一种大豆脱毒的方法及脱毒的大豆
阅读说明：本技术 一种大豆脱毒的方法及脱毒的大豆 (Method for detoxifying soybeans and detoxified soybeans ) 是由 郑小娟 付夏娜 余佳 王翠霞 唐丹 王灿 张瑞华 于 2020-12-18 设计创作，主要内容包括：本发明提出了一种大豆脱毒的方法,将大豆处理后浸泡于复合微生物菌液中,微波处理,发酵,再加入钝化剂处理后,有机溶液蒸汽处理,干燥,得到脱毒大豆。本发明采用微波辅助,钝化剂参与反应,从而钝化抗营养因子,复合微生物菌液进行发酵脱毒,进一步改善大豆口感和营养,化学溶剂+物理蒸汽脱除残余抗营养因子,方法简单,能够对大豆起到有效脱毒,且不会重新引发毒性,可以实现长效脱毒的效果。(The invention provides a method for detoxifying soybeans, which comprises the steps of soaking the processed soybeans in a compound microbial liquid, performing microwave treatment, fermenting, adding a passivator for treatment, performing steam treatment on an organic solution, and drying to obtain detoxified soybeans. The invention adopts microwave assistance, the passivator participates in the reaction, thereby passivating the anti-nutritional factors, the compound microbial liquid is fermented and detoxified, the taste and nutrition of the soybeans are further improved, the residual anti-nutritional factors are removed by chemical solvent and physical steam, the method is simple, the soybeans can be effectively detoxified, the toxicity is not caused again, and the effect of long-acting detoxification can be realized.)
技术领域
本发明涉及农产品加工技术领域，具体涉及一种大豆脱毒的方法及脱毒的大豆。
背景技术
大豆及大豆制品是中国人的重要食品之一，在中华民族繁衍生息中起着极其重要作用。自上世纪50年代初开始，许多国家为了弥补食品蛋白质营养的供给不足，大力发展以大豆蛋白质营养作为新兴蛋白质的供体，并将其广泛应用与研究。
根据中国轻工业出版社《大豆制品工艺学》一书论：大豆中的胰蛋白酶抑制素约有7-10种，迄今为止，其中有两种胰阮酶已被科学家提纯出来，其余还有众多的胰蛋白酶抑制素至今无法提取。胰蛋白酶抑制素的热稳定性很高，大豆在100℃加热60分钟时，胰蛋白酶抑制素残存活性仍有89％以上，而且再增加热处理的时间也并不能明显降低它的活性。这是大豆生产工艺上最为关注的难题。大豆是人类不能生食的食物，人类要从大豆中摄取蛋白质营养，就必须通过热加工，由于大豆中有胰蛋白酶抑制素的存在，大豆一旦加热至55℃-65℃时，胰蛋白酶抑制素则通过高温高酸高碱等化学及生物作用，使得大豆蛋白质经催化而产生热变性，大大地破坏了大豆蛋白质的天然结构，使部份或大部份的蛋白质变性而消失。在大豆及豆制品中只要还残存胰蛋白酶抑制素，在人们吃整粒大豆时，就会有以下现象存在：消化率不足35％，余下大部份的豆片成份从粪便排出体外，导致消化不良的同时还要闹肚子，也是部份人群不敢吃用大豆与豆制品之原故；不但如此，当人们食用大豆及豆制品入肠胃后，胰蛋白酶抑制素不但阻止大豆本身的蛋白营养消化吸收，同时还要破坏和阻止体内其它蛋白质营养的消化吸收，而且还要产生毒性，有害有损人体健康，还会导致食用者食物轻微中毒，中毒症状主要表现为腹痛、恶心、胀胃、腹泻、头晕、营养不良并引发多种疾病。
CN102511746B公开了一种整粒大豆脱毒熟化技术，采取将整粒大豆抛光处理，在未亲水的状态下放入蒸馏罐，蒸馏罐连接蒸汽源，并在蒸汽源的水中添加乙醇常压下进行脱毒蒸馏；后在蒸汽源的水中添加乙酸，蒸馏；然后在蒸汽源中再添加乙醇，再蒸馏。包装，得产品。采用该方法虽然可以有效使得大豆中胰蛋白酶抑制剂、嘌呤类物质降低，但效果不佳，且大豆中溶于乙酸溶液或乙醇溶液的物质也会随着蒸馏的过程被溶解而使得大豆中的营养成分下降。
CN 107183543 A公开了一种整粒黄豆量子脱毒熟化方法，包括以下步骤：选材步骤，量子渗透、量子谐振纠缠、量子快速亲水处理步骤，快速烘干步骤，乙醇脱毒蒸馏步骤，乙酸蒸馏步骤。采用该方法可以使得大豆中的抗营养因子、有害成分降低，但不能有效改善大豆的豆腥味，提高大豆蛋白的溶解度，从而提高大豆的口感和营养性。
因此，开发一种能够通过简单高效的方法脱除大豆中的大部分毒素，且能够保持大豆高营养价值的方法从而使得人民可以食用到安全的大豆将具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提出一种大豆脱毒的方法及脱毒的大豆，通过采用微波辅助，钝化剂参与反应，从而钝化抗营养因子，复合微生物菌液进行发酵脱毒，进一步改善大豆口感和营养，化学溶剂+物理蒸汽脱除残余抗营养因子，方法简单，能够对大豆起到有效脱毒，且不会重新引发毒性，可以实现长效脱毒的效果。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种大豆脱毒的方法，将大豆处理后浸泡于复合微生物菌液中，微波处理，发酵，再加入钝化剂处理后，有机溶液蒸汽处理，干燥，得到脱毒大豆。
作为本发明的进一步改进，具体包括以下步骤：
S1.将大豆洗净、干燥后，表面进行抛光处理；
S2.将碳源、氮源、维生素和无机盐用无菌水溶解，混合均匀后，用PBS溶液调节培养基pH值，紫外线灭菌备用，得到营养液；
S3.将双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、产朊假丝酵母菌、地衣芽孢杆菌分别接种到高氏培养基中划线，厌氧培养，然后分别培养成菌种种子液；
S4.将步骤S3制得的菌种种子液分别接种于步骤S2得到的营养液中，厌氧培养，混合并稀释后得到复合微生物菌液；
S5.将步骤S1处理后的大豆加入步骤S4中的复合微生物菌液中，所述复合微生物菌液将所述处理后的大豆完全浸泡，微波处理，控制菌液的温度，发酵处理第一时间段后，得到第一次脱毒大豆体系；
S6.将半胱氨酸和无花果蛋白酶加入步骤S5中所述第一次脱毒大豆体系中，保持原处理条件继续处理第二时间段，过滤，得到第二次脱毒大豆；
S7.将丙三醇、柠檬酸、乙二胺溶于水中，混合均匀后，得到混合液；
S8.将步骤S7得到的混合液装入容器中，将步骤S6得到的第二次脱毒大豆放置于上层筛网，加盖并安装冷凝管，加热，蒸汽处理第三时间段，得到第三次脱毒大豆；
S9.将第三次脱毒大豆进行微波干燥；
S10.将微波干燥后的大豆进行紫外灭菌，称量，包装。
作为本发明的进一步改进，所述碳源选自葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、淀粉、糖蜜中的一种或几种混合；所述氮源选自氨水、尿素、铵盐、硝酸盐、氨基酸；所述维生素选自维生素C、维生素B1、维生素B2、维生素A、维生素K、维生素B12、维生素D、维生素E中的一种或几种混合；所述无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、氯化铁、硫酸锌、硫酸铜、硫酸锰、氯化锌、氯化铜、氯化锰中的一种或几种混合。
作为本发明的进一步改进，所述糖蜜包括甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜，质量比为1：(1-5)；所述氨基酸选自甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸、亮氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甲氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、苯氨酸中的一种或几种混合。
作为本发明的进一步改进，所述碳源、氮源、维生素和无机盐的质量比为(12-20)：(3-7)：(0.5-1)：(0.1-0.5)。
作为本发明的进一步改进，步骤S2中所述pH值调节至6.5-7.5；步骤S3中所述双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、产朊假丝酵母菌、地衣芽孢杆菌的质量比为10：(2-5)：(1-3)：(2-7)；所述厌氧培养条件为27-35℃，湿度为75-85％，培养1-2天；所述菌种种子液的含菌量为108-109cfu/mL。
作为本发明的进一步改进，步骤S4中所述双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、产朊假丝酵母菌、地衣芽孢杆菌的接种量分别为2-5％(v/v)、1-3％(v/v)、1-4％(v/v)、2-4％(v/v)，所述厌氧培养条件为27-35℃，湿度为75-85％，培养2-4天，所述稀释倍数为100-1000倍。
作为本发明的进一步改进，步骤S5中所述微波处理功率为1000-2000W，所述菌液的温度控制在27-37℃之间，所述第一时间段为2-3h；步骤S6中所述半胱氨酸和无花果蛋白酶的加入量分别为5-12wt％和10-17wt％，所述第二时间段为1-2h。
作为本发明的进一步改进，步骤S7中所述丙三醇、柠檬酸、乙二胺、水的质量比为(2-5)：(1-7)：(2-4)：100；步骤S8中所述第三时间段为10-20min，步骤S9中所述微波干燥的功率为200-400W。
本发明进一步保护一种上述的大豆脱毒的方法制得的脱毒的大豆。
本发明具有如下有益效果：大豆中的胰蛋白酶抑制素主要分为2类，分别为库尼兹(Kunitz)胰蛋白酶抑制素(KTI)和鲍曼-贝尔克(Bowman-Birk)抑制素(BBI)，其中，BBI是由7个二硫键交联而成的分子，7个二硫键赋予该分子结构上的稳定性，因此，BBI对于热、酸、碱等是极其稳定的，本发明采用混合微生物制剂对整粒大豆进行脱毒，由于微生物的酶系繁杂,能够高效分解复杂多变二硫键以及其中间产物，最后能将大豆中胰蛋白酶抑制素彻底分解，另外，还可以将其它抗营养因子分解,如植酸、单宁、纤维素等，大大地改善菜大豆的口感,提高大豆中营养成分的利用率，最后，微生物利用自身代谢作用,可以产生香味物质或香味的前体物质从而提高大豆脱毒后的香味。
本发明通过添加钝化剂半胱氨酸和无花果蛋白酶，无花果蛋白酶是一种巯基蛋白酶，两者协同可以有效钝化胰蛋白酶抑制素，其硫醇与二硫化物的交换反应引起二硫键裂解，从而有效使得胰蛋白酶抑制素分解脱除；本发明在微波处理条件下，可以钝化大豆中的抗营养因子如嘌呤、胰蛋白酶抑制素等，从而辅助降低了大豆的毒性；本发明还采用了化学溶剂+物理蒸汽结合法进行进一步脱毒处理，在高温下将胰蛋白酶抑制素以及其它抗营养因子通过溶于带有化学溶剂的高温蒸汽中，部分高温分解，产生可挥发性物质而随蒸气散失，部分与有机物质发生反应，如胺可以与硫键反应，从而起到有效脱毒、改善口感的效果。
本发明采用微波辅助，钝化剂参与反应，从而钝化抗营养因子，复合微生物菌液进行发酵脱毒，进一步改善大豆口感和营养，化学溶剂+物理蒸汽脱除残余抗营养因子，方法简单，能够对大豆起到有效脱毒，且不会重新引发毒性，可以实现长效脱毒的效果。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1一种大豆脱毒的方法
具体包括以下步骤：
S1.将大豆洗净、干燥后，表面进行抛光处理；
S2.将12g蔗糖、3g丙氨酸、0.5g维生素E和0.1g硫酸锌用100mL无菌水溶解，混合均匀后，用PBS溶液调节培养基pH值至6.5，紫外线灭菌备用，得到营养液；
S3.将10g双歧杆菌、2g保加利亚乳杆菌、1g产朊假丝酵母菌、2g地衣芽孢杆菌分别接种到高氏培养基中划线，厌氧培养，厌氧培养条件为27℃，湿度为75％，培养1天，然后分别培养成菌种种子液，含菌量为108cfu/mL；
S4.将步骤S3制得的菌种种子液分别接种于步骤S2得到的营养液中，双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、产朊假丝酵母菌、地衣芽孢杆菌的接种量分别为2％(v/v)、1％(v/v)、1％(v/v)、2％(v/v)，厌氧培养，厌氧培养条件为27℃，湿度为75％，培养2天，混合并稀释100倍后，得到复合微生物菌液；
S5.将步骤S1处理后的大豆加入步骤S4中的复合微生物菌液中，所述复合微生物菌液将所述处理后的大豆完全浸泡，功率为1000W的微波处理，控制菌液的温度在27℃，发酵处理2h后，得到第一次脱毒大豆体系；
S6.将半胱氨酸和无花果蛋白酶加入步骤S5中所述第一次脱毒大豆体系中，加入量分别为体系总质量的5％和10％，保持原处理条件继续处理1h，过滤，得到第二次脱毒大豆；
S7.将2-5g丙三醇、1g柠檬酸、2g乙二胺溶于100g水中，混合均匀后，得到混合液；
S8.将步骤S7得到的混合液装入容器中，将步骤S6得到的第二次脱毒大豆放置于上层筛网，加盖并安装冷凝管，加热，蒸汽处理10min，得到第三次脱毒大豆；
S9.将第三次脱毒大豆进行微波干燥，功率为200W；
S10.将微波干燥后的大豆进行紫外灭菌，称量，包装。
实施例2一种大豆脱毒的方法
具体包括以下步骤：
S1.将大豆洗净、干燥后，表面进行抛光处理；
S2.将20g麦芽糖、3g苏氨酸、4g色氨酸、1g维生素B12和0.5g氯化钙用100mL无菌水溶解，混合均匀后，用PBS溶液调节培养基pH值至7.5，紫外线灭菌备用，得到营养液；
S3.将10g双歧杆菌、5g保加利亚乳杆菌、3g产朊假丝酵母菌、7g地衣芽孢杆菌分别接种到高氏培养基中划线，厌氧培养，厌氧培养条件为35℃，湿度为85％，培养2天，然后分别培养成菌种种子液，含菌量为109cfu/mL；
S4.将步骤S3制得的菌种种子液分别接种于步骤S2得到的营养液中，双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、产朊假丝酵母菌、地衣芽孢杆菌的接种量分别为5％(v/v)、3％(v/v)、4％(v/v)、4％(v/v)，厌氧培养，厌氧培养条件为35℃，湿度为85％，培养4天，混合并稀释1000倍后，得到复合微生物菌液；
S5.将步骤S1处理后的大豆加入步骤S4中的复合微生物菌液中，所述复合微生物菌液将所述处理后的大豆完全浸泡，功率为2000W的微波处理，控制菌液的温度在37℃，发酵处理3h后，得到第一次脱毒大豆体系；
S6.将半胱氨酸和无花果蛋白酶加入步骤S5中所述第一次脱毒大豆体系中，加入量分别为体系总质量的12％和17％，保持原处理条件继续处理2h，过滤，得到第二次脱毒大豆；
S7.将5g丙三醇、7g柠檬酸、4g乙二胺溶于100g水中，混合均匀后，得到混合液；
S8.将步骤S7得到的混合液装入容器中，将步骤S6得到的第二次脱毒大豆放置于上层筛网，加盖并安装冷凝管，加热，蒸汽处理20min，得到第三次脱毒大豆；
S9.将第三次脱毒大豆进行微波干燥，功率为400W；
S10.将微波干燥后的大豆进行紫外灭菌，称量，包装。
实施例3一种大豆脱毒的方法
具体包括以下步骤：
S1.将大豆洗净、干燥后，表面进行抛光处理；
S2.将16g糖蜜(糖蜜为甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜，质量比为1：3)、5g尿素、0.3g维生素A、0.4g维生素B1和0.3g硫酸镁用100mL无菌水溶解，混合均匀后，用PBS溶液调节培养基pH值至7，紫外线灭菌备用，得到营养液；
S3.将10g双歧杆菌、3.5g保加利亚乳杆菌、2g产朊假丝酵母菌、5g地衣芽孢杆菌分别接种到高氏培养基中划线，厌氧培养，厌氧培养条件为30℃，湿度为80％，培养1.5天，然后分别培养成菌种种子液，含菌量为108cfu/mL；
S4.将步骤S3制得的菌种种子液分别接种于步骤S2得到的营养液中，双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、产朊假丝酵母菌、地衣芽孢杆菌的接种量分别为3.5％(v/v)、2％(v/v)、2.5％(v/v)、3％(v/v)，厌氧培养，厌氧培养条件为30℃，湿度为80％，培养3天，混合并稀释500倍后，得到复合微生物菌液；
S5.将步骤S1处理后的大豆加入步骤S4中的复合微生物菌液中，所述复合微生物菌液将所述处理后的大豆完全浸泡，功率为1500W的微波处理，控制菌液的温度在32℃，发酵处理2.5h后，得到第一次脱毒大豆体系；
S6.将半胱氨酸和无花果蛋白酶加入步骤S5中所述第一次脱毒大豆体系中，加入量分别为体系总质量的8％和14％，保持原处理条件继续处理1.5h，过滤，得到第二次脱毒大豆；
S7.将3.5g丙三醇、5g柠檬酸、3g乙二胺溶于100g水中，混合均匀后，得到混合液；
S8.将步骤S7得到的混合液装入容器中，将步骤S6得到的第二次脱毒大豆放置于上层筛网，加盖并安装冷凝管，加热，蒸汽处理15min，得到第三次脱毒大豆；
S9.将第三次脱毒大豆进行微波干燥，功率为300W；
S10.将微波干燥后的大豆进行紫外灭菌，称量，包装。
对比例1
与实施例3相比，步骤S1中未进行抛光处理，其他条件均不改变。
S1.将大豆洗净、干燥。
对比例2
与实施例3相比，步骤S3中未添加地衣芽孢杆菌，其他条件均不改变。
S3.将15g双歧杆菌、3.5g保加利亚乳杆菌、2g产朊假丝酵母菌分别接种到高氏培养基中划线，厌氧培养，厌氧培养条件为30℃，湿度为80％，培养1.5天，然后分别培养成菌种种子液，含菌量为108cfu/mL。
S4.将步骤S3制得的菌种种子液分别接种于步骤S2得到的营养液中，双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、产朊假丝酵母菌的接种量分别为6.5％(v/v)、2％(v/v)、2.5％(v/v)、3％(v/v)，厌氧培养，厌氧培养条件为30℃，湿度为80％，培养3天，混合并稀释500倍后，得到复合微生物菌液；
对比例3
与实施例3相比，步骤S3中未添加双歧杆菌，其他条件均不改变。
S3.将3.5g保加利亚乳杆菌、2g产朊假丝酵母菌、5g地衣芽孢杆菌分别接种到高氏培养基中划线，厌氧培养，厌氧培养条件为30℃，湿度为80％，培养1.5天，然后分别培养成菌种种子液，含菌量为108cfu/mL。
S4.将步骤S3制得的菌种种子液分别接种于步骤S2得到的营养液中，保加利亚乳杆菌、产朊假丝酵母菌、地衣芽孢杆菌的接种量分别为2％(v/v)、2.5％(v/v)、6.5％(v/v)，厌氧培养，厌氧培养条件为30℃，湿度为80％，培养3天，混合并稀释500倍后，得到复合微生物菌液；
对比例4
与实施例3相比，步骤S5中未进行微波处理，其他条件均不改变。
S5.将步骤S1处理后的大豆加入步骤S4中的复合微生物菌液中，所述复合微生物菌液将所述处理后的大豆完全浸泡，控制菌液的温度在32℃，发酵处理2.5h后，得到第一次脱毒大豆体系。
对比例5
与实施例3相比，步骤S6中未添加半胱氨酸，其他条件均不改变。
S6.将无花果蛋白酶加入步骤S5中所述第一次脱毒大豆体系中，加入量分别为体系总质量的22％，保持原处理条件继续处理1.5h，过滤，得到第二次脱毒大豆。
对比例6
与实施例3相比，步骤S6中未添加无花果蛋白酶，其他条件均不改变。
S6.将半胱氨酸加入步骤S5中所述第一次脱毒大豆体系中，加入量分别为体系总质量的22％，保持原处理条件继续处理1.5h，过滤，得到第二次脱毒大豆。
对比例7
与实施例3相比，步骤S7中未添加乙二胺，其他条件均不改变。
S7.将6.5g丙三醇、5g柠檬酸溶于100g水中，混合均匀后，得到混合液。
对比例8
与实施例3相比，步骤S7中未添加丙三醇，其他条件均不改变。
S7.将5g柠檬酸、6.5g乙二胺溶于100g水中，混合均匀后，得到混合液。
对比例9
与实施例3相比，步骤S9中未进行微波干燥，采用普通烘箱烘干，其他条件均不改变。
S9.将第三次脱毒大豆在45℃下进行烘干。
测试例1抗营养物质的检测
检验对象：实施例1-3以及对比例1-9制得的脱毒大豆以及市售普通大豆。
检验项目：次黄嘌呤核苷酸、鸟嘌呤核苷酸、腺嘌呤核苷酸、胰蛋白酶抑制剂活性。
检测方法：
胰蛋白酶抑制剂活性：GB/T21498-2008；
次黄嘌呤核苷酸、鸟嘌呤核苷酸、腺嘌呤核苷酸:HPLC(《功能性食品活性成分测定》化学工业出版社，2005年第一版第九章第二十三节)。
检验结果：见表1。
表1
由上表可知，本发明实施例制得的脱毒大豆能显著降低大豆中的抗营养因子，其嘌呤含量下降至3.82-4.45mg/100g，其胰蛋白酶抑制剂含量下降至<0.2mg/g，与普通大豆相比，大部分抗营养因子已经脱除，达到合格脱毒大豆标准。
测试例2豆腥味成分检测
检验对象：实施例1-3以及对比例1-9制得的脱毒大豆以及市售普通大豆。
检验项目：豆腥味成分。
检测方法：
采用HS-SPME-GC-MS测定豆腥味成分。将大豆试样粉碎，过40目筛，得到大豆粉。将2g大豆粉和3mL去离子水置于顶空瓶中，加入10μL质量浓度为0.12mg/mL的对二氯苯－甲醇溶液(内标物)，混匀，50℃水浴30min，萃取头吸附40min，250℃解吸5min。GC条件：SH－Rxi－5SiLMS色谱柱；升温程序为50℃保持1min，以10℃/min升至150℃，保持3min，以8℃/min升至290℃，保持2min；进样口温度250℃；氦气为载气，流速1.0mL/min；采用不分流的进样方式。MS条件：采用电子轰击离子源；电离方式EI；电离电压70eV；电子源温度200℃；灯丝电流150μA；扫描质量范围(m/z)45～500；扫描方式为Scan。实验结果与NIST14/NIST14s数据库比对，将其中相似程度大于80％的化合物认定为大豆试样的豆腥味成分，并测试其含量。
检验结果：见表2。
表2大豆豆腥味成分及含量(单位μg/kg)
注释：表中“/”表示未检测出其含量。
豆腥味是大豆加工过程中产生的特殊气味，由不饱和脂肪酸氧化降解产生的醇、醛、酮等物质组成，其中己醛含量决定了大豆制品的豆腥味程度。由表2可知，本发明实施例中制得的脱毒大豆豆腥味成分显著下降，部分成分未检出，因此，采用本发明方法处理大豆，可明显改善大豆豆腥味。
测试例3脂氧合酶活性测定
检验对象：实施例1-3以及对比例1-9制得的脱毒大豆以及市售普通大豆。
检验项目：脂氧合酶活性。
检测方法：
粗酶液制备：将20g大豆与200mL去离子水置于冰水浴中磨浆，100目双层滤布过滤，4℃、8000r/min离心30min，上清液即为粗酶液。
底物溶液配制：将0.1mL亚油酸和0.1mL吐温20加入0.2mol/L硼酸缓冲溶液(pH9.0)中，定容至100mL。
脂氧合酶活性测定：用0.2mol/L硼酸缓冲溶液(pH9.0)稀释底物溶液5倍。将2.0mL底物稀释液、0.9mL0.2mol/L的硼酸缓冲溶液(pH9.0)与0.1mL稀释适当倍数的粗酶液混匀，间隔10s测其234nm的吸光度(A234)。将1min内A234增加0.001定义为一个酶活力单位(U)。按下式计算脂氧合酶相对活力。
相对活力＝处理后的大豆脂氧合酶活力/未处理的大豆脂氧合酶活力×100％
检测结果：见表3。
表3
组别
大豆脂氧合酶相对活力(％)
市售普通大豆
100
实施例1
1.9
实施例2
1.7
实施例3
1.4
对比例1
4.5
对比例2
32.5
对比例3
30.3
对比例4
2.7
对比例5
2.2
对比例6
2.4
对比例7
24.8
对比例8
26.4
对比例9
3.1
由表3可知，本发明实施例制得的脱毒大豆中大豆脂氧合酶相对活力显著下降，下降了98.1-98.6％，可能是采用蒸汽处理后的大豆改变了酶活性中心的构象或相关基团的解离状态，从而有效降低了酶活力。
测试例4蛋白质溶解度测定
检验对象：实施例1-3以及对比例1-9制得的脱毒大豆以及市售普通大豆。
检验项目：蛋白质溶解度。
检测方法：参照SN/T3926—2014的考马斯亮蓝法测定大豆试样中可溶性蛋白质含量。参照GB5009.5—2016中凯氏定氮法测定大豆试样中总蛋白质含量(蛋白质折算系数为5.71)。按下式计算大豆试样的蛋白质溶解度。
蛋白质溶解度＝大豆中可溶性蛋白质含量/大豆中总蛋白质含量×100％
检测结果：见表4。
表4
组别
蛋白质溶解度(％)
市售普通大豆
32.7
实施例1
46.5
实施例2
47.2
实施例3
48.4
对比例1
42.3
对比例2
37.2
对比例3
38.4
对比例4
44.7
对比例5
45.2
对比例6
44.9
对比例7
42.4
对比例8
41.7
对比例9
43.9
由表4可知，本发明实施例制得的脱毒大豆中蛋白质的溶解度略有上升，可溶性蛋白增加，可能是由于经过微生物发酵处理后，将部分不可溶蛋白进行分解成了小分子可溶蛋白，从而，增加了大豆的营养性。
对比例1中大豆未进行抛光处理，大豆表面的保护膜没有去除，因此，大豆脱毒的效果略有下降。对比例2和对比例3中未添加地衣芽孢杆菌或双歧杆菌，其对大豆中抗营养因子的去除显著下降，且胰蛋白酶抑制剂大部分残留,大豆豆腥味成分含量升高，同时，蛋白质溶解度下降，这是因为，本发明采用混合微生物制剂对整粒大豆进行脱毒，由于微生物的酶系繁杂,能够高效分解复杂多变二硫键以及其中间产物，最后能将大豆中胰蛋白酶抑制素彻底分解，同时，大大地改善菜大豆的口感,提高大豆中营养成分的利用率，最后，微生物利用自身代谢作用,可以产生香味物质或香味的前体物质从而提高大豆脱毒后的香味，经过微生物发酵处理后，将部分不可溶蛋白进行分解成了小分子可溶蛋白，从而，增加了大豆的营养性，且地衣芽孢杆菌和双歧杆菌的添加还具有协同增效的作用。对比例4中没有进行微波处理，其脱毒效果整体稍有下降，可见微波处理，能够有效促进大豆抗营养因子，如嘌呤、胰蛋白酶抑制素的分解。对比例5和对比例6中未添加半胱氨酸或无花果蛋白酶，其胰蛋白酶抑制素的含量显著升高，添加钝化剂半胱氨酸和无花果蛋白酶，无花果蛋白酶是一种巯基蛋白酶，两者协同可以有效钝化胰蛋白酶抑制素，其硫醇与二硫化物的交换反应引起二硫键裂解，从而有效使得胰蛋白酶抑制素分解脱除，且两者具有协同增效的作用。对比例7和对比例8中分别未添加乙二胺或丙三醇，其大豆脂氧合酶活力、大豆豆腥味成分含量以及胰蛋白酶抑制剂升高，可能是因为在高温下将胰蛋白酶抑制素以及其它抗营养因子通过溶于带有化学溶剂的高温蒸汽中，部分高温分解，产生可挥发性物质而随蒸气散失，部分与有机物质发生反应，如乙二胺可以与硫键反应，丙三醇可以溶解豆腥味物质如1-辛烯-3-醇、正己醇、正戊醇，从而起到有效脱毒、改善口感的效果，另外，采用有机溶剂蒸汽处理后的大豆改变了酶活性中心的构象或相关基团的解离状态，从而也有效降低了大豆脂氧合酶活力。对比例9中未采用微波干燥，采用普通烘箱烘干，微波处理的作用在于再次对大豆中残余的少部分抗营养因子分解去除。
与现有技术相比，大豆中的胰蛋白酶抑制素主要分为2类，分别为库尼兹(Kunitz)胰蛋白酶抑制素(KTI)和鲍曼-贝尔克(Bowman-Birk)抑制素(BBI)，其中，BBI是由7个二硫键交联而成的分子，7个二硫键赋予该分子结构上的稳定性，因此，BBI对于热、酸、碱等是极其稳定的，本发明采用混合微生物制剂对整粒大豆进行脱毒，由于微生物的酶系繁杂,能够高效分解复杂多变二硫键以及其中间产物，最后能将大豆中胰蛋白酶抑制素彻底分解，另外，还可以将其它抗营养因子分解,如植酸、单宁、纤维素等，大大地改善菜大豆的口感,提高大豆中营养成分的利用率，最后，微生物利用自身代谢作用,可以产生香味物质或香味的前体物质从而提高大豆脱毒后的香味。
本发明通过添加钝化剂半胱氨酸和无花果蛋白酶，无花果蛋白酶是一种巯基蛋白酶，两者协同可以有效钝化胰蛋白酶抑制素，其硫醇与二硫化物的交换反应引起二硫键裂解，从而有效使得胰蛋白酶抑制素分解脱除；本发明在微波处理条件下，可以钝化大豆中的抗营养因子如嘌呤、胰蛋白酶抑制素等，从而辅助降低了大豆的毒性；本发明还采用了化学溶剂+物理蒸汽结合法进行进一步脱毒处理，在高温下将胰蛋白酶抑制素以及其它抗营养因子通过溶于带有化学溶剂的高温蒸汽中，部分高温分解，产生可挥发性物质而随蒸气散失，部分与有机物质发生反应，如胺可以与硫键反应，从而起到有效脱毒、改善口感的效果。
本发明采用微波辅助，钝化剂参与反应，从而钝化抗营养因子，复合微生物菌液进行发酵脱毒，进一步改善大豆口感和营养，化学溶剂+物理蒸汽脱除残余抗营养因子，方法简单，能够对大豆起到有效脱毒，且不会重新引发毒性，可以实现长效脱毒的效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：柱状腐竹成型装置