提高降解醇溶蛋白能力的蛋白酶突变体及其编码基因和应用

文档序号：824757 发布日期：2021-03-30 浏览：23次 >En<

阅读说明：本技术 提高降解醇溶蛋白能力的蛋白酶突变体及其编码基因和应用 (Protease mutant capable of improving alcohol-soluble protein degradation capacity and coding gene and application thereof ) 是由肖志壮方安然孙建飞于文君付五兵王金龙于 2021-01-19 设计创作，主要内容包括：本发明提供了提高降解醇溶蛋白能力的蛋白酶突变体及其编码基因和应用。本发明通过使用易错PCR方法对Bacillus licheniformis来源的蛋白酶基因进行改造,再通过筛选得到单点突变的蛋白酶突变体APR01,并在此基础上,利用第二轮易错PCR,筛选获得了两个含有两个点突变的蛋白酶突变体APR02和APR03,以及一个含有三个点突变的蛋白酶突变体APR04。本发明的突变体的降解醇溶蛋白的能力得到明显的提高,能够增加其对醇溶蛋白的降解率,因此具有良好的市场应用前景和工业价值。(The invention provides a protease mutant capable of improving the capability of degrading alcohol soluble protein, and a coding gene and application thereof. The invention uses error-prone PCR method Bacillus licheniformis The source protease gene is transformed, and then the protease mutant APR01 with single point mutation is obtained by screening, and on the basis, two protease mutants APR02 and APR03 with two point mutations and a protease mutant APR04 with three point mutations are obtained by screening by using a second error-prone PCR. The mutant of the invention has obviously improved capability of degrading alcohol soluble protein and can increase the degradation rate of alcohol soluble protein, thus having good market application prospect and industrial value.)

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程领域，具体涉及提高降解醇溶蛋白能力的蛋白酶突变体及其编码基因和应用。

背景技术

蛋白酶是催化水解蛋白质中肽键的一类酶，广泛存在于动物、植物和微生物中，有着许多不同的生理功能，是酶学研究开展的较早，也是最为成熟的一种。蛋白酶在各个领域中的应用愈加广泛，例如食品工业、酿酒酿造、洗涤剂行业、饲料工业、制革工业、丝绸行业和医药行业等，与我们的生活息息相关，这种环境下对蛋白酶的产量和特性改良方面都提出了更高的要求。

醇溶蛋白是植物种子储存蛋白的组分之一，不溶于水，可溶于60%～95%的乙醇溶液。醇溶蛋白是谷物蛋白粉中含量较高的蛋白质，玉米、小麦、高粱等原料在饲料行业中大量使用，其中，玉米中醇溶蛋白约占蛋白总量的65%，小麦醇溶蛋白醇约占蛋白总量的40%，高粱醇溶蛋白醇约占蛋白总量的77-82%。醇溶蛋白由于其独特的性质不能被内源酶消化，大大降低了饲料蛋白利用率，影响养殖的经济效益，同时未消化的蛋白经畜禽粪尿排放到环境中还会造成环境氮污染。

易错PCR技术是在采用DNA聚合酶进行PCR反应扩增目的片段时，通过调整反应条件，增加扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，构建突变体文库，从而筛选需要的正向突变体。易错PCR技术可以很好地应用于蛋白质的分子改造中。

发明内容

本发明提供了提高降解醇溶蛋白能力的蛋白酶突变体及其编码基因和应用。本发明通过构建突变体文库和定向筛选的方法，对Bacillus licheniformis WX-02来源的蛋白酶基因进行改良，筛选得到对醇溶蛋白降解率提高的突变体，有助于提升饲料蛋白质的利用率，提高经济效益，减少环境污染。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种提高降解醇溶蛋白能力的蛋白酶突变体APR01，所述蛋白酶突变体APR01的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述蛋白酶突变体APR01是由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的蛋白酶的第234位的丝氨酸变为色氨酸获得的。

本发明还提供了所述的蛋白酶突变体APR01的编码基因，所述蛋白酶突变体APR01的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

本发明还提供了一种提高降解醇溶蛋白能力的蛋白酶突变体APR02，所述蛋白酶突变体APR02的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；所述蛋白酶突变体APR02是由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的蛋白酶的第234位的丝氨酸变为色氨酸，以及第263位的丝氨酸变为异亮氨酸获得的。

本发明还提供了所述的蛋白酶突变体APR02的编码基因，所述蛋白酶突变体APR02的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。

本发明还提供了一种提高降解醇溶蛋白能力的蛋白酶突变体APR03，所述蛋白酶突变体APR03的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；所述蛋白酶突变体APR03是由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的蛋白酶的第234位的丝氨酸变为色氨酸，以及第264位的甘氨酸变为色氨酸获得的。

本发明还提供了所述的蛋白酶突变体APR03的编码基因，所述蛋白酶突变体APR03的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。

本发明还提供了一种提高降解醇溶蛋白能力的蛋白酶突变体APR04，所述蛋白酶突变体APR04的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示；所述蛋白酶突变体APR04由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的蛋白酶的第53位的缬氨酸变为丙氨酸、第161位的酪氨酸变为组氨酸以及第234位的丝氨酸变为色氨酸获得。

本发明还提供了所述的蛋白酶突变体APR04的编码基因，所述蛋白酶突变体APR04的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示。

本发明还提供了含有所述的蛋白酶突变体APR01的编码基因、或含有所述的蛋白酶突变体APR02的编码基因、或含有所述的蛋白酶突变体APR03的编码基因、或含有所述的蛋白酶突变体APR04的编码基因的重组菌株。

本发明还提供了所述的蛋白酶突变体APR01、或所述的蛋白酶突变体APR02、或所述的蛋白酶突变体APR03、或所述的蛋白酶突变体APR04在用于制备降解醇溶蛋白的生物制剂中的应用。

与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：

本发明通过以Bacillus licheniformis WX-02来源的蛋白酶基因为基础，并利用易错PCR方法对其进行改造，再利用醇溶蛋白底物平板筛选得到了包含S234W的单点突变体APR01，并在蛋白酶突变体APR01的基础上，通过第二轮易错PCR得到了包含S234W/ S263I、S234W/G264W的双位点突变体APR02和APR03，以及包含V53A/Y161H/S234W的三位点突变体APR04。本发明改造后的突变体APR01，APR02，APR03和APR04对醇溶蛋白降解率比原始蛋白酶分别提高了15.5%、20.4%、35.6%、32.0%，因此其对醇溶蛋白降解率得到了显著的提升，也说明了这些突变体的降解醇溶蛋白的能力得到明显的提高。所以通过本发明技术方案得到的蛋白酶突变体的对醇溶蛋白降解率较野生型有较大提高，使其在饲料、食品或洗涤等领域有很好的应用潜力，具有良好的市场应用前景。

附图说明

图1是本发明中蛋白酶突变体的筛选平板图。

图2是本发明中蛋白酶突变体对玉米醇溶蛋白酶解后干物质消失率的影响。

图3是本发明中蛋白酶突变体在30L发酵罐中的发酵数据。

具体实施方式

为了便于理解本发明，以下将结合附图及实施例对本文发明做更全面、详细地说明，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，可以参照J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》(第三版)中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；具体实施例中使用的试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。

1、菌株和载体

枯草芽胞杆菌WB600、质粒pUB110、大肠杆菌BL21-DE3、质粒pET-21a(+)购自Invitrogen公司。

2、试剂与培养基

质粒提取试剂盒、片段纯化回收试剂盒、限制性内切酶等购自宝生物工程(大连)有限公司；GeneMorph II随机突变PCR试剂盒购自Stratagene公司；氨苄青霉素、IPTG等购自生工生物工程(上海)股份有限公司；蛋白Marker：Blue Plus II Protein Marker (14-120 kDa) 购自北京全式金生物技术有限公司。

LB培养基：1%胰蛋白胨，0 .5%酵母提取物，1% NaCl。

实施例1：易错PCR构建蛋白酶突变体文库

参考Bacillus licheniformis WX-02来源的蛋白酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)和其DNA序列(SEQ ID NO：2)设计引物，在5’端设计Xba I限制性酶切位点，3’端设计BamH I限制性酶切位点。

用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒以SEQ ID NO：2所示的基因为模版，进行随机突变，使用的引物序列如下：

BLAPR-F：GCTCTAGAATGATGAGGAAGAAATC（SEQ ID NO：3）；

BLAPR-R：CGCGGATCCTTACTGTGCAGCTGCTTCGA（SEQ ID NO：4）；

下划线处分别为EcoR I 和Not I酶切位点。

PCR反应条件为：94°C 预变性3 min，94°C 变性30s，55°C 退火60s 和72° C 延伸5min，共30个循环。

将扩增好的多个随机突变PCR产物用Xba I和BamH I双酶切，纯化回收后连接到pET-21a (+)载体上，转化大肠杆菌BL21-DE3，涂布于氨苄青霉素抗性LB平板上，筛选阳性克隆，得到多个重组载体pET-APRx和重组菌株BL21-APRx，分别进行编号。

利用同样的方法将合成的如SEQ ID NO：2所示的基因连接到pET-21a(+) 载体上并转化大肠杆菌BL21-DE3，得到重组载体pET-APR0和重组菌株BL21-APR0。

将上述筛选得到的阳性重组菌株BL21-APRx的单菌落接种到96孔深孔板，每个平板同时接入2个重组菌株BL21-APR0（表达APR0）的单菌落作为对照。每孔装入300 μL LB液体培养基(含有100 μg/mL氨苄青霉素)，37℃、200rpm震荡培养4小时后，转移50 μL菌液到新的96孔平板保种，在平板剩余菌液中添加200μL含有IPTG的LB-Amp培养基，使IPTG终浓度为1mM，氨苄青霉素终浓度为100 μg/mL，37℃、200rpm摇床培养10h诱导表达蛋白酶；将诱导完成的菌液反复冻融进行破碎，将破碎后的细胞液离心取上清，上清液即为粗酶液，备用。

利用醇溶蛋白底物平板筛选蛋白酶突变体：

（1）称取1g玉米醇溶蛋白粉，溶于5mL 60%乙醇溶液；

（2）将步骤（1）的溶液，加入融化后的100mL LB固体培养基中，快速混匀，倒平板；

（3）待平板凝固后，用打孔器在平板中打孔；

（4）平板上的每个孔可以加入50-70 μL实施例1得到的粗酶液；

（5）将醇溶蛋白底物平板放入37℃培养箱中过夜培养；

（6）观察水解圈直径（cm）的大小，初步评价醇溶蛋白酶解效果。

结果如图1所示，发现编号6的粗酶液的水解圈明显大于APR0的水解圈，说明其水解圈酶解效果要优于对照APR0，由此筛选到了一个提高了对醇溶蛋白降解效果的蛋白酶突变体。将突变体进行基因测序，得到了以APR0为出发模板的、含S234W单突变的突变体，命名为APR01，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。蛋白酶突变体APR01提高了对醇溶蛋白降解效果，也就说明了突变提高了蛋白酶降解醇溶蛋白的能力。

APR01的突变方式为S234W（第234位的丝氨酸S变为色氨酸W）。

实施例2：第二轮易错PCR构建蛋白酶APR01的突变体文库

以实施例1中筛选到的蛋白酶突变体APR01的编码基因作为模版，进行第二轮随机突变，突变库构建过程以及使用材料试剂和操作条件等均同实施例1；突变体培养和筛选时以APR01为对照，经过醇溶蛋白降解率实验检测后，将对醇溶蛋白降解率明显提高的蛋白酶突变体进行基因测序。最终本轮共筛选到3个对醇溶蛋白降解率提高的突变体，分别命名为APR02、APR03、APR04：

APR02突变方式为S234W/S263I（第234位的丝氨酸S变为色氨酸W以及第263位的丝氨酸S变为异亮氨酸I），其氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQID NO：8所示；

APR03突变方式为S234W/G264W（第234位的丝氨酸S变为色氨酸W以及第264位的甘氨酸G变为色氨酸W），其氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQID NO：10所示；

APR04突变方式为V53A/Y161H/S234W（第53位的缬氨酸V突变为丙氨酸A、第161位的酪氨酸Y突变为组氨酸H以及第234位的丝氨酸S变为色氨酸W），其氨基酸序列如SEQ IDNO：11所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示。

实施例3：蛋白酶突变体在枯草芽胞杆菌中的表达和玉米醇溶蛋白酶解实验

分别将上述的蛋白酶突变体APR01、APR02、APR03和APR04克隆入质粒pUB110的XbaI和BamH I位点，然后采用经典Spizizen方法将已构建的重组质粒转化入枯草芽胞杆菌WB600中，得到突变体的重组菌株。将这4个基因的转化子挑取转接到发酵培养基（豆粕粉50-80g/L，玉米淀粉60-100g/L，磷酸氢二钠2-4g/L，碳酸钠1-2g/L，pH自然）中摇瓶发酵78h后，将培养液离心取上清，测定每个突变体发酵上清液的平均酶活后，取每个突变体中酶活最高的转化子发酵上清液，检测其对醇溶蛋白的降解效果。

精确称取1.00 g玉米醇溶蛋白，放入100 mL三角瓶内，加入25mL pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液，其中试验组再分别加入相同酶活力（1g醇溶蛋白添加1000U）的4个蛋白酶突变体，对照组则加入灭活的碱性蛋白酶（沸水浴5min）；调溶液pH至7.0，然后放入40°C的恒温水浴锅内，开启水浴锅振荡器120 rpm/min不断振荡，5 min后开始计时，消化时长4 h。待消化完毕后，将三角瓶中消化好的玉米醇溶蛋白，用抽滤泵抽滤，抽滤后的样品105℃烘干至恒重。由干物质重量G1，计算干物质消失率为（G0-G1）/G0×100%（G0为原始重量，单位g）。

酶解结果如图2，改造后的蛋白酶突变体APR01，APR02，APR03和APR04对醇溶蛋白降解率比原始蛋白酶分别提高了15.5%、20.4%、35.6%、32.0%。

以上结果表明将APR0第234位的Ser突变为Trp能在保持原有酶活力的同时提高对醇溶蛋白的降解效果；并在此基础上将其第263位的Ser突变为Ile得到的突变体，或将其264位Gly突变为Trp得到的突变体；或将其第53位的Val突变为Ala，同时将其第161位的Tyr突变为His得到的突变体，其对醇溶蛋白降解效果均有进一步提高。

实施例4：蛋白酶突变体在30L发酵罐中发酵和制备

将表达蛋白酶突变体APR0、APR01、APR02、APR03、APR04的重组菌株分别划线于含有卡那霉素抗性的（终浓度为20μg/mL）LB平板上，37℃培养至长出单菌落，挑取长势良好的单菌落继续在含有卡那霉素抗性的（终浓度为20μg/mL）LB平板上划线培养，如此活化三代得到的重组枯草芽胞杆菌菌落接种于50mL含有卡那霉素（终浓度为20μg/mL）的LB培养基中，37℃、200rpm培养24h，然后以2%的接种量接种到1L含有卡那霉素（终浓度为20μg/mL）的LB培养基中，37℃、200rpm培养至 OD₆₀₀为5左右，用作种子液接种发酵罐。

发酵生产工艺：豆粕5-10%、玉米粉1-5%、PPG-20000 0.1-1.0%、蛋白酶0.1-1.0%、淀粉酶0.1-1.0%、磷酸氢二钠（12水）0.2-0.5%、pH自然、温度37℃、搅拌速率600rpm、通风量1 .5(v/v)，溶氧控制在20%以上。发酵过程pH自然，发酵24h后开始测定酶活力，待发酵结束后（一般48h），发酵液通过板框过滤机处理得到粗酶液经喷塔喷干成粉制剂，用于应用测试。

结果如图3所示，表明蛋白酶突变体APR01、APR02、APR03、APR04保持了原有蛋白酶的酶活，同时这些突变体还对醇溶蛋白降解率有显著提高，所以蛋白酶突变体APR01、APR02、APR03、APR04具有很好应用潜力。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 青岛尚德生物技术有限公司

<120> 提高降解醇溶蛋白能力的蛋白酶突变体及其编码基因和应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 379

<212> PRT

<213> 蛋白酶(Bacillus licheniformis)

<400> 1

Met Met Arg Lys Lys Ser Phe Trp Leu Gly Met Leu Thr Ala Phe Met

1 5 10 15

Leu Val Phe Thr Met Ala Phe Ser Asp Ser Ala Ser Ala Ala Gln Pro

20 25 30

Ala Lys Asn Val Glu Lys Asp Tyr Ile Val Gly Phe Lys Ser Gly Val

35 40 45

Lys Thr Ala Ser Val Lys Lys Asp Ile Ile Lys Glu Ser Gly Gly Lys

50 55 60

Val Asp Lys Gln Phe Arg Ile Ile Asn Ala Ala Lys Ala Lys Leu Asp

65 70 75 80

Lys Glu Ala Leu Lys Glu Val Lys Asn Asp Pro Asp Val Ala Tyr Val

85 90 95

Glu Glu Asp His Val Ala His Ala Leu Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly

100 105 110

Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val Gln Ala Gln Gly Phe Lys Gly

115 120 125

Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Ile Gln Ala Ser His

130 135 140

Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala

145 150 155 160

Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val

165 170 175

Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Val

180 185 190

Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn Ser Ser Gly Ser Gly Ser Tyr

195 200 205

Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp

210 215 220

Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Ala Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys

225 230 235 240

Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg Gly Val Val Val Val Ala Ala

245 250 255

Ala Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Asn Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro

260 265 270

Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser

275 280 285

Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Ala Glu Leu Glu Val Met Ala

290 295 300

Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr Pro Thr Asn Thr Tyr Ala Thr

305 310 315 320

Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala

325 330 335

Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn

340 345 350

Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly

355 360 365

Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala Ala Gln

370 375

<210> 2

<211> 1140

<212> DNA

<213> 蛋白酶(Bacillus licheniformis)

<400> 2

atgatgagga agaaatcatt ttggttaggg atgctgacgg cgtttatgtt agtgtttacg 60

atggcgtttt cagatagcgc ttctgctgca caacctgcga aaaatgttga aaaagattat 120

atcgtggggt ttaaatctgg agttaaaacg gcgtctgtga aaaaagatat tattaaagaa 180

tcaggcggca aagtcgataa acagtttcgg attatcaatg ctgcgaaagc gaaacttgat 240

aaagaagcat tgaaagaagt caaaaatgat ccggatgttg cttacgtcga agaagatcat 300

gtcgcacatg cacttgctca gacggtgccg tatggcatcc ctcttatcaa agcagataaa 360

gtccaagcac aaggctttaa aggcgctaat gtcaaagtcg cggtccttga tacgggaatc 420

caagcaagtc atccggatct taatgtggtt gggggtgcgt catttgtcgc gggagaagca 480

tataatacag atggcaacgg tcatggaaca catgttgcgg gaacggtcgc agcgttagat 540

aatacgacgg gtgtgcttgg tgttgcaccg tctgtctcac tgtatgcggt gaaagtcctt 600

aattctagcg gatctggatc ttattcagga attgtgtctg gaatcgaatg ggctacaacg 660

aatggcatgg atgtcatcaa tatgagcctg ggaggcgcga gcggctctac agctatgaaa 720

caagcagtcg ataatgcgta tgcgcgcggt gttgtggtgg tcgcagctgc gggcaattca 780

ggctcatctg gcaatacgaa tacgatcggc tatccggcta aatatgattc agtcattgct 840

gtgggcgcgg tcgattctaa ttctaatcgt gcttctttta gctcagtggg cgcagaactt 900

gaagtgatgg caccgggcgc tggagtgtat agcacctatc cgacaaatac ctatgctaca 960

ctgaatggca cgtctatggc ttcacctcat gttgcaggcg ccgccgctct tatcctgagc 1020

aaacatccta atttgagcgc gagccaggtt cgtaatagac tttcttcaac agcgacgtat 1080

ttgggctcta gcttttatta tggcaaagga ctgatcaatg tcgaagcagc tgcacagtaa 1140

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctctagaat gatgaggaag aaatc 25

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgcggatcct tactgtgcag ctgcttcga 29

<210> 5

<211> 379

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Met Arg Lys Lys Ser Phe Trp Leu Gly Met Leu Thr Ala Phe Met

1 5 10 15

Leu Val Phe Thr Met Ala Phe Ser Asp Ser Ala Ser Ala Ala Gln Pro

20 25 30

Ala Lys Asn Val Glu Lys Asp Tyr Ile Val Gly Phe Lys Ser Gly Val

35 40 45

Lys Thr Ala Ser Val Lys Lys Asp Ile Ile Lys Glu Ser Gly Gly Lys

50 55 60

Val Asp Lys Gln Phe Arg Ile Ile Asn Ala Ala Lys Ala Lys Leu Asp

65 70 75 80

Lys Glu Ala Leu Lys Glu Val Lys Asn Asp Pro Asp Val Ala Tyr Val

85 90 95

Glu Glu Asp His Val Ala His Ala Leu Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly

100 105 110

Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val Gln Ala Gln Gly Phe Lys Gly

115 120 125

Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Ile Gln Ala Ser His

130 135 140

Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala

145 150 155 160

Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val

165 170 175

Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Val

180 185 190

Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn Ser Ser Gly Ser Gly Ser Tyr

195 200 205

Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp

210 215 220

Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Ala Trp Gly Ser Thr Ala Met Lys

225 230 235 240

Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg Gly Val Val Val Val Ala Ala

245 250 255

Ala Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Asn Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro

260 265 270

Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser

275 280 285

Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Ala Glu Leu Glu Val Met Ala

290 295 300

Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr Pro Thr Asn Thr Tyr Ala Thr

305 310 315 320

Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala

325 330 335

Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn

340 345 350

Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly

355 360 365

Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala Ala Gln

370 375

<210> 6

<211> 1140

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6