一种碱性底物选择性提高的枯草蛋白酶e突变体及其应用
阅读说明：本技术 一种碱性底物选择性提高的枯草蛋白酶e突变体及其应用 (Subtilisin E mutant with improved alkaline substrate selectivity and application thereof ) 是由 张娟 汤恒 堵国成 陈坚 于 2019-11-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种碱性底物选择性提高的枯草蛋白酶E突变体及其应用,属于基因工程和酶工程技术领域。本发明通过环替换策略,将枯草芽孢杆菌蛋白酶E催化口袋的环序列突变为富含负电氨基酸残基的环序列,以提高对带相反电荷的氨基酸底物的选择性,得到底物选择性提高的突变体。本发明的突变体的碱性底物选择性均有明显提高,经相同浓度的酶处理后,水解产物中碱性短肽的比例从原始酶的11％上升为50％。选择性提高的突变体显示出了牛奶过敏原降解等食品应用方面和体外溶栓等医疗应用方面的潜在应用价值。(The invention discloses a subtilisin E mutant with improved alkaline substrate selectivity and application thereof, belonging to the technical field of genetic engineering and enzyme engineering. According to the invention, by a loop replacement strategy, a loop sequence of a catalysis pocket of the subtilisin E is mutated into a loop sequence rich in negative amino acid residues, so as to improve the selectivity to amino acid substrates with opposite charges, and obtain a mutant with improved substrate selectivity. The mutant of the invention has obviously improved alkaline substrate selectivity, and the proportion of alkaline short peptide in the hydrolysate is increased from 11 percent of the original enzyme to 50 percent after the mutant is treated by the enzyme with the same concentration. The mutant with improved selectivity shows potential application values in food application aspects such as milk allergen degradation and medical application aspects such as in vitro thrombolysis.)
技术领域
本发明涉及一种碱性底物选择性提高的枯草蛋白酶E突变体及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。
背景技术
枯草芽孢杆菌蛋白酶E(Subtilisin E)，简称枯草蛋白酶E，是一种由微生物产生、可以降解蛋白类底物的碱性丝氨酸蛋白酶。枯草芽孢杆菌蛋白酶E作为一种底物专一性宽泛、水解催化能力强和碱性的pH值偏好的蛋白酶，在洗涤剂、皮革和食品工业中有着广泛的应用。特别是在乳制品工业中，它们在生产生物活性水解物方面具有巨大的潜力。随着工业化的发展，野生菌所产枯草芽孢杆菌蛋白酶E性能和产量远远不能满足市场需求。
目前筛选得到的产枯草芽孢杆菌蛋白酶E野生菌大多集中在枯草杆菌属，其胞外分泌的酶种类多，底物作用专一性差，而且产酶不稳定，不利于工业化生产。采用基因工程菌，强化基因转录和翻译，达到高效表达和活性分泌，可以有效提高枯草芽孢杆菌蛋白酶E生产强度。重组枯草芽孢杆菌蛋白酶E一般经过性能改造，胞外酶活单一，简化了发酵下游的纯化工作。另外，工业化应用上对酶的要求苛刻，如高温环境会很大程度影响枯草芽孢杆菌蛋白酶E活性。为减省生产成本，必须实现枯草芽孢杆菌蛋白酶E重复利用，另外还需要催化活力高，底物专一性强的枯草芽孢杆菌蛋白酶E进行精细化学的催化。人们从自然界筛选分离地枯草芽孢杆菌蛋白酶E已经远远不能满足工业化需求，所以通过分子改造技术寻求新型枯草芽孢杆菌蛋白酶E将是一个新的研究手段。
发明内容
发明人前期对来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S7的枯草芽孢杆菌蛋白酶E(SES7)进行了异源表达(专利公开号为：CN109837219A)，获得了高可溶性表达的枯草芽孢杆菌蛋白酶E。但在大肠杆菌的胞内表达中，底物选择性并不专一。为了进一步提高酶的应用性能，有必要进一步提高枯草芽孢杆菌蛋白酶E的底物选择性。
本发明的第一个目的是提供一种枯草芽孢杆菌蛋白酶E突变体，其含SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
所述枯草芽孢杆菌蛋白酶E突变体的氨基酸序列是在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的基础上，将第127-132位的环序列GGPSGS突变为YDADDS，第158-162位的环序列SSGSS突变为QHPKEG。得到的枯草芽孢杆菌蛋白酶E突变体命名为L1-2&L2-5。
本发明的第二个目的是提供编码上述枯草芽孢杆菌蛋白酶E突变体的基因。
在本发明的一种实施方式中，编码枯草芽孢杆菌蛋白酶E突变体L1-2&L2-5的基因的核苷酸序列是SEQ ID NO.3所示的序列。
本发明的第三个目的是提供含有所述基因的重组质粒载体。
在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒载体是在pET系列、pGEX系列、pPICZ系列、pAN系列或pUB中的任意一种质粒的基础上构建得到的。
本发明的第四个目的是提供一种表达所述枯草芽孢杆菌蛋白酶E突变体的基因工程菌。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌，是细菌、酵母或者其他真菌。
本发明的第五个目的是提供一种增强枯草芽孢杆菌蛋白酶E热稳定性的方法，是在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的基础上，将第127-132位的环序列GGPSGS突变为YDADDS，第158-162位的环序列SSGSS突变为天冬氨酸QHPKEG。
本发明的第六个目的是提供一种生产所述枯草芽孢杆菌蛋白酶E突变体蛋白的方法，是培养所述重组表达转化体，诱导获得枯草芽孢杆菌蛋白酶E突变体蛋白。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是将基因工程菌单克隆在LB培养基中，35-39℃温度下培养8-14h，得到种子液；按1-10％接种量将种子液接到LB液体培养基，在35-39℃，200-220rpm培养至OD600＝0.9-1.1，加入终浓度为0.1-1.0mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，于15-17℃诱导培养12-16h。
在本发明的一种实施方式中，所述LB培养基含有蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L，pH 7.2。
本发明的第七个目的是提供所述枯草芽孢杆菌蛋白酶E突变体在降解牛奶过敏原中的应用，如降解α-乳白蛋白、酪蛋白。
本发明的第七个目的是提供所述枯草芽孢杆菌蛋白酶E突变体在体外溶栓中的应用。
本发明的第八个目的是提供所述枯草芽孢杆菌蛋白酶E突变体在食品或制药领域的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种枯草芽孢杆菌蛋白酶E突变体L1-2&L2-5，kcat/Km为0.032min-1μM-1与野生型枯草芽孢杆菌蛋白酶E的0.034min-1μM-1相似。突变体的水解产物中碱性短肽的比例从原始酶的11％上升为50％。本发明的枯草芽孢杆菌蛋白酶E突变体L1-2&L2-5比野生型枯草芽孢杆菌蛋白酶E更具有应用的价值和潜力。
附图说明
图1：重组质粒的构建示意图。
图2：枯草芽孢杆菌蛋白酶E及突变体L1-2&L2-5的大肠杆菌破碎液上清SDS-PAGE凝胶电泳；其中，M代表蛋白分子量标准，不同泳道名称代表不同的突变蛋白，箭头指示目的蛋白条带位置。
图3：枯草芽孢杆菌蛋白酶E及其突变体L1-2&L2-5的Lineweaver–Burk曲线，A：SES7；B：L1-2&L2-5。
图4：枯草芽孢杆菌蛋白酶E及突变体L1-2&L2-5的水解产物中碱性短肽的比例，A：SES7；B：L1-2&L2-5。
具体实施方式
(一)酶活测定方法
枯草芽孢杆菌蛋白酶E酶活力的测定采用对硝基苯酚短肽类似物(Suc-AAPF-pNA)显色方法测定。枯草芽孢杆菌蛋白酶E在一定条件下，水解对硝基苯酚短肽类似物释放出对硝基苯酚，发生显色反应，可以在一定范围内其颜色的深浅与对硝基苯酚的释放量成正比，故可以在405nm的波长下进行比色，计算酶活。
酶活单位定义：在上述条件下，以未反应的样品作为空白对照，将每分钟催化分解短肽类似物成对硝基苯酚的每毫升酶量定义为一个酶活单位。
(二)酶学动力学常数测定步骤：
A.酶解反应：取100μL的0.02mg/mL纯化枯草芽孢杆菌蛋白酶E和含底物浓度梯次为0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4，4.5，5mg/mL的Suc-AAPF-pNA的Tris-HCl缓冲液(50mM，pH9.0)900μL混合均匀，在37℃下反应30分钟后迅速加入10μL的10mM PMSF终止反应，并测定405nm处的吸光度。
B.酶学动力学常数计算：根据吸光度值计算，在此条件下，只有一小部分底物(<10％)被枯草芽孢杆菌蛋白酶E转化为产物，故可采用Lineweaver–Burk作图法通过线性回归计算动力学常数。
(三)采用AKTA avant蛋白纯化仪进行重组蛋白的纯化
枯草芽孢杆菌蛋白酶E及其突变体都含有组氨酸标签，所以可以镍离子亲和层析纯化柱进行分离纯化，具体步骤如下：
(1)平衡：用5倍体积的50mmol/L，pH 7.2，Tris-HCl缓冲液平衡纯化柱；
(2)上样：预先处理好的样品以0.5mL/min的流速上样，上样体积一般不超过柱体积的5倍；
(3)洗脱：包括洗脱未吸附物质、杂蛋白和目的蛋白，流速1.0mL/min，洗脱液为含有300mM咪唑的50mmol/L，pH 7.2，Tris-HCl缓冲液，进行梯度洗脱，检测波长为280nm，分批收集含枯草芽孢杆菌蛋白酶E酶活的洗脱液。
实施例1：枯草芽孢杆菌蛋白酶E碱性底物选择性提高突变体的构建
以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S7来源的枯草芽孢杆菌蛋白酶E(SES7)为亲本酶，构建环替换突变体L1-2&L2-5。亲本酶的一级序列如SEQ ID NO.1所示。设计用富含负电荷侧链氨基酸残基的环区域替换Loop I，则可以与带负电荷的Glu156协同作用，使底物口袋偏好性地识别带相反电荷的氨基酸残基。因此，本发明以SEQ ID NO.1所示氨基酸序列为基础，将第127-132位的环序列GGPSGS突变为YDADDS，且将第158-162位的环序列SSGSS突变为QHPKEG，得到突变体L1-2&L2-5(图1)。
枯草芽孢杆菌蛋白酶E突变体L1-2&L2-5的构建：将编码枯草芽孢杆菌蛋白酶E的基因与pET-24a(+)通过酶切连接，得到质粒SES7/pET-24a(+)；以质粒SES7/pET-24a(+)为模板，设计PCR引物(表1)，采用PCR引物进行扩增，获得突变质粒L1-2&L2-5/pET-24a(+)，进行核酸电泳和胶回收。
PCR条件步骤：首先，95℃预变性5min；然后进入25个循环：98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸8min；最后72℃延伸10min，4℃保温。
回收该基因，采用DpnI在37℃下消化模板链2小时后，利用T4 DNA连接酶和T4磷酸激酶进行室温连接过夜，最后转导感受态大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中进行表达，得到重组大肠杆菌。
表1枯草芽孢杆菌蛋白酶E突变体的引物序列
实施例2：枯草芽孢杆菌蛋白酶E突变体的表达和纯化
挑取实施例1中得到的重组大肠杆菌阳性单克隆于LB液体培养基(含50μg/mL氨苄卡那抗生素)生长过夜，得到种子发酵液；按10％接种量将种子发酵液接到LB液体培养基(含50μg/mL氨苄卡那抗生素)，在37℃摇床培养2.5h，至OD600＝1.0左右；加入0.05mM终浓度的IPTG诱导细胞进行胞外表达枯草芽孢杆菌蛋白酶E，并在18℃摇床继续培养发酵过夜；将发酵液于4℃、6000rpm离心1小时收集菌体，破碎后收集破碎上清液，进行SDS-PAGE分析，L1-2&L2-5分子量为28kDa(图2)。采用AKTA avant蛋白纯化仪进行重组蛋白的纯化。
实施例3：酶活分析
Lineweaver–Burk作图法通过线性回归计算动力学常数结果如图3所示，相关动力学参数均据此进行计算。
测定枯草芽孢杆菌蛋白酶E和截短突变体L1-2&L2-5在大肠杆菌异源表达后重组酶的酶学动力学参数，结果如表2所示。
表2枯草芽孢杆菌蛋白酶E及突变体L1-2&L2-5的酶学动力学参数测定
实施例4：枯草芽孢杆菌蛋白酶E突变体的底物选择性测定
将纯化的枯草芽孢杆菌蛋白酶E和环替换突变体L1-2&L2-5用50mM Tris-HCl缓冲液稀释至蛋白含量为0.02mg/mL，pH为9.0，与10％w/V的脱脂奶粉混合后置于37℃恒温水浴中孵育48小时后，加入10mM PMSF终止反应。反应液上清均使用3kDa超滤膜过滤，仅收集通过滤过液进行LC-MS分析。取20μg水解产物滤过液使用Empore SDB-XC反相材料和萃取盘材料(Sigma,St.Louis,MO,USA)进行两步法的样品处理。使用Orbitrap Velos massspectrometer(Thermo Fisher Scientific)对水解产物进行毛细管LC-MS分析，串联质谱结果使用Studio 51 8.5(Bioinformatics Solutions,Inc.,Waterloo,Ontario,Canada)鉴定肽段序列及所属蛋白，并归类分析水解产物中P1位氨基酸分布及碱性肽段比例，如图4所示，突变体的水解产物中H的比例从0％提高为1％，R的比例从4％提高为20％，K的比例从7％提高为29％，总的碱性短肽的比例从原始酶的11％上升至50％。
对比例
其余步骤同实施例，在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的基础上，只将第127-132位的环序列GGPSGS分别突变为PCTES和YDADDAI，得到的枯草芽孢杆菌蛋白酶E突变体均完全失去酶活。
其余步骤同实施例，在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的基础上，将第127-132位的环序列GGPSGS突变为PCTES和YDADDAI且将第158-162位的环序列SSGSS突变为QHPKEG，得到的枯草芽孢杆菌蛋白酶E突变体均完全失去酶活。
其余步骤同实施例，在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的基础上，将第127-132位的环序列GGPSGS分别突变为YDADDS，得到的枯草芽孢杆菌蛋白酶E突变体酶活相对于原始酶下降1000倍以上，但突变体的水解产物中碱性短肽的比例为提高为16％。
其余步骤同实施例，在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的基础上，只将第158-162位的环序列SSGSS突变为QHPKEG，得到的枯草芽孢杆菌蛋白酶E突变体kcat/Km为0.036min-1μM-1，突变体的水解产物中碱性短肽的比例为36％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种碱性底物选择性提高的枯草蛋白酶E突变体及其应用
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
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<211> 381
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis
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35 40 45
Ala Met Ser Ser Ala Lys Lys Lys Asp Val Ile Ser Glu Lys Gly Gly
50 55 60
Lys Val Gln Lys Gln Phe Lys Tyr Val Asn Ala Ala Ala Ala Thr Leu
65 70 75 80
Asp Glu Lys Ala Val Lys Glu Leu Lys Lys Asp Pro Ser Val Ala Tyr
85 90 95
Val Glu Glu Asp His Ile Ala His Glu Tyr Ala Gln Ser Val Pro Tyr
100 105 110
Gly Ile Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu His Ser Gln Gly Tyr Thr
115 120 125
Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp Ser Gly Ile Asp Ser Ser
130 135 140
His Pro Asp Leu Asn Val Arg Gly Gly Ala Ser Phe Val Pro Ser Glu
145 150 155 160
Thr Asn Pro Tyr Gln Asp Gly Ser Ser His Gly Thr His Val Ala Gly
165 170 175
Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly Val Ala Pro
180 185 190
Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asp Ser Thr Gly Ser Gly
195 200 205
Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu Trp Ala Ile Ser Asn Asn
210 215 220
Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro Ser Gly Ser Thr Ala
225 230 235 240
Leu Lys Thr Val Val Asp Lys Ala Val Ser Ser Gly Ile Val Val Ala
245 250 255
Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Ser Ser Gly Ser Ser Ser Thr Val Gly
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Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Ala Gly Ser Glu Leu Asp Val
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<212> DNA
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gtcggattta agcagacaat gagtgccatg agttccgcca agaaaaagga tgttatttct 180
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catattgcac atgaatatgc gcaatctgtt ccttatggca tttctcaaat taaagcgccg 360
gctcttcact ctcaaggcta cacaggctct aacgtaaaag tagctgttat cgacagcgga 420
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