植物蛋白及其制备方法
阅读说明：本技术 植物蛋白及其制备方法 (Vegetable protein and preparation method thereof ) 是由 周六明 M·伊贝尔 Y·华 C·张 X·孔 Y·陈 X·李 于 2019-09-25 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种植物蛋白分离物及其制备方法,该植物蛋白分离物含有小于10微克、优选地小于5微克的己醛、2-戊基-呋喃、(E)-2,4,庚二烯醛和l-辛烯-3-醇的总和/克干物质。该植物蛋白优选地获得自豆科植物,更优选地获得自豌豆或蚕豆,最优选地获得自豌豆。用于提取该植物蛋白分离物的方法由以下步骤组成：(a)提供含蛋白的种子,(b)研磨所述种子,(c)将研磨的种子悬浮于水中,(d)从所述研磨的悬浮液中提取蛋白,以及(e)在60℃至100℃的温度下并且在4至5.5的范围的pH下,用水洗涤提取的蛋白。(The present invention relates to a plant protein isolate containing less than 10 micrograms, preferably less than 5 micrograms of hexanal, 2-pentyl-furan, (E) -2,4, heptadienal and l-octen-3-ol sum per gram dry matter, and a process for its preparation. The plant protein is preferably obtained from a leguminous plant, more preferably from pea or broad bean, most preferably from pea. The process for extracting the plant protein isolate consists of the following steps: (a) providing a seed comprising protein, (b) grinding the seed, (c) suspending the ground seed in water, (d) extracting protein from the ground suspension, and (e) washing the extracted protein with water at a temperature of 60 ℃ to 100 ℃ and at a pH in the range of 4 to 5.5.)
技术领域
本发明涉及含有少于10μg总挥发性化合物/克干物质的植物蛋白(包括分离物和浓缩物)、优选地豆科蛋白分离物、更优选地豌豆蛋白分离物。与现有技术的植物蛋白分离物相比，此类植物蛋白(包括分离物和浓缩物)、优选地豆科蛋白分离物、更优选地豌豆蛋白分离物在食用时明显地具有低异味的味道。本发明还涉及本发明的植物蛋白(包括分离物和浓缩物)、优选地豆科蛋白分离物、更优选地豌豆蛋白分离物的提取和纯化方法。最后，本发明还涉及本发明的植物蛋白(包括分离物和浓缩物)、优选地豆科蛋白分离物、更优选地豌豆蛋白分离物在食品、饲料和制药行业中的应用。
背景技术
蛋白质与碳水化合物和脂质一起组成我们饮食的重要部分。蛋白质的需求量通常被认为是我们每日食物摄入量的12％至20％。
食用的蛋白质通常是动物来源的(例如肉、鱼、蛋和奶制品)或植物来源的(包括谷类、油性植物和豆科植物)。
在工业化国家，蛋白质摄入主要来自动物来源的蛋白质。值得注意的是，许多研究表明，过量食用动物来源的蛋白质并且显著较少食用植物蛋白质是导致癌症和心血管疾病发生率增加的原因之一。
此外，动物蛋白具有许多缺点，包括具有过敏原性(特别是对于来自奶和蛋的蛋白质)，以及由于动物蛋白生产所必需的集约农业而造成环境退化。
鉴于此，制造商逐渐转向将植物蛋白作为动物蛋白的替代品。实际上，使用植物蛋白代替食品中的全部或部分动物蛋白是已知的做法。
这种替代并不总是容易的，因为植物蛋白的功能特性不同于动物蛋白的功能特性。在这种情况下，功能特性是指对技术转化、储存或家庭烹饪准备期间产生的食品系统感官品质有影响的物理或物理化学特性。
在植物蛋白中，使用豆科植物蛋白是熟知的做法。虽然乳蛋白具有强大的营养优势，但是高生产成本限制了它们在大规模食品加工领域中的使用。作为替代方案，豆科植物蛋白可以替代乳蛋白。特别是豌豆蛋白现在被视为本领域中突破性的蛋白质。豌豆蛋白分离物获得自非GMO来源的种子，而不是大豆蛋白分离物。
某些植物蛋白(特别是豆科植物蛋白和豌豆蛋白)的一个缺点是事实上它们并不是无味的。这意味着它们可能会导致异味，即使在包含它们的产品中也是如此。消费者经常将异味描述为“豌豆味”、“豆腥味”、“青味”或“植物味”。
一种熟知且简单的解决方案是通过将化学化合物引入溶液中来掩盖配制过程期间的异味。这可以由异味掩蔽剂、调味剂和/或异味调节剂制成。不幸的是，这种类型的解决方案通常不能完全发挥作用，这意味着它们不是掩盖了异味，而是仅仅减少了异味。另一个缺点是配方设计师必须购买另外的化合物，从而提高了配制成本。法规(主要是食品和药品法规)也可能成为使用此类化合物的障碍。另一个重要因素是，当今的消费者想要“清洁标签(clean label)”产品，并且在产品标签上包括这些类型的化合物会疏远一些潜在的消费者。
更优选的解决方案是直接使用低异味的蛋白分离物，并且已经在一些解决方案中为植物蛋白分离物生产者提出了一些建议。
例如，WO 2015/071498解释了如何使用湿磨提取方法并且结合乳酸发酵，以提取纯化的豌豆蛋白分离物。该方法能够产生具有中等种类“良好味道”的豌豆蛋白分离物，但遗憾的是它不能产生无味的豌豆蛋白分离物。参考本专利申请的表10，每种豌豆蛋白样品继续被描述为具有“豆腥味”或“豌豆样”味道。
在另一个实例中，WO 2017/120597解释了如何使用盐析沉淀，并且结合高体积蛋白洗涤、特别是用高体积的中性pH和平均温度的水洗涤。该方法涉及大量盐和高体积的中性pH自来水(15至30个豌豆体积)。然而，仍然在豌豆蛋白分离物中检测到“豆腥味(beany)”和“苦味(bitter)”的味道，并且与普通商业豌豆蛋白分离物中的味道处于相同水平(参见图18A、18B和18C)。
不幸的是，目前的商业豌豆蛋白分离物在被食用时仍然会产生异味，这种异味通常被描述为“豆腥味”或“植物样”的异味。仍然需要没有任何异味的、无味的豆科蛋白分离物，优选豌豆。
有鉴于此，本发明的目的是克服或减少现有技术的至少一个缺点、和/或提供有用的替代方案。
发明内容
本发明的第一方面是植物蛋白(包括分离物或浓缩物)，其含有少于10μg的总挥发性化合物/克干物质、优选地少于5μg的总挥发性化合物/克干物质。
在优选的实施例中，总挥发性化合物应理解为己醛、2-戊基-呋喃、(E)-2,4,庚二烯醛和1-辛烯-3-醇含量的总和。因此，在此实施例中，根据本发明的植物蛋白分离物含有小于10μg、优选地小于5μg的己醛、2-戊基-呋喃、(E)-2,4,庚二烯醛和1-辛烯-3-醇的总和/克干物质。在更优选的实施例中，总挥发性化合物应理解为通过本发明方法检测和分析的所有挥发性化合物的总和，其描述如下。
在更优选的实施例中，植物蛋白还含有少于5mg的总皂苷/克干物质。
在甚至更优选的实施例中，植物蛋白从豆科植物中获得，优选地从豌豆或蚕豆中获得，其中豌豆蛋白是最优选的。
本发明的所有蛋白实施例的特征在于明显中性的味道，并且没有“豆腥味”或“植物样”的异味。这些实施例进一步涵盖于本发明的
具体实施方式
中，以及非穷举性实例的列表中。
与来自现有技术的蛋白质相比，根据本发明的蛋白分离物的特征还在于在水中具有改善的溶解度。特别地，根据下述测试确定的，根据本发明的蛋白分离物在20℃和pH 6下在水中的溶解度高于30％、优选地高于40％、更优选地约50％，并且在20℃和pH 7下的溶解度高于40％、优选地高于60％、更优选地高于70％。
本发明的第二方面是其用于获得植物蛋白(包括分离物或浓缩物)、优选地豆科蛋白分离物、更优选地豌豆蛋白分离物的方法。该方法由以下步骤组成：
(a)提供含有蛋白的植物种子，优选地豆科种子，更优选地豌豆种子；
(b)研磨所述种子；
(c)将研磨的种子悬浮于水中；
(d)从所述研磨的悬浮液中、优选地通过在等电pH下热凝固来提取蛋白；
(e)在60℃至100℃、更优选75℃至95℃的温度下，并且在4至5,5、更优选4.5-5的范围的pH下，用水洗涤蛋白；
(f)任选地使在步骤(e)结束时获得的洗涤的蛋白通过剪切泵或均化器以改善蛋白功能性；
(g)任选地对步骤(e)或(f)中获得的蛋白进行干燥。
在优选的实施例中，步骤(b)中的种子研磨直接在水中和无氧下，优选地在双氧的残余浓度小于300μg/升、优选小于200μg/升下进行。残余氧浓度可以根据进一步描述的方案确定。
在更优选的实施例中，在不存在另外的水的情况下进行研磨，并且通过将干燥的粉末和水混合来获得步骤(c)的研磨的悬浮液。这优选地在小于300μg/升的双氧残余浓度下进行，优选地在小于200μg/升的测量值下进行。残余氧浓度可以根据进一步描述的方案确定。
本发明的第三方面是其涉及本发明的植物蛋白(包括分离物或浓缩物)、优选地豆科蛋白分离物、更优选地豌豆蛋白分离物在食品应用、饲料应用、化妆品应用和药物应用中的用途。
通过以下详细描述可以更好地理解本发明。
具体实施方式
术语“植物蛋白”在本文中被认为是从所有类型的植物中提取的所有类型的蛋白。植物必须被理解为植物界(其特征性地含有叶绿体，具有由纤维素组成的细胞壁，产生胚，并且缺乏运动的能力)的各种光合作用的、真核生物的、多细胞的生物中的任何一种。植物包括树木、灌木、草本植物、蕨类植物、苔藓、和某些绿藻。特别地，在本申请中，术语植物适用于豆科，其包括豌豆和蚕豆。其他优选类型的植物是亚麻、燕麦、水稻和小扁豆。
本申请中的“蛋白”应理解为指由一条或多条长链的氨基酸残基组成的分子。在本申请中，蛋白可以是植物天然的或经过修饰的，包括水解的蛋白。这些蛋白可以具有不同的浓度，包括高于80％的分离物或高于50％的浓缩物。
术语“豆科”必须理解为豆科(Leguminosae)的植物。这些植物在豆荚中有种子、有独特的花朵并且通常具有根瘤。这些根瘤含有能够固定氮的共生菌。
术语“豌豆”在本文中被认为是其最广泛的可接受的含义。特别是，它包括“光皮豌豆”和“皱皮豌豆”的所有品种，以及“光皮豌豆”和“皱皮豌豆”的所有突变品种。这些品种涉及通常用于每种豌豆类型的用途(供人食用的食物、动物饲料和/或其他用途)。在本申请中，术语“豌豆”包括属于豌豆属的、并且更具体地属于sativum和aestivum种的豌豆的品种。所述突变品种是具体地被称为“r突变体”、“rb突变体”、“rug 3突变体”、“rug 4突变体”、“rug 5突变体”以及“lam突变体”的那些品种，如在C-L HEYDLEY等人，标题为“Developing novel pea starches[发展中的新颖豌豆淀粉]”,Proceedings of theSymposium of the Industrial Biochemistry and Biotechnology Group of theBiochemical Society[生物化学学会的工业生物化学和生物技术组的讨论会的论文集],1996,第77-87页的文章中所描述。
术语“挥发性”在本文中适用于在常温和常压下容易蒸发的化合物。使用如下所述的色谱方法可以容易地分析这些化合物。
术语“皂苷”在本文中被认为是当与水混合和搅拌时形成肥皂泡的各种植物糖苷中的任何一种。具体地说，这些皂苷是两亲的糖苷，其通过当皂苷在水溶液中振荡时产生的皂状泡沫现象学地分组。它们在结构上基于具有一个或多个亲水性糖苷部分而分组，这些亲水性糖苷部分与亲脂性三萜衍生物组合。
如在本发明的以上发明内容中所述，本发明的第一方面是植物蛋白分离物(包括分离物或浓缩物)，其含有少于10μg的总挥发性化合物/克干物质、优选地含有少于5μg的总挥发性化合物/克干物质。
在优选的实施例中，总挥发性化合物必须被理解为己醛、2-戊基-呋喃、(E)-2,4,庚二烯醛和1-辛烯-3-醇含量的总和(参见图1中的式)。在更优选的实施例中，总挥发性化合物必须理解为使用下述方法通过本发明检测和分析的所有挥发性化合物的总和。这些具体的挥发性化合物与“豆腥味”、“植物样”或“豌豆样”味道有关。下面的实例表明，本发明的蛋白含有少于10μg的这些挥发性化合物/克干物质。此外，在本申请的实例部分中，示出没有商业蛋白分离物或已知的提取方法(不包括使用溶剂)获得了此结果。
在更优选的实施例中，植物蛋白分离物还含有少于5mg的总皂苷/克干物质。
在甚至更优选的实施例中，植物蛋白分离物获得自豆科植物，优选地获得自豌豆或蚕豆，最优选地来自豌豆蛋白。
异味和植物蛋白组合物之间的联系是本领域技术人员所熟知的。导致此类异味的化合物可分为两类。本领域技术人员将第一类描述为由典型分子量范围为30-300g.mol-1的挥发性化合物组成。此类化合物的实例有己醛、2-戊基-呋喃等。这些挥发性化合物经常导致“豆腥味”、“植物样”和/或“豌豆样”味道/异味。如果像“豆腥味”或“豌豆味”之类的异味和挥发性化合物之间的联系是熟知的，那么已知的是，目前没有任何方法和分离物可以达到足够低的水平使消费者几乎不会发现任何异味。只有一种方法涉及使用溶剂，这在工业过程中会是严重的缺点。
这种挥发性化合物直接存在于豆科植物、特别是豌豆中，但它们也可以在蛋白提取期间通过内源性酶如脂加氧酶合成，脂加氧酶会氧化残余的脂质。
通过HS-SPME分析程序评估总挥发性化合物。该程序通过检查在Sorayya等人,Volatile flavor profile of select field pea cultivars as they are affected bythe crop year and processing[受作物年份和加工影响的精选农田的豌豆品种的挥发性风味特征],Food Chemistry[食品化学],124(2011),第326页至第335页的变化来完成。将1g豌豆蛋白样品悬浮在100ml 15％(w/v)NaCl水溶液中。将5ml溶液混合后，将其置于样品瓶中。SPME纤维(50/30μm，DVB/CAR/PDMS，Supelco公司(Supelco Co.)，上海，中国)被用于风味提取。每次使用前，将纤维在250℃调理1小时。将1g豌豆蛋白样品在室温悬浮于100mL15％(w/v)NaCl(AR)水溶液中。混合后，将5ml溶液置于30mL透明玻璃小瓶(Supelco公司，上海，中国)中，然后用含有特氟隆涂覆的橡胶隔膜的盖子密封，并装配小磁力搅拌棒。添加内标物2-甲基-3-庚酮(1mg/L溶液)(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，上海，中国)。将小瓶中的样品在60℃在水浴中加热30分钟，并使用SPME纤维提取30min，并且吸附过程的磁力搅拌速率为500rpm。然后，将纤维注射入GC-MS(SCIONSQ-456-GC，Bruker公司(Bruker)，美国)，其配备有毛细管柱，具有DB-WAX的极性树脂(30m×0.25mm内径，0.25μm膜厚度；安捷伦科技公司(Agilent Technologies Inc.),广州，广东，中国)。使用不分流进样。色谱仪温度设定在40℃、等温线为3分钟，以6℃ min-1的速率升温至100℃，然后以10℃ min-1的速率升温至230℃，最终等温线为7分钟。质谱法在70eV的电子碰撞模式下运行。质谱仪扫描质量从m/z 33到350。电离源设定在200℃，并且传输线设定在250℃。通过与质谱库进行比较并通过计算和比较一系列烷烃(C8-C30)的GC保留指数来鉴定挥发性化合物。保留指数是基于在相同色谱条件下计算的公开数据。通过电子积分总离子电流(TIC)峰下的面积获得定量数据。然后使用内标物2-甲基-3-环庚酮计算相对量，并且通过考虑干物质进行归一化。
关于与异味相关的第二类，本领域技术人员已知具有40-1,000g.mol-1的典型分子量范围的非挥发性化合物。对于“苦味”异味，它是皂苷、氧化磷脂等。对于“咸味”，它们是氯化钠、氯化钾等。对于“酸味”，它们是丁酸、乙酸等。皂苷及其苦味的异味是豆科蛋白、特别是在豌豆中更具挑战性的化合物。
根据受以下启发的改进方案分析了皂素提取物：Lynn Heng等人,Bitterness ofsaponins and their content in dry peas[干豌豆中皂苷的苦味及其含量],Journal ofthe Science of Food and Agriculture[食品与农业科学杂志],86(2006),1225-1231，以及K.Decroos等人,Simultaneous quantification of differently glycosylated,acetylated,and2,3-dihydro-2,5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4-one-conjugatedsoy saponins are performed using reversed-phase high-performance liquidchromatography with evaporative light scattering detection[使用反相高效液相色谱和蒸发光散射检测对不同糖基化、乙酰化和2,3-二氢-2,5-二羟基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮缀合的大豆皂苷进行同时定量],Journal of Chromatography A[层析杂志A],1072(2005)185-193。将豌豆蛋白样品用己烷(AR,西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich),上海，中国)脱脂，然后回流6小时，并且随后将豌豆蛋白在通风橱中风干过夜。将脱脂豌豆蛋白(1g)用40ml 60％(v/v)甲醇(HPLC级，西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，上海，中国)在25℃提取4小时，伴随在培养箱振荡器(SWB15,赛默飞世尔公司(Thermo Fisher),上海，中国)中以200rpm持续振荡。在提取之前，添加100mg kg-1的内标物马萘雌酮(雌激素样类固醇，3-羟基雌-1,3,5,7,9-五烯-17-酮)。将粗提物通过无灰滤纸(Whatman,110mm,国药集团化学试剂有限公司(Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.),上海，中国)过滤。通过在40℃真空蒸发除去澄清的滤液中的甲醇。使用1L圆底烧瓶在不到15分钟内进行该蒸发步骤。用蒸馏水将浓缩物补充至5mL，并且通过Sep-Pak C18固相萃取柱(沃特斯Plus tC18柱体,37–55μm,苏州，中国)，随后用15mL水冲洗以除去未结合的材料。用10ml 100％(v/v)甲醇(HPLC级,西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich),上海，中国)洗脱结合的化合物，并且通过LC-MS分析。接下来是LC-MS色谱条件。毛细管电压为4.4KV，锥孔电压为40V，离子源温度为100℃，溶剂气体温度为250℃，光电倍增器电压为700V，并且流速为4.2L/h。液相色谱在沃特斯2690液相色谱系统上进行，该系统配有Lichrospher C-18(2.1×250mm，沃特斯)柱和检测器沃特斯996。柱温为35℃，并且注射体积为10uL，流速为0.3mL/min。LC-MS实验的梯度洗脱条件是0.5％甲酸(国药集团化学试剂有限公司(AR Sinopharm Chemical ReagentCo.,Ltd.),上海，中国)，持续30分钟(0-30min)，然后是乙腈(HPLC级，西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，上海，中国)与0.5％甲酸的比率为20:80，持续10min(30-40min)，以及比率为40:60，持续1分钟(40-41min)，并且然后调节至0.5％甲酸。DDMP皂苷和皂苷B的峰质谱中分子离子[M+H]+的m/z比分别为1069和943。使用内标物马萘雌酮计算皂苷的相对量，并且通过考虑干物质进行归一化。
与来自现有技术的蛋白质相比，根据本发明的蛋白分离物的特征还在于在水中具有改善的溶解度。特别地，根据本发明的蛋白分离物在20℃和pH 6下在水中的溶解度高于30％、优选地高于40％、更优选地约50％，并且在20℃和pH 7下的溶解度高于40％、优选地高于60％、更优选地高于70％。
可以用本领域已知的任何方法测量溶解度。优选地，将使用以下方案进行测量：
-20℃下，将2.0g样品和100g的蒸馏水置于400mL烧杯中。
-将pH用1N HCl和/或1N NaOH调节至6或7，并且将混合物用蒸馏水准确补足至200.0g。
-将此混合物搅拌30分钟并且随后以3000×g离心15分钟。
-在离心后，准确抽取25.0g上清液至结晶皿中(m1)。将结晶皿置于103℃的烘箱中至其达到恒定质量(m2)。
-溶解度＝((m2-m1)/25)*100
本发明的第二方面是其用于获得植物蛋白(包括分离物和浓缩物)、优选地豆科蛋白分离物、更优选地豌豆蛋白分离物的方法。该方法涉及如下步骤：(a)提供含有蛋白的植物种子，优选地豆科种子，更优选地豌豆种子；
(b)研磨所述种子；
(c)将研磨的种子悬浮于水中；
(d)从所述研磨的悬浮液中提取蛋白；
(e)在60℃至100℃、更优选75℃至95℃的温度下，并且在4至5,5、更优选4,5至5的范围内的pH下，用水洗涤蛋白；
(f)任选地使在步骤(e)结束时获得的洗涤的蛋白通过剪切泵或均化器以改善蛋白功能性；
(g)任选地对步骤(e)或(f)中获得的蛋白进行干燥。
在步骤(a)中，适合于本发明的植物种子可以从与食物相容的植物种子列表中选择，特别是豌豆、蚕豆、燕麦、小扁豆和亚麻……豌豆种子确实是最好和最适合的种子，紧接着是蚕豆。
步骤(b)旨在将种子研磨成粉末，这可以通过本领域技术人员已知的每种方法完成。它可以包括先前的浸泡、漂白或甚至熟知的烘焙步骤，其用于抑制内源性酶如脂加氧酶。可以在将种子混入水中之前将种子研磨成粉末，该过程称为“干磨”。然而，也可以在将种子悬浮在水中时进行研磨，也称为“湿磨”过程。
步骤(c)的目标是将研磨的粉末悬浮在水中。在湿磨的情况下，在研磨之前引入水。在干磨过程中，用水以20％-30％干重、优选地25％干重的浓度引入粉末。
步骤(d)的目标是从研磨的种子中提取蛋白。湿法提取方法特别适合本发明。优选的方法在US 7186807(B2)中以其全文描述，将其通过引用并入本申请中。
在该专利方法的第一步中，将豌豆研磨获得的粉末悬浮在水中，该豌豆已经预先清洗、分类和漂白。当将粉末悬浮在水中时，最有利的是选择平均粒度等于或小于100μm的粉末，以20％-30％干重，优选地25％干重的浓度。溶液的pH不是限制因素，但最有利的是不校正悬浮液的pH，这意味着在6.2和7之间的pH范围内工作。
在第二步中，最有利的是将此含水粉末悬浮液直接暴露于离心滗析器的过程中。这可以防止豌豆纤维级分通过先前的筛分被除去。申请人公司观察到，根据马铃薯淀粉厂中使用的配置，使用离心式滗析器进行这种分离操作，使可能容易地将其分成两个不同的级分，一方面是可溶物和蛋白质，以及另一方面是纤维和淀粉。
在第三步中，蛋白质能够容易地从含有由此获得的可溶物和蛋白质的混合物的级分中分离。这通过选择若干种技术中的一种来实现，这些技术用于在其等电pH下沉淀蛋白质、和/或超滤类型的膜分离。优选的方法是使用蛋白质的组合的等电点pH和热凝固，称为“热凝固术”。
这些获得的蛋白质(在豌豆的情况下主要是球蛋白)是步骤(e)的原料。在60℃至100℃、更优选地75℃至95℃、甚至更优选地约90℃的温度的水浴中，优选地用柠檬酸，将蛋白溶液(通常在商业重量下小于20％干物质)调节至4至5.5的pH、优选地调节至pH 4.5-5、更优选地pH 4.5。蛋白溶液可以直接泵入板式过滤器或离心机中以分离乳清，或者在可以长达30分钟的接触时间后泵入板式过滤器或离心机中以分离乳清。然后，可以用1至5体积的水，在调节至4至5.5的pH、优选地调节至4.5-5的pH、更优选地调节至pH 4.5，在60℃至100℃、更优选在75℃至95℃、甚至更优选地在约90℃的温度下洗涤蛋白凝乳，优选地洗涤2次。然后，将洗涤的蛋白凝乳固定并重悬于蒸馏水中，以获得范围从10％至12％的固体含量，并且用2.0M NaOH将pH调节到6.5至7.0。该步骤的一个选择可以是以高压均质化(20MPa)和喷雾干燥结束。在一个替代实施例中，步骤(d)和(e)可以同时进行。在这种情况下，在添加1至5体积的水之后，通过在60℃至100℃、更优选地在75℃至95℃、甚至更优选地在约90℃的温度下和在pH 2.5下加热，将蛋白凝固，优选地热凝固。这三个参数对于获得具有足够感官品质的分离物是必不可少的。通过在约90℃和pH4.5下加热，用1至5体积的水获得最佳结果。
在第二优选的实施例中，步骤(b)中的种子研磨在无氧下进行。无氧必须理解为氧的残余含量小于300ug/l，优选地小于200ug/l。残余氧含量用本领域中常见和已知的装置(例如测氧计)测量，优选地在15℃测量。优选的方法是干磨，但是也可以使用湿磨。在干磨的情况下，可以通过可调谐二极管激光气体分析仪(TDL，梅特勒-托利多国际贸易有限公司(Mettlo Toledo)，上海，中国)分析氧，而在湿磨的情况下，可以使用溶解氧分析仪(M400，梅特勒-托利多国际贸易有限公司(Mettlo Toledo)，上海，中国)分析氧。结合在研磨步骤期间不存在氧和步骤(d)的高温酸洗似乎产生协同作用并产生高质量水平的豆科豌豆蛋白分离物，优选地豌豆蛋白分离物。与本发明的结果不同，仅用低氧研磨不会产生具有良好感官品质的蛋白。这种低残余氧含量可以用工业上熟知的方法获得，例如在种子被研磨的容器中吹扫氮气。在更优选的实施例中，步骤(c)和(d)也在无氧下进行，优选地氧的残余含量小于300μg/l、优选地小于200μg/l。在处理装置的顶部空间中使用氮气和无溶解氧的水是确保这种实施例的常用方法。
在如上所述的步骤(d)的两个实施例中，如果需要，可以用剪切泵进行所得蛋白的任选均质化以提高溶解度。像巴氏灭菌或引入食品级辅助化合物等常见的已知方法也可添加到该方法中。最后，获得的蛋白质可以用普通技术如喷雾干燥器干燥。
将参考以下实例和附图将更好地理解本发明。这些实例旨在施代表本发明的具体实施例，而不旨在限制本发明的范围。
附图说明
图1：主要挥发性化合物的化学结构与“豆腥”或“植物”味相关。
图2：根据实例3的发明方法(inventive process)#1-高温和酸洗。
图3：根据实例4的发明方法#2-低氧研磨和高温酸洗。
图4：来自现有技术和本发明的蛋白分离物的比较。
实例
实例1：现有技术方法#1，涉及溶剂纯化
此实例以感官角度示出了参考蛋白。它使用必须从工业角度避免(爆炸危险、清洁标签……)的溶剂。
将清洁并且去壳的干黄豌豆在20℃研磨，并且然后将豌豆粉末以1:5(w/v)的比率在4℃悬浮在己烷-乙醇共沸混合物(82:18,v/v)中以提取脂质。将浆液低速搅拌1.0h，并且然后真空过滤。将滤饼通过20目的筛子。将该程序重复五次。将脱脂豌豆粉在20℃以粉末溶剂比为1:5(w/v)浸入95％(v/v)乙醇中1.0小时。真空过滤后，通过在60℃真空旋转蒸发除去滤饼中的残余溶剂。将脱脂豌豆粉以1:9(w/v)粉末与水的比率悬浮在蒸馏水中，并且用2mol L-1NaOH将pH调节至7.0。在20℃搅拌1.0h后，将悬浮液在3,000g下离心15min以回收上清液(蛋白级分)。将蛋白提取溶液直接通过蒸汽注入加热至125℃-130℃持续30秒以使内源酶失活，并使用板式换热器冷却至50℃，并且然后通过用2mol L-1HCl将pH调节至4.5来沉淀，并且以3,000g离心15分钟。将蛋白凝乳在20℃以1:5(w/v)的比率浸入85％(v/v)乙醇中三次，持续1.0h。真空过滤后，滤饼通过在60℃真空旋转蒸发除去残余溶剂。然后将醇洗涤的蛋白粉以1:9(w/v)粉末与水的比率重新悬浮在蒸馏水中，并且用2mol L-1NaOH将pH中和至7.0。将蛋白溶液冷冻干燥以获得没有任何异味的豌豆蛋白分离物。获得样品“现有技术方法#1-溶剂”。
实例2：现有技术方法#2，涉及浸泡、湿磨和等电沉淀
将干黄豌豆在蒸馏水中、以豌豆与水的比率为1:5(w/v)、在室温混合10小时。将去壳和浸泡的豌豆在氧存在下，以湿豌豆与水的比率为1:4(w/v)研磨。一旦用螺杆挤出机分离，将水提取物在3,000g下离心15分钟，以除去淀粉和内部纤维，从而获得蛋白溶液。将蛋白溶液直接通过蒸汽注入加热至125℃-130℃持续30秒以使内源酶失活，并且然后使用板式换热器冷却至50℃，并且然后通过用2mol L-1HCl将pH调节至4.5来沉淀，并且以3,000g离心15分钟。将蛋白凝乳以凝乳与水的比率为1:1(w/v)重新悬浮在蒸馏水中，以获得10％至12％范围的固体含量，并且用2mol L-1NaOH中和至pH 7.0。该方法的这些步骤之后是高压均化(20MPa)、加热处理(120℃，30s)、快速蒸发、和喷雾干燥(180℃，80℃)。获得样品“现有技术方法#2”。
实例3：发明方法#1，涉及提取的蛋白的高温酸洗
将干黄豌豆去壳，并且在蒸馏水中、以豌豆与水的比率为1:5(w/v)、在室温混合。然后在氧存在下将豌豆在8.5-9.0的pH下研磨。一旦用螺杆挤出机分离，将溶液以3,000g离心15分钟以除去不溶物质(主要是淀粉和内部纤维)，并且获得了粗蛋白溶液。然后用2MHCl将粗蛋白溶液调节至pH7.0-7.5，并且通过蒸汽注入直接加热至125℃-130℃持续30秒以使内源酶失活，并且然后使用板式换热器冷却至50℃。然后通过用2mol L-1HCl将pH调节至4.5来沉淀蛋白，并以3,000g离心持续15min。通过离心分离蛋白凝乳并且浸入2重量份的90℃蒸馏水(将其调节至pH4.5)中。
在温和搅拌下接触时间30分钟后，将蛋白溶液泵入板式过滤器中以将蛋白与水分离，并且将获得的蛋白凝乳悬浮在蒸馏水中以获得10％至12％范围的固体含量，并且用2.0M NaOH调节至7.0的pH。然后，将其再加热至125℃-130℃持续30秒并且喷雾干燥(180℃，80℃)。获得样品“发明方法#1-HTAW伴随氧”。
为了证明高温和酸性pH洗涤之间的协同作用，发明方法#1也被重复三次，稍作了修改：
-低温洗涤(50℃)和在酸洗pH(4.5)下
-高温在高pH(7.0)和酸性洗涤pH(4.5)下
-低温洗涤(50℃)和在中性洗涤pH(7)下
通过比较实例3的结果，这有助于解释如何通过两种参数的组合，才能获得创新的蛋白分离物。
实例4：发明方法#2，涉及高温酸洗和低氧研磨
将干黄豌豆去壳，并且在蒸馏水中、以豌豆与水的比率为1:5(w/v)、在室温混合。然后将豌豆在200μg/l以下的无氧水中以1:4(w/v)的比率研磨，并且然后用螺杆挤出机分离。在氮气氛下静置1小时后，将蛋白溶液在3,000g下离心15分钟以除去不溶物质(主要是淀粉和内部纤维)，并且然后获得粗蛋白溶液。将粗蛋白溶液调至pH7.0-7.5，同时仍在氮气氛下，并且然后通过蒸汽注入直接加热至125℃-130℃持续30秒，并且最后用板式换热器冷却至30℃-40℃。然后通过用2mol L-1HCl调节至pH4.5使蛋白沉淀，并以3,000g离心持续15分钟。
通过离心分离蛋白凝乳并浸入2重量份的90℃蒸馏水(将其调节至pH4.5)中。在温和搅拌下接触时间30分钟后，将蛋白溶液泵入板式过滤器中以将蛋白与水分离。在用pH为4.5的90℃水重复该步骤两次后，将蛋白溶液泵入板式过滤器中以将蛋白与水分离，并且将获得的蛋白凝乳悬浮在蒸馏水中，以获得范围为10％-12％的固体含量，并且用2.0M NaOH调节至7.0的pH。然后再加热至125℃-130℃持续30秒并且喷雾干燥(180℃，80℃)。获得样品“发明方法#2-HTAW与低氧研磨组合”。
为了示出无氧研磨和高温和酸性pH洗涤的协同作用，还在没有高温和酸性pH洗涤的情况下再现了发明方法#2。
实例5：感官测试方法
样品制备：将4％蛋白粉在室温下(约23℃)溶解于去离子水中
小组成员：10名接受了训练的人
感官评估基于3个描述符：豆腥味、苦味和涩味。每个描述符的比例在1到10之间，其中10是最好的分数，1是最差的。最终的感官评分取自所有小组成员和所有3个类别中的总分的平均值。
实例6：比较现有技术和实例1至4中产生的发明蛋白分离物
下表1比较了实例1至4中产生的所有蛋白分离物。参考商业蛋白分离物也包括在比较中。
结果清楚地表明：
·如预测的那样，通过溶剂参考方法获得了更好的样品。
·只有涉及高温酸洗的过程才会产生感官评分高于7并且总挥发性化合物低于10μg/g的分离物，这意味着它们具有与溶剂参考方法最接近的数字。
·高温酸洗与无氧研磨相结合，导致可获得甚至更好的质量，这意味着总挥发性化合物低于5μg/g。仅用无氧研磨产生了中等质量的产品。
总之，图4清楚地表明，本发明的方法导致之前从未达到的蛋白量水平。其感官评分和挥发物含量比商业蛋白更接近溶剂参考。从工业角度来看，没有其他溶剂是如此可用的。
实例7：现有技术分离物与发明分离物在水中的溶解度比较
将使用以下方案测量溶解度：
-20℃下，将2.0g的样品和100g的蒸馏水置于400mL烧杯中。
-将pH用1N HCl和/或1N NaOH调节至6或7，并且将混合物用蒸馏水准确补足至200.0g。
-将此混合物搅拌30分钟并且随后以3000×g离心15分钟。
-在离心后，准确抽取25.0g上清液至结晶皿中(m1)。将结晶皿置于103℃的烘箱中至其达到恒定质量(m2)。
-溶解度＝((m2-m1)/25)*100，以每100g溶液中的干物质的g数表达
为了具有可比性，如下所述，使用OPA方法测量所有蛋白样品的水解度。
原理：
样品的游离氨基酸的“氨基氮”基团与N-乙酰基-L-半胱氨酸和邻苯二甲酰基二醛(OPA)反应以形成异吲哚衍生物。
在该反应过程中形成的异吲哚衍生物的量与游离氨基氮的量是化学当量的。通过在340nm下吸光率的增加测量的是异吲哚衍生物。
程序：
将有待分析的样品的准确称重的测试样品P*引入到100ml烧杯中。(取决于样品的氨基氮含量，该测试样品将是从0.5至5.0g)。
添加约50ml的蒸馏水，均化并且转移到100ml量筒中，添加5ml的20％SDS并且用蒸馏水补足体积；在1000rpm下在磁搅拌器上搅拌15分钟。
将烧瓶1的量的Megazyme试剂盒的1个片剂溶解在3ml的蒸馏水中并且搅拌，直至完全溶解为止。提供一个片剂/测试。
临用前制备该溶液1号。
反应直接在分光光度计比色皿中发生。
o空白：
引入3.00ml的溶液1号和50μl的蒸馏水。
o标准物：
引入3.00ml的溶液1号和50μl烧瓶3的量的Megazyme试剂盒。
o样品：
引入3.00ml的溶液1号和50μl的样品制剂。
混合比色皿并且在340nm下的分光光度计上在约2分钟之后读取溶液的吸光率测量值(A1)(分光光度计配备有具有1.0cm光程的比色皿，其可以在340nm的波长下测量，并且根据制造商的与其相关的技术手册中描述的程序进行验证)。
通过将烧瓶2的量的100μl的Megazyme试剂盒的OPA溶液添加到分光光度计比色皿来立即开始反应。
混合比色皿并且将其放置在黑暗中，持续约20分钟。
接下来，在340nm下的分光光度计上读取空白、标准物和样品的吸光率测量值。
计算方法：
表达为产品本身的质量百分比的游离氨基氮的含量由下式给出：
其中：ΔA＝A2–A1
V＝烧瓶的体积
M＝以g为单位的测试样品的质量
6803＝在340nm下的异吲哚衍生物的消光系数(以L.mol-1.cm-1为单位)。
14.01＝氮的摩尔质量(以g.mol-1为单位)
3.15＝比色皿中的最终体积(以ml为单位)
0.05＝比色皿中的测试样品(以ml为单位)
水解度(DH)由下式给出：
其中蛋白氮根据标准ISO 16634的DUMAS方法确定。
下表概括了对发明方法分离物以及现有技术分离物的所有这些分析：
从上表内容中可以清楚地看出，发明方法样品#1和#2是仅有的在pH 6下具有高于30％、优选地高于40％、更优选地约50％的溶解度，和在pH 7下具有高于40％、优选地高于60％、更优选地高于70％的溶解度的样品。
不能用相同范围内的水解度来解释这种差异：我们的发明方法也对发明分离物的功能特性产生了影响，尤其是提高了其在pH 6和7下的溶解度。
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