大间隙的癌细胞中的血管进入癌细胞内，但在正常细胞中不易穿透漏出。因此，在癌细胞中选择性侵入、残留在内部，发挥了所谓的EPR效果。

本发明的多聚体组合物21(胶囊蛋白质34形成八聚体而成)中，认为胶囊蛋白质的单体在后述的体内实验中显示出明显不同的效果，发挥了EPR效果。

胶囊蛋白质在放入药物或其它化合物的基础上，还是可溶性的。作为多聚体组合物，该作用不变。因此，胶囊蛋白质可合适地用于将难溶性的药物、或难溶性的维生素等可溶化。例如，可合适地使用SN-38、维生素A、D、E、K、甲状腺激素类、类固醇激素类、异黄酮类等。此外，由于可将难溶性的物质可溶化，因此可降低药物开发中可溶化的门槛。

本发明的胶囊蛋白质中含有药物的医药组合物(以下简称为“医药组合物”。)能够以液体状提供。此外，也可通过冻干，作为粉末提供。在冻干的情况下，效果维持如专利文献3所示。

因此，在将本发明的医药组合物用于治疗的情况下，能够以经口或非经口的(例如，静脈内、皮下、或肌肉注射，局部的、经直肠的、经皮的、或经鼻的)方式给药。作为用于经口给药的组合物，例如可例举片剂、胶囊、丸剂、颗粒剂、粉剂、液体、悬浮液等。

此外，作为用于非经口给药的组合物，例如可例举注射用水性剂、或油性剂、软膏剂、霜剂、乳液剂、气雾剂、栓剂、粘贴剂等。这些制剂使用以往公知的技术进行制备，可含有制剂领域中通常使用的无毒性且惰性的运载体或者赋形剂。

此外，还能将在胶囊蛋白质中放入药物或者药物以外的化合物而成的复合物作为加工食品提供。作为加工食品，例如不仅包括糖果、口香糖、果冻、饼干、曲奇、年糕、面包、面条、鱼肉和畜肉产品、茶、软饮料、咖啡饮料、乳饮料、乳清饮料、乳酸菌饮料、酸奶、冰淇淋、布丁等嗜好食品或健康食品的一般加工食品，也包括日本厚生劳动省的保健功能食品制度中规定的特定保健用食品或营养功能食品等保健功能食品，而且在加工食品中还包括营养辅助食品(补充剂)、饲料、食品添加物等。而且，利用使难溶性物质可溶的性质，也可以作为工业产品或工业原材料使用。

在这些加工食品的原料中，可通过添加含有其它化合物的胶囊蛋白质(复合物)，制备本发明的加工食品。另外，胶囊蛋白质由于作为蛋白质的带隔断的突变体包裹有其它化合物，因此遇热易分解。因此，本发明的加工食品理想的是在添加复合物后，通过不进行加热工序的工序来完成。

实施例

作为样品用的胶囊蛋白质，制造了

(1)突变体L-PGDS

(2)标识了的突变体L-PGDS

(3)带隔断的D回形针突变体

(4)标识了的带隔断的D回形针突变体

这四种。

突变体L-PGDS是在序列编号2所示的胶囊蛋白质中，将从N末端起第45个的半胱氨酸(C)取代为丙氨酸(A)，将第147个的半胱氨酸(C)取代为丙氨酸(A)而成的(“C45A/C147A”)。突变体L-PGDS使活性位点失活，制造的过程中，将第147个的半胱氨酸(C)取代为丙氨酸(A)，以不产生不正确的二硫键。

标识了的突变体L-PGDS是在突变体L-PGDS上，作为标识，在C末端上附加了同时能够实现向肿瘤的集积和细胞膜穿透的iRGD肽(CRGDKGPDC：序列编号3)而成的。

其中，以与突变体L-PGDS的C末端的一部分重叠的方式附加。这是为了在之后小鼠的体内实验中，消除对小鼠的抗原性。标识了的突变体L-PGDS的氨基酸序列作为序列编号4在表4中示出。标识肽的部分用“■”表示。另外，图6中示出了标识为突变体L-PGDS的突变体L-PGDS的建模结构。[表3]

[表4]

带隔断的D回形针突变体中，首先作为隔断氨基酸，β链D上的甲硫氨酸(M)取代为色氨酸(W)。甲硫氨酸是突变体L-PGDS的从N末端起第74个。

带隔断的D回形针突变体是进一步附加D回形针而成的。D回形针是将突变体L-PGDS的从N末端起第38个的赖氨酸(K)取代为半胱氨酸(C)、第91个的组氨酸(H)取代为半胱氨酸(C)而成的。氨基酸序列示于表5(序列编号5)。在表5中，隔断氨基酸用“▲”表示，D回形针(二硫键)用“★”表示。在用“★”表示的2个半胱氨酸(C)之间产生二硫键。另外，二硫键在还原环境下被分离，开口10可通过D回形针来打开或关闭。

[表5]

标识了的带隔断的D回形针突变体是在带隔断的D回形针突变体(序列编号5)上，在C末端上重叠附加iRGD肽(CRGDKGPDC)而成的。在表6中，隔断氨基酸用“▲”表示，D回形针(二硫键)用“★”表示。此外，标识肽的部分用“■”表示。图7是表示标识为带隔断的D回形针突变体的带隔断的D回形针突变体的建模结构的图。

[表6]

各个胶囊蛋白质在通过超级引物法制造经设计的表达质粒后，转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)株，使其作为与谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase)的融合蛋白质表达。

蛋白质表达株在LB/Amp试验管培养基中，在37℃条件下振荡培养8小时后，在2×YT/Amp自动振荡(auto induction)培养基中继代培养，在37℃下振荡培养16小时。对得到的菌体进行超声波粉碎，将粉碎液上清供至谷胱甘肽-琼脂糖(Glutathione-Sepharose)4B柱，进行亲和层析。

使吸附在柱上的融合蛋白质与165单位的凝血酶(thrombin)反应一夜，洗脱目的蛋白质，纯化。

接着，使这些胶囊蛋白质含有SN-38。SN-38是水难溶性抗癌剂7-乙基-10-羟基喜树碱的简称。已知其与目前临床所使用的作为SN-38的前药的盐酸伊立替康相比，显示出低用量且高抗肿瘤效果。

<药物释放能力>

对于SN-38浓度50μM、胶囊蛋白质浓度调整为50μM的SN-38/突变体L-PGDS、以及SN-38/带隔断的D回形针突变体、SN-38/标识了的带隔断的D回形针突变体各5mL，使用透析膜(Dialysis Membrane，Size 27 Wako截留分子量：14,000)，将150mL的PBS作为外液，在37℃的恒温箱内透析72小时。

采样透析开始后0、1、3、6、8、12、24、36、48、60、72小时中的外液500μL，加入同等量的PBS来代替。使用分光荧光光度计F-7000(HITACHI)测定采样的外液中的SN-38浓度(激发波长：365nm，测定波长：380-600nm，测定温度：37℃)。

接着，通过与前述相同的平衡透析法，评价带隔断的D回形针突变体、以及标识了的带隔断的D回形针突变体的在还原环境下响应的药物释放功能。作为外液，使用PBS以及10mM DTT/PBS进行透析，外液为PBS的情况作为氧化环境，添加DTT的情况下作为还原环境。

将透析外液中的经时的SN-38浓度变化相对于透析时间做图的结果示于图8。横轴是反应时间(小时)，纵轴是SN-38浓度(nM)。误差条用平均±标准差(n＝3)表示。此外，图中的简称中，“SN-38/L-PGDS(“●”)”表示SN-38/突变体L-PGDS，“SN-38/Capsule(▲)”表示SN-38/带隔断的D回形针突变体，“SN-38/Cap-sCRGDK(■)”表示SN-38/标识了的带隔断的D回形针突变体。另外，“SN-38/Capsule”以及“SN-38/Cap-sCRGDK”中，对于“+10mM DTT(“△”以及“□”)”是指在分别的医药组合物溶液中添加10mM的DTT的情况。通过DTT(Dithiothreitol：二硫苏糖醇)的添加，将溶液制成强还原环境。

参照图8，在外液为PBS的情况下，从透析开始所有的时间中，带隔断的D回形针突变体(SN-38/Capsule)、以及标识了的带隔断的D回形针突变体(SN-38/Cap-sCRGDK)中的外液的SN-38浓度与突变体L-PGDS(SN-38/L-PGDS)相比显著较低，判断与从SN-38/突变体L-PGDS的释放相比，从SN-38/带隔断的D回形针突变体、以及SN-38/标识了的带隔断的D回形针突变体的SN-38的释放被抑制。

另一方面，在外液为DTT/PBS的情况下，带隔断的D回形针突变体(SN-38/Capsule：“△”)、以及标识了的带隔断的D回形针突变体(SN-38/Cap-sCRGDK：“□”)与为PBS的情况相比，外液的SN-38浓度上升。

以上显示，与突变体L-PGDS相比，带隔断的D回形针突变体、以及标识了的带隔断的D回形针突变体在氧化环境中在更长时间内保持SN-38，响应于还原环境，释放SN-38。此外，显示出在带隔断的D回形针突变体、以及标识了的带隔断的D回形针突变体中，药物释放形式没有差别，因此标识肽的附加对控制药物释放没有影响。

接着，对于没有D回形针的、带隔断的突变体(M74W)和突变体L-PGDS，进行相同的实验。突变体L-PGDS进行图8的情况的重复实验。结果示于图9。图9(a)是为突变体L-PGDS的情况，图9(b)是为带隔断的突变体(M74W)的情况。参照图9(a)以及图9(b)，横轴是反应时间(小时)，纵轴是SN-38浓度(μM)。

参照图9(a)，针对外液为PBS(黑圆“●”)的情况的反应时间的SN-38的浓度与图8的情况下几乎相同，可知图8的实验获得了良好的复现。突变体L-PGDS中，外液为DTT/PBS的情况(白圆“○”)下，在短反应时间内SN-38的浓度达到2.0μM，观察到几乎达到稳定期。

与此相对，参照图9(b)，在外液为PBS的情况下(黑圆“●”)，SN-38的浓度即使经过了反应时间，也没有超过1.0μM，与图8所示的突变体L-PGDS、带隔断的D回形针突变体或标识了的带隔断的D回形针突变体的情况相比，SN-38的释放被抑制。

另一方面，在外液为DTT/PBS的情况下(白圆“○”)，透析时间48小时内SN-38浓度几乎达到2.0μM。该值是与图8所示的带隔断的D回形针突变体或标识了的带隔断的D回形针突变体的情况为几乎相同的浓度。总之，可知，带隔断的突变体具有比带隔断的D回形针突变体或标识了的带隔断的D回形针突变体更优良的药物保持能力。此外，可确认在还原气氛下，带隔断的突变体几乎能够像其它胶囊蛋白质一样地释放所包含的药物。

接着，将药物由SN-38变更为作为水难溶性的抗心绞痛药的双嘧达莫来进行相同的实验的结果示于图10。另外，外液是PBS。参照图10，横轴是反应时间(小时)，左纵轴是双嘧达莫浓度(nM)。另外，右纵轴是将左纵轴换算为释放率(％)的轴。突变体L-PGDS中，双嘧达莫浓度随着反应时间上升，与此相对，隔断突变体(M74W)中，双嘧达莫浓度仅上升到接近检测限。

藉此，可知带隔断的突变体对所包含的药物的保持能力优良，根据药物而不同，可几乎不漏出地保持。这样可以说，进入体内、到实现细胞内的还原气氛为止，能够持续保持所包含的药物，作为DDS而言是高效的。

<体内效果>

在控制为室温、12小时明暗循环的动物室中，使4周龄的雄性BALB/C-nu/nu小鼠(日本SLC)自由饮水、喂食，饲养1周，使其适应。之后，通过在右侧腹部皮下给予100μL的5×10⁷个细胞/mL(PBS：基质胶＝1：1)的人前列腺癌细胞PC-3，制作前列腺癌模型小鼠。

肿瘤体积(近似式：通过{(长径)×(短径)2}/2计算)达到250mm³的日子作为给药开始第0天，将小鼠随机分类为PBS、SN-38/突变体L-PGDS(2.0mg/kg/d)、SN-38/标识了的突变体L-PGDS(2.0mg/kg/d)、SN-38/带隔断的D回形针突变体(2.0mg/kg/d)、SN-38/标识了的带隔断的D回形针突变体(2.0mg/kg/d)的各给药组，每隔一天从尾静脉给予每个样品总共8次。另外，对照组仅给予PBS。

图11中示出了体内抗肿瘤实验的结果。横轴是从给药第0天起的经过天数(天)，纵轴是肿瘤体积(mm³)。图表中的简称如下。

PBS：对照组

SN-38/L-PGDS：SN-38/突变体L-PGDS

SN-38/L-PGDS-sCRGDK：SN-38/标识了的突变体L-PGDS

SN-38/Capsule：SN-38/带隔断的D回形针突变体

SN-38/Cap-sCRGDK：标识了的带隔断的D回形针突变体

PBS给药组中，不能确认抗肿瘤效果，从给药开始日起肿瘤体积持续增加。与此相对，SN-38/L-PGDS、SN-38/L-PGDS-sCRGDK、SN-38/Capsule、以及SN-38/Cap-sCRGDK给药组中，确认了显著的肿瘤生长抑制。

此外，SN-38/Capsule、以及SN-38/L-PGDS-sCRGDK给药组中，与SN-38/L-PGDS给药组相比，没有观察到明显的肿瘤生长抑制。由此，判断在仅附加了靶向、以及释放控制功能的任一方的情况下，与突变体L-PGDS相比，没有获得明显高的抗肿瘤活性。

另一方面，与SN-38/L-PGDS(突变体L-PGDS)相比，SN-38/Cap-sCRGDK(标识了的带隔断的D回形针突变体)显示出明显的高抗肿瘤活性。由以上的结果可知，通过药物释放控制功能(隔断氨基酸以及D回形针)，以及癌靶向功能(标识肽)的2个功能的协同效果，能够显著抑制肿瘤生长。

<多聚体>

接着，对胶囊蛋白质的多聚体组合物(八聚体组合物)的制造进行说明。如图5所说明的，八聚体组合物是在链霉亲和素30的四聚体32上通过生物素38结合二聚体36形成的形状，其中，二聚体36是胶囊蛋白质34通过连接基35结合而成的二聚体。

因此，在产生胶囊蛋白质的二聚体上结合了生物素的生物素化二聚体组合物后，将其与另外产生的链霉亲和素的四聚体结合，得到胶囊蛋白质的八聚体组合物。另外，连接基由表7所示的碱基序列(序列编号7)编码。此外，链霉亲和素由表8所示的碱基序列(序列编号8)编码。

[表7]

[表8]

<二聚体L-PGDS表达载体的制作>

对带隔断的突变体的基因序列，使用包含Bam HI识别位点的正向引物、以及包含Eco RI识别位点和连接基序列(GGGGS：序列编号7)的反相引物，通过PCR扩增，进行琼脂糖凝胶电泳。对其使用Bam HI、以及Eco RI，将经限制酶处理的序列作为带隔断的突变插入。

另外，带隔断的突变体中，将从N末端起第45个的半胱氨酸(C)取代为丙氨酸(A)、第147个的半胱氨酸(C)取代为丙氨酸(A)(“C45A/C147A”)，而且，作为隔断氨基酸，是将β链D上的甲硫氨酸(M)取代为色氨酸(W)而成的(“M74W”)。甲硫氨酸是突变体L-PGDS的从N末端起第74个。带隔断的突变体的氨基酸序列(序列编号9)示于表9。

[表9]

此外，相同地，准备经限制酶处理质粒(pGEX4T-2)。对带隔断的突变插入以及经限制酶处理的pGEX4T-2分别进行琼脂糖凝胶电泳。

分别进行溴化乙锭染色后，通过切出凝胶，使用琼脂糖凝胶提取试剂盒(AgaroseGel Extraction Kit)(Jene Bioscience)分别提取DNA，进行连接。在该操作中，将编码带隔断的突变体和与连接基结合的序列的碱基序列插入到质粒pGEX4T-2中。该质粒称为带隔断的突变体表达载体。

使用得到的带隔断的突变体表达载体，对大肠杆菌DH5α(DE3)株进行转化，接种到LB/Amp平板培养基中。对于平板培养基中生长的菌落，进行菌落直接PCR。将确认带隔断的突变体的存在的菌落接种到LB/Amp试验管培养基(5mL)中，在37℃下培养16小时。之后，使用SV Minipreps(promega)，进行迷你制备层析(ミニプレップ)，纯化带隔断的突变体表达载体。

进行得到的带隔断的突变体表达载体的测序，确认编码带隔断的突变体和连接基的碱基序列被插入。

该带隔断的突变体表达载体中，使用包含Eco RI以及SalI识别位点的引物，以相同程序整合扩增后的带隔断的突变插入。之后，以相同的程序转化大肠杆菌DH5α(DE3)株，培养、扩增后，纯化质粒。该质粒包括编码二聚体部分的带隔断的突变体的碱基序列。因此，该质粒称为二聚体带隔断的突变体表达载体。对得到的二聚体带隔断的突变体表达载体进行测序，确认碱基序列。

<经修饰的二聚体L-PGDS表达载体的制作>

接着，以编码生物素连接酶(BirA)特异性识别的15个氨基酸残基(Avitag^TM，以下称为“Av”。)的方式使用序列编号10以及11的互补的寡DNA，进行退火。生物素连接酶在肽Av的赖氨酸残基上，与生物素结合。碱基序列分别示于表10以及表11。之后，使用纯化用柱FastGene Gel/PCR提取试剂盒(日本遗传学公司(Nippon genetics)，东京)，纯化退火产物。该碱基序列称为Av碱基序列。

[表10]

[表11]

将二聚体带隔断的突变体表达载体使用Bam HI进行限制酶切断后(37℃，3小时)，进行琼脂糖凝胶电泳。之后，提取二聚体带隔断的突变体表达载体的DNA，通过In Fusion(注册商标)HD克隆试剂盒(克隆泰克公司(Clontech))，在Bam HI的切断位置上插入Av碱基序列。将在二聚体带隔断的突变体表达载体中插入Av碱基序列而成的载体称为经修饰的二聚体带隔断的突变体表达载体。对得到的载体进行测序，确认目的序列的插入。

<二聚体带隔断的突变体表达株>

通过经修饰的二聚体带隔断的突变体表达载体，对表达BirA的大肠杆菌株AVB101株进行转化，得到二聚体带隔断的突变体表达株。将二聚体带隔断的突变体表达株接种于LB/Amp/Chl液体培养基5ml，37℃下振荡培养一夜。接着，在2×YT/Amp/Chl培养基1L中传代，在37℃下培养。

另外，表达BirA的大肠杆菌株AVB101株是注入了插入有编码BirA的碱基序列的表达载体的大肠杆菌株。

<生物素化二聚体带隔断的突变体的产生>

在二聚体带隔断的突变体表达株的培养液的OD600的值达到0.6-1.0的时刻，添加IPTG(终浓度0.1mM)、以及生物素(终浓度50μM)。通过该操作，在大肠杆菌的体内，表达经修饰的二聚体带隔断的突变体和BirA这两个蛋白质。然后，BirA使二聚体带隔断的突变体中追加的肽Av与生物素结合。其结果是，诱导了二聚体带隔断的突变体的生物素化。

之后，在37℃下培养6小时，对培养液进行离心分离(8，400×g，10分钟，4℃)，回收菌体。然后，用PBS清洗菌体，通过离心分离收集细菌，对菌体进行超声波粉碎。

将分注了谷胱甘肽-琼脂糖4B(GE医疗生物科学(GE Helthcare Bio Science)，英国)15ml的亲和柱用通过了0.22μm滤器的柱体积的5倍量的PBS进行平衡，提供通过了0.22μm滤器的粉碎上清液。

用柱体积的3倍量的1％Triton X-100/PBS、以及5倍量的PBS清洗后，加入165单位的凝血酶(thrombin)(西格玛公司(SIGMA))充分搅拌，在室温下静置12小时以上。用柱体积的5倍量的PBS进行洗脱，使用截留分子量10kDa的浓缩器，重复离心分离(8400g，20分钟，4℃)，浓缩为4ml。

接着，用通过0.22μm滤器的5mM Tris-HCl(pH8.0)脱气10分钟，通过2倍量的相同缓冲液，用Superdex 75 16/600(GE医疗生物科学，英国)进行平衡。将浓缩液通过0.22μm滤器，添加到Superdex 75 16/600中。一边监控紫外线波长280nm下的吸光度，一边以0.5ml/分钟的流速，将洗脱液截留为各1.5ml，回收相当于生物素化二聚体L-PGDS的峰的部分。

将回收的部分合并，用20mM乙酸钠(Na-acetate)缓冲液(pH5.5)进行透析后，使用截留分子量10kDa的浓缩器，重复离心分离(8400g，20分钟，4℃)，浓缩至4ml。

将其供至填充了SP琼脂糖凝胶FF(SP sepharose Fast Flow)(GE医疗生物科学，英国)的柱中，进行使用20mM乙酸钠(Na-acetate)缓冲液(pH5.5)→1M NaCl/20mM乙酸钠缓冲液(pH5.5)的线性渐变法的阳离子交换色谱。

一边监控紫外线波长280nm下的吸光度，一边以1.0ml/分钟的流速，将洗脱液截留为各1.5ml。之后，进行SDS-PAGE分析，回收确认为生物素化二聚体带隔断的突变体的单一条带的部分。

<链霉亲和素的纯化>

用链霉亲和素表达载体(pET21a-Streptavidin-Alive，Addgene)转化大肠杆菌BL21(DE3)株，得到链霉亲和素表达株。将链霉亲和素表达株接种于LB/Amp液体培养基5ml，37℃下振荡培养一夜。接着，在2×YT/Amp培养基1L中传代，在37℃下培养。之后，在OD600的值达到0.6-1.0的时刻，添加IPTG，以使终浓度达到0.1mM，诱导表达。然后，在18℃下培养24小时后，对培养液进行离心分离(8400×g，10分钟，4℃)，回收菌体。

在得到的菌体中加入PBS，悬浊，每1g菌体中加入1μl的100mg/ml的溶菌酶(Lysozyme)，在冰水中搅拌。然后，一边在冰中搅拌，一边对菌体进行超声波粉碎(1分钟超声、2分钟休息，进行7组)，通过对粉碎液进行离心分离(4℃，15000rpm)、粉碎，得到上清。

将分注了Ni琼脂糖(GE医疗生物科学(GE Helthcare Bio Science)，英国)10ml的亲和柱用通过了0.22μm滤器的柱体积的5倍量的20mM咪唑/20mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)进行平衡，提供通过了0.22μm滤器的破碎上清液。用各咪唑浓度(20、50、100mM)的20mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)进行清洗，用300mM咪唑/磷酸钠缓冲液(pH7.0)洗脱。之后，使用截留分子量10kDa的浓缩器，重复离心分离(8400g，20分钟，4℃)，浓缩为4ml。

接着，将通过0.22μm滤器的PBS(pH7.4)脱气10分钟，通过2倍量的相同缓冲液，用Superdex 75 16/600进行平衡。将浓缩液通过0.22μm滤器，添加到Superdex 75 16/600中。一边监控紫外线波长280nm下的吸光度，一边以0.5ml/分钟的流速，将洗脱液截留为各1.5ml，通过非还原SDS-PAGE分析，得到链霉亲和素四聚体。

<八聚体组合物的制作>

将纯化的二聚体带隔断的突变体(PBS中，pH7.4)、以及链霉亲和素四聚体(PBS中，pH7.4)以4∶1的摩尔比进行混合，在室温下静置15分钟。之后，使用截留分子量50kDa的浓缩器，重复离心分离(8400g，20分钟，4℃)，浓缩为4ml。

接着，将通过0.22μm滤器的PBS(pH7.4)脱气10分钟，通过2倍量的相同缓冲液，用Superdex 200 16/600(GE医疗生物科学，英国)进行平衡。将浓缩液通过0.22μm滤器，添加到Superdex 200 16/600中。一边监控紫外线波长280nm下的吸光度，一边以0.5ml/分钟的流速，将洗脱液截留为各1.5ml，通过SDS-PAGE分析，得到八聚体组合物。

另外，通过将制作二聚体带隔断的突变体表达载体前的带隔断的突变体表达载体直接导入大肠杆菌，得到带隔断的突变体的单体。此外，还制作了在带隔断的突变体中附加了iRGD肽的标识了的带隔断的突变体的单体。表12中示出了标识了的带隔断的突变体的氨基酸序列(序列编号12)。iRGD肽的附加的方法与序列编号6的情况相同。

[表12]

此外，用带隔断的突变体表达载体中插入了Av碱基序列来修饰的单体带隔断的突变体表达载体转化表达BirA的大肠杆菌株AVB101株，也可得到通过链霉亲和素结合了4个单体的四聚体组合物。

<八聚体组合物的大小>

<基于DLS的八聚体组合物的大小>

<基于SAXS的八聚体的大小>

用X射线小角散乱法(SAXS：Smal l Angle X-ray Scattering)测定得到的八聚体组合物的大小。另外，为了比较，还测定了突变体L-PGDS的大小。

SAXS测定在作为大型辐射设施的SPring-8(日本兵库县，佐用郡)的BeamlineBL40B2中进行。X射线波长调整为1.000A(埃)，相机长度调整为2.193m，在25℃下进行实验。对各个测定进行20-50秒曝光，使用PILATUS-2M(理光公司(RIGAKU)，东京)检测散射光。

为了X射线的散射的最大化，使用3.0mm的厚度的样品池(sample cell)，池的窗使用0.02mm的石英板。为了避免测定误差，交替测定蛋白质试样和缓冲液。在池中放入样品25μL，进行测定，测定后从池中去除样品，用缓冲液进行3次清洗。然后进行之后的测定。

通过环平均，将检测器中二维记录的蛋白质试样、以及缓冲液的散射模式转换为一维数据，并从蛋白质试样的数据中减去缓冲液的数据。小角度区域的散射曲线通过单分散体系的Guinier近似公式进行分析。散射强度I(S，C)是散射矢量S和蛋白质浓度C的函数，可使用原点散射强度I(0，C)和惯性半径R_g(C)(回转半径，radius of gyration)表示为式(1)的形式。

[数学式1]

另外，

此外，此处2θ是散射角，λ表示X射线的波长。

通过得到的散射曲线的Guinier区域算出的惯性半径R_g在单体(突变体L-PGDS)中为1.8±0.04nm，在八聚体组合物中约为其的3倍，为6.0±0.69nm，可知惯性半径R_g通过八聚体化而增大。各测定结果示于表13。此外，通过散射曲线算出的分子量(Mw^exp)在单体(突变体L-PGDS)、八聚体组合物中，均为与分子量的理论值(Mw^calc)接近的值，因此判断被认为与单体(突变体L-PGDS)几乎相同大小的隔断突变体的八聚体化已经确实进行了。这样，由于具有超过10nm的足够大小的颗粒形状，因此可以期待八聚体组合物的基于EPR效果的肿瘤集积性。

[表13]

<药物的含有>

接着，使单体、带隔断的突变体、标识了的带隔断的突变体以及八聚体组合物含有SN-38。如已经说明的，SN-38是水难溶性抗癌剂7-乙基-10-羟基喜树碱的简称。已知其与目前临床所使用的作为SN-38的前药的盐酸伊立替康相比，显示出低用量且高抗肿瘤效果。

在37℃下孵育的SN-38的PBS悬浊液中，加入单体(突变体L-PGDS)、带隔断的突变体、标识了的带隔断的突变体或八聚体组合物的PBS溶液，以使终浓度分别达到1μM、0.25μM、和0.125μM，在37℃下搅拌6小时。搅拌结束后，通过超滤去除游离的SN-38，制作在胶囊蛋白质包含药物的样品。

<体内效果>

在控制为室温、12小时明暗循环的动物室中，使4周龄的雄性BALB/C-nu/nu小鼠(日本SLC)自由饮水、喂食，饲养1周，使其适应。之后，通过在右侧腹部皮下给予100μL的5×10⁷个细胞/mL(PBS：基质胶＝1：1)的人前列腺癌细胞PC-3，制作前列腺癌模型小鼠。

肿瘤体积(近似式：通过{(长径)×(短径)²}/2计算)达到250mm³的日子作为给药开始第0天，将小鼠随机分类为PBS、单体(2.0mg SN-38/kg/d)、带隔断的突变体(2.0mg SN-38/kg/d)、标识了的带隔断的突变体(2.0mg SN-38/kg/d)、八聚体组合物(2.0mg SN-38/kg/d)的各给药组，每4天从尾静脉给予单体、带隔断的突变体、标识了的带隔断的突变体、八聚体组合物共计4次。另外，在对照组中每4天仅给予PBS，共计4次。

图12中示出了体内抗肿瘤实验的结果。横轴是从给药第0天起的经过天数(天)，纵轴是肿瘤体积(mm³)。图表中的简称如下。

PBS：对照组

SN-38/L-PGDS：单体(SN-38/突变体L-PGDS)

SN-38/M74W：SN-38/带隔断的突变体

SN-38/M74W-sCRGDK：SN-38/标识了的带隔断的突变体

SN-38/M74W-octamer：SN-38/带隔断的突变体的八聚体组合物

与图11的情况相比，均没有带D回形针。

另外，标识了的带隔断的突变体是在带隔断的突变体的C末端上追加了识别神经毡蛋白1的Cys-Arg-Gly-Asp-Lys(CRGDK)基序而成的(标识编号12)。

参照图12，PBS给药组中，不能确认抗肿瘤效果，从给药开始日起肿瘤体积持续增加。与此相对，SN-38/L-PGDS给药组示出了抑制肿瘤的增加的效果。而且，作为带隔断的突变体的SN-38/M74W进一步抑制了肿瘤的增加。

另一方面，令人惊讶的是，从实验开始，SN-38/M74W-sCRGDK(标识了的带隔断的突变体(没有D回形针))以及SN-38/M74W-octamer(隔断突变体的八聚体组合物)中完全没有观察到肿瘤生长。认为SN-38是抑制癌细胞的增殖而不是诱导细胞凋亡的药物，因此可以说SN-38的效果得到充分的发挥。

此外，尽管每4天合计给药4次，但在不进行给药的第15天以后，肿瘤生长也暂时被完全抑制。因此，药物残留在细胞组织内，不被淋巴系统排泄掉，确认了可长期发挥药效的EPR效果。

图13表示进行图12的实验时的小鼠的平均体重的图。横轴是给药第0天起的经过天数(天)，纵轴是相对于小鼠的给药开始时的体重的体重比(％)。表示各给药组(5只)的平均。图表中的简称与图12的情况相同。不包括图12中的作为对照组的PBS给药组。

如果参照图13，对癌细胞增加抑制显示出非常有效的带隔断的突变体(SN-38/M74W)在第20天显示出体重低于80％的迹象，实验中断。考虑到刚刚失活的L-PGDS(SN-38/L-PGDS)虽然体重减少但没有降到低于80％，认为带隔断的突变体虽然在SN-38(药物)的保持上优良，但由于SN-38在通常细胞中也释放，产生副作用。

另一方面，在癌细胞增殖抑制上显示出显著效果的标识了的带隔断的突变体(SN-38/M74W-sCRGDK)和隔断突变体的八聚体(SN-38/M74W-octamer)中，体重略有减少，SN-38停止给药15天后甚至有增加的倾向。

藉此，认为标识了的带隔断的突变体(SN-38/M74W-sCRGDK)和隔断突变体的八聚体(SN-38/M74W-octamer)特异性识别癌细胞并在癌细胞中进行药物释放。

此外，如果通过制成多聚体、使其发挥EPR效果，则无论癌症如何，都可以输送药物。尤其，对于转移后的癌而言，不论转移部位，药物都可以选择性地仅注入到癌细胞中，而不会影响正常细胞，这被认为是非常有用的。

产业上利用的可能性

本发明将难溶性的药物或其它化合物包裹形成可溶物。于是，在被摄入到细胞后，在细胞内的还原的环境下(细胞内的还原型谷胱甘肽浓度为约0.5-10mM，是细胞外的约100-1000倍浓度)二硫键断裂，可释放包裹的药物或者其它化合物。因此，可合适地作为难溶性化合物的DDS胶囊使用。而且，利用使难溶性物质可溶的性质，可作为工业产品或工业原材料使用。

符号说明

10 (桶状结构的)开口

12 二硫回形针

14 间隙

21 多聚体组合物(八聚体组合物)

22 多聚体组合物(四聚体组合物)

30 链霉亲和素

32 四聚体

35 连接基

34 胶囊蛋白质

36 二聚体

38 生物素。

序列表

<110> 公立大学法人大阪

<120> 胶囊蛋白质及其多聚体组合物以及使用其的医药组合物

<130> UO22004PCT

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 168

<212> PRT

<213> 人

<400> 1

Ala Pro Glu Ala Gln Val Ser Val Gln Pro Asn Phe Gln Gln Asp Lys

1 5 10 15

Phe Leu Gly Arg Trp Phe Ser Ala Gly Leu Ala Ser Asn Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Arg Glu Lys Lys Ala Ala Leu Ser Met Cys Lys Ser Val Val Ala

35 40 45

Pro Ala Thr Asp Gly Gly Leu Asn Leu Thr Ser Thr Phe Leu Arg Lys

50 55 60

Asn Gln Cys Glu Thr Arg Thr Met Leu Leu Gln Pro Ala Gly Ser Leu

65 70 75 80

Gly Ser Tyr Ser Tyr Arg Ser Pro His Trp Gly Ser Thr Tyr Ser Val

85 90 95

Ser Val Val Glu Thr Asp Tyr Asp Gln Tyr Ala Leu Leu Tyr Ser Gln

100 105 110

Gly Ser Lys Gly Pro Gly Glu Asp Phe Arg Met Ala Thr Leu Tyr Ser

115 120 125

Arg Thr Gln Thr Pro Arg Ala Glu Leu Lys Glu Lys Phe Thr Ala Phe

130 135 140

Cys Lys Ala Gln Gly Phe Thr Glu Asp Thr Ile Val Phe Leu Pro Gln

145 150 155 160

Thr Asp Lys Cys Met Thr Glu Gln

165

<210> 2

<211> 170

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 酶失活突变体

<400> 2

Gly Ser Ala Pro Glu Ala Gln Val Ser Val Gln Pro Asn Phe Gln Gln

1 5 10 15

Asp Lys Phe Leu Gly Arg Trp Phe Ser Ala Gly Leu Ala Ser Asn Ser

20 25 30

Ser Trp Leu Arg Glu Lys Lys Ala Ala Leu Ser Met Ala Lys Ser Val

35 40 45

Val Ala Pro Ala Thr Asp Gly Gly Leu Asn Leu Thr Ser Thr Phe Leu

50 55 60

Arg Lys Asn Gln Cys Glu Thr Arg Thr Met Leu Leu Gln Pro Ala Gly

65 70 75 80

Ser Leu Gly Ser Tyr Ser Tyr Arg Ser Pro His Trp Gly Ser Thr Tyr

85 90 95

Ser Val Ser Val Val Glu Thr Asp Tyr Asp Gln Tyr Ala Leu Leu Tyr

100 105 110

Ser Gln Gly Ser Lys Gly Pro Gly Glu Asp Phe Arg Met Ala Thr Leu

115 120 125

Tyr Ser Arg Thr Gln Thr Pro Arg Ala Glu Leu Lys Glu Lys Phe Thr

130 135 140

Ala Phe Ala Lys Ala Gln Gly Phe Thr Glu Asp Thr Ile Val Phe Leu

145 150 155 160

Pro Gln Thr Asp Lys Cys Met Thr Glu Gln

165 170

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> iRGD肽

<400> 3

Cys Arg Gly Asp Lys Gly Pro Asp Cys

1 5

<210> 4

<211> 174

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 标识了的突变体

<400> 4

Gly Ser Ala Pro Glu Ala Gln Val Ser Val Gln Pro Asn Phe Gln Gln

1 5 10 15

Asp Lys Phe Leu Gly Arg Trp Phe Ser Ala Gly Leu Ala Ser Asn Ser

20 25 30

Ser Trp Leu Arg Glu Lys Lys Ala Ala Leu Ser Met Ala Lys Ser Val

35 40 45

Val Ala Pro Ala Thr Asp Gly Gly Leu Asn Leu Thr Ser Thr Phe Leu

50 55 60

Arg Lys Asn Gln Cys Glu Thr Arg Thr Met Leu Leu Gln Pro Ala Gly

65 70 75 80

Ser Leu Gly Ser Tyr Ser Tyr Arg Ser Pro His Trp Gly Ser Thr Tyr

85 90 95

Ser Val Ser Val Val Glu Thr Asp Tyr Asp Gln Tyr Ala Leu Leu Tyr

100 105 110

Ser Gln Gly Ser Lys Gly Pro Gly Glu Asp Phe Arg Met Ala Thr Leu

115 120 125

Tyr Ser Arg Thr Gln Thr Pro Arg Ala Glu Leu Lys Glu Lys Phe Thr

130 135 140

Ala Phe Ala Lys Ala Gln Gly Phe Thr Glu Asp Thr Ile Val Phe Leu

145 150 155 160

Pro Gln Thr Asp Lys Cys Arg Gly Asp Lys Gly Pro Asp Cys

165 170

<210> 5

<211> 170

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 带隔断的D回形针突变体

<400> 5

Gly Ser Ala Pro Glu Ala Gln Val Ser Val Gln Pro Asn Phe Gln Gln

1 5 10 15

Asp Lys Phe Leu Gly Arg Trp Phe Ser Ala Gly Leu Ala Ser Asn Ser

20 25 30

Ser Trp Leu Arg Glu Cys Lys Ala Ala Leu Ser Met Ala Lys Ser Val

35 40 45

Val Ala Pro Ala Thr Asp Gly Gly Leu Asn Leu Thr Ser Thr Phe Leu

50 55 60

Arg Lys Asn Gln Cys Glu Thr Arg Thr Trp Leu Leu Gln Pro Ala Gly

65 70 75 80

Ser Leu Gly Ser Tyr Ser Tyr Arg Ser Pro Cys Trp Gly Ser Thr Tyr

85 90 95

Ser Val Ser Val Val Glu Thr Asp Tyr Asp Gln Tyr Ala Leu Leu Tyr

100 105 110

Ser Gln Gly Ser Lys Gly Pro Gly Glu Asp Phe Arg Met Ala Thr Leu

115 120 125

Tyr Ser Arg Thr Gln Thr Pro Arg Ala Glu Leu Lys Glu Lys Phe Thr

130 135 140

Ala Phe Ala Lys Ala Gln Gly Phe Thr Glu Asp Thr Ile Val Phe Leu

145 150 155 160

Pro Gln Thr Asp Lys Cys Met Thr Glu Gln

165 170

<210> 6

<211> 174

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 标识了的带隔断的D回形针突变体

<400> 6

Gly Ser Ala Pro Glu Ala Gln Val Ser Val Gln Pro Asn Phe Gln Gln

1 5 10 15

Asp Lys Phe Leu Gly Arg Trp Phe Ser Ala Gly Leu Ala Ser Asn Ser

20 25 30

Ser Trp Leu Arg Glu Cys Lys Ala Ala Leu Ser Met Ala Lys Ser Val

35 40 45

Val Ala Pro Ala Thr Asp Gly Gly Leu Asn Leu Thr Ser Thr Phe Leu

50 55 60

Arg Lys Asn Gln Cys Glu Thr Arg Thr Trp Leu Leu Gln Pro Ala Gly

65 70 75 80

Ser Leu Gly Ser Tyr Ser Tyr Arg Ser Pro Cys Trp Gly Ser Thr Tyr

85 90 95

Ser Val Ser Val Val Glu Thr Asp Tyr Asp Gln Tyr Ala Leu Leu Tyr

100 105 110

Ser Gln Gly Ser Lys Gly Pro Gly Glu Asp Phe Arg Met Ala Thr Leu

115 120 125

Tyr Ser Arg Thr Gln Thr Pro Arg Ala Glu Leu Lys Glu Lys Phe Thr

130 135 140

Ala Phe Ala Lys Ala Gln Gly Phe Thr Glu Asp Thr Ile Val Phe Leu

145 150 155 160

Pro Gln Thr Asp Lys Cys Arg Gly Asp Lys Gly Pro Asp Cys

165 170

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 连接基

<400> 7

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 8

<211> 412

<212> DNA

<213> 亲和链霉菌

<400> 8

gctgaagctg gtatcaccgg cacctggtac aaccagctgg gatccacctt catcgttacc 60

gctggtgctg acggtgctct gaccggtacc tacgaatccg ctgttggtaa cgctgaatct 120

agatacgttc tgaccggtcg ttacgactcc gctccggcta ccgacggttc cggaaccgct 180

ctgggttgga ccgttgcttg gaaaaacaac taccgtaacg ctcactccgc taccacctgg 240

tctggccagt acgttggtgg tgctgaagct cgtatcaaca cccagtggtt gttgacctcc 300

ggcaccaccg aagccaacgc gtggaaatcc accctggttg gtcacgacac cttcaccaaa 360

gttaaaccgt ccgctgcttc ccatcaccat caccaccatt aataaaagct tg 412

<210> 9

<211> 170

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 带隔断的突变体

<400> 9

Gly Ser Ala Pro Glu Ala Gln Val Ser Val Gln Pro Asn Phe Gln Gln

1 5 10 15

Asp Lys Phe Leu Gly Arg Trp Phe Ser Ala Gly Leu Ala Ser Asn Ser

20 25 30

Ser Trp Leu Arg Glu Lys Lys Ala Ala Leu Ser Met Ala Lys Ser Val

35 40 45

Val Ala Pro Ala Thr Asp Gly Gly Leu Asn Leu Thr Ser Thr Phe Leu

50 55 60

Arg Lys Asn Gln Cys Glu Thr Arg Thr Trp Leu Leu Gln Pro Ala Gly

65 70 75 80

Ser Leu Gly Ser Tyr Ser Tyr Arg Ser Pro His Trp Gly Ser Thr Tyr

85 90 95

Ser Val Ser Val Val Glu Thr Asp Tyr Asp Gln Tyr Ala Leu Leu Tyr

100 105 110

Ser Gln Gly Ser Lys Gly Pro Gly Glu Asp Phe Arg Met Ala Thr Leu

115 120 125

Tyr Ser Arg Thr Gln Thr Pro Arg Ala Glu Leu Lys Glu Lys Phe Thr

130 135 140

Ala Phe Ala Lys Ala Gln Gly Phe Thr Glu Asp Thr Ile Val Phe Leu

145 150 155 160

Pro Gln Thr Asp Lys Cys Met Thr Glu Gln

165 170

<210> 10

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Avitag正义引物

<400> 10

gttccgcgtg gatccatgtc tggcctgaac gatattttcg aagcgcagaa aattgaatgg 60

cacgaa 66

<210> 11

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Avitag反义引物

<400> 11

ctcgggtgcg gatccttcgt gccattcaat tttctgcgct tcgaaaatat cgttcaggcc 60

agacat 66

<210> 12

<211> 174

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 标识了的带隔断的突变体

<400> 12

Gly Ser Ala Pro Glu Ala Gln Val Ser Val Gln Pro Asn Phe Gln Gln

1 5 10 15

Asp Lys Phe Leu Gly Arg Trp Phe Ser Ala Gly Leu Ala Ser Asn Ser

20 25 30

Ser Trp Leu Arg Glu Lys Lys Ala Ala Leu Ser Met Ala Lys Ser Val

35 40 45

Val Ala Pro Ala Thr Asp Gly Gly Leu Asn Leu Thr Ser Thr Phe Leu

50 55 60

Arg Lys Asn Gln Cys Glu Thr Arg Thr Trp Leu Leu Gln Pro Ala Gly

65 70 75 80

Ser Leu Gly Ser Tyr Ser Tyr Arg Ser Pro His Trp Gly Ser Thr Tyr

85 90 95

Ser Val Ser Val Val Glu Thr Asp Tyr Asp Gln Tyr Ala Leu Leu Tyr

100 105 110

Ser Gln Gly Ser Lys Gly Pro Gly Glu Asp Phe Arg Met Ala Thr Leu

115 120 125

Tyr Ser Arg Thr Gln Thr Pro Arg Ala Glu Leu Lys Glu Lys Phe Thr

130 135 140

Ala Phe Ala Lys Ala Gln Gly Phe Thr Glu Asp Thr Ile Val Phe Leu

145 150 155 160

Pro Gln Thr Asp Lys Cys Arg Gly Asp Lys Gly Pro Asp Cys

165 170