一种多肽化合物的制备方法
阅读说明：本技术 一种多肽化合物的制备方法 (Preparation method of polypeptide compound ) 是由 付晓平 周海波 黄波 袁瑜 胡西 姜士礼 孟广鹏 于 2021-08-23 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种多肽化合物的制备方法,包括以下步骤：将M-1所示化合物和M-2所示化合物进行缩合反应,然后脱除保护基得到化合物I-1。本发明通过引入er值大于97/3的手性化合物M-2-2,再结合其他一些关键点的工艺优化,目标化合物I-1的合成收率大大提高,粗品收率高达80％以上,纯化拆分的难度、周期以及成本都大大降低,成功实现了1.5公斤级原料药粗品的放大纯化。(The invention provides a preparation method of a polypeptide compound, which comprises the following steps: carrying out condensation reaction on the compound shown by M-1 and the compound shown by M-2, and then removing a protecting group to obtain the compound I-1. According to the invention, by introducing the chiral compound M-2-2 with the er value of more than 97/3 and combining with process optimization of other key points, the synthesis yield of the target compound I-1 is greatly improved, the yield of crude products reaches more than 80%, the difficulty, the period and the cost of purification and resolution are greatly reduced, and the amplification and purification of crude products of crude drugs of 1.5 kg grade are successfully realized.)
技术领域
本发明涉及制药
技术领域
，尤其涉及一种多肽化合物的制备方法。背景技术
阿片样物质受体是一类主要的G蛋白偶联受体，是内源性阿片肽以及阿片类药物结合靶点。阿片受体激活后对神经系统免疫以及内分泌系统具有调节作用，是目前最强且常用的中枢镇痛药。内源性阿片肽是哺乳动物体内天然生成的阿片样活性物质，目前已知的内源性阿片肽大致分为脑啡肽、内啡肽、强啡肽和新啡肽几类。中枢神经系统中存在其相应的阿片受体，即μ、δ和κ受体。μ受体镇痛活性最强，成瘾性也最强，是产生副作用的主要原因。δ受体成瘾性小，镇痛作用也不明显。κ受体(KOR)镇痛活性介于前两者之间。多肽类KOR激动剂能在不进入中枢的情况下在外周发挥镇痛作用，不会导致呼吸抑制和便秘等毒副作用，且成瘾性更低，因此具有药物成瘾治疗的潜力。
专利CN111233974B报道了一系列具有优异激动活性的新型KOR激动剂，包括结构如式I-1所示的化合物。上述专利采用固相液相结合的方式合成该多肽化合物的主链，能大大提高合成效率；然而，该专利采用了消旋的吡咯-3-硼酸频哪醇酯作为液相缩合的关键物料(对映纯的物料无法获得)，使得最终合成得到的目标化合物与其异构体的比例为1：1(二者极性差异特别小)，不仅合成收率大打折扣，而且给克级以上批次的分离纯化带来了极大的挑战，需要多次不断地回收再制备，纯化周期长、溶剂消耗大、废液量极大，不利于大规模生产。
因此，急需开发一种基于手性合成的新方法，以期大大提高目标异构体的比例，降低目标化合物的纯化难度、提高目标产物总收率，从而解决现有技术中纯化周期长、成本高、工艺难以放大的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种多肽化合物的制备方法，能够制备得到高纯度的式Ⅰ-1所示化合物。
为达到上述目的，本发明提供了一种多肽化合物的制备方法，包括以下步骤：
将M-1所示化合物和M-2所示化合物进行缩合反应，然后脱除保护基得到化合物I-1；
本发明优选的，上述制备方法具体包括以下步骤：
1)将M-1与M-2进行液相缩合反应，得到中间体M-3；
2)中间体M-3在酸性条件下脱除全部保护基，粗品经HPLC纯化得到化合物I-1；
本发明优选的，所述液相缩合反应的缩合试剂选自以下组合中的一种或多种：
a)HBTU、HOBt和DIEA；
b)HBTU、Cl-HOBt和DIEA；
c)DIC和HOBt；
d)DIC和Cl-HOBt；
e)PyBOP、HOBt和DIEA；
f)PyBOP、Cl-HOBt和DIEA；
g)DIC、HOSu和DIEA。
更优选为g)DIC、HOSu和DIEA。
本发明优选的，上述步骤2)中脱除全部保护基的脱保护试剂为三氟醋酸。所述三氟醋酸优选为体积浓度为20％～80％的二氯甲烷溶液。
本发明优选的，所述M-1所示化合物按照以下方法制备：
利用多肽固相合成法，以保护的D-Lys、D-Phe和D-Leu为原料，按照四肽D-Phe-D-Phe-D-Leu-D-Lys从C端到N段的顺序偶联到固相载体上，脱除固相载体后，得到四肽中间体M-1。
本发明优选的，所述保护的D-Lys为Fmoc-D-Lys(Boc)-OH。
本发明优选的，所述保护的D-Phe为Fmoc-D-Phe-OH或Boc-D-Phe-OH。
本发明优选的，所述保护的D-Leu为Fmoc-D-Leu-OH。
优选的，所述M-1所示化合物的制备包括以下步骤：
1)将化合物S-1固定到固相载体上得到R-1，然后脱除Fmoc保护基得到固相载体固定的化合物R-1-a；
2)将保护氨基酸S-2、S-3、S-4依次通过以下反应序列偶联到R-1-a上，得到固相载体固定的化合物R-4，最后裂解固相载体得到中间体M-1；
本发明优选的，所述偶联采用的缩合试剂选自以下组合中的一种或多种：
a)HBTU、HOBt和DIEA；
b)HBTU、Cl-HOBt和DIEA；
c)DIC和HOBt；
d)DIC和Cl-HOBt；
e)PyBOP、HOBt和DIEA；
f)PyBOP、Cl-HOBt和DIEA。
本发明优选的，所述固相载体为2-氯三苯基甲基氯树脂或Wang树脂。所述2-氯三苯基甲基氯树脂的替代度优选为0.1-1.6mmol/g；所述Wang树脂的替代度优选为0.1-1.6mmol/g。优选采用2-氯三苯基甲基氯树脂。
所述脱除Fmoc保护基的脱保护试剂优选为哌啶或哌嗪。所述哌啶或哌嗪优选为体积浓度为10％～50％的DMF溶液。
本发明优选的，所述脱除固相载体采用的裂解试剂为三氟乙醇。所述三氟乙醇优选为体积浓度为10％～95％的二氯甲烷溶液或水溶液。
本发明优选的，所述M-2所示化合物按照以下方法制备：
1)化合物S-5与手性硼试剂S-6进行不对称硼氢化反应得到中间体M-2-1，随后进行酯化反应得到M-2-2；
2)中间体M-2-2在酸性条件下脱除Boc保护基，得到中间体M-2；
本发明对于关键的含硼中间体M-2-2的合成采用了手性硼试剂S-6。通过不对称硼氢化衍生化的手段，所得的M-2-2的光学纯度高，er值大于97/3，可实现公斤级放大；纯化方法简便，4步反应只需最终一次简易的快速柱层析，总收率高达60％以上。
本发明优选的，所述不对称硼氢化反应的温度为-40℃～-20℃。
本发明优选的，所述酯化反应的溶剂选自乙酸乙酯、乙酸异丙酯或乙酸叔丁酯。
本发明优选的，所述脱除Boc保护基的脱保护试剂选自三氟醋酸或盐酸；更优选为三氟醋酸。所述三氟醋酸优选为体积浓度为20％～80％的二氯甲烷溶液；所述盐酸优选为盐酸的水溶液、二氧六环溶液或者乙酸乙酯溶液。
与现有技术相比，本发明提供了一种化合物的制备方法，包括以下步骤：
将M-1所示化合物和M-2所示化合物混合，进行缩合反应，然后脱除保护基得到化合物I-1。本发明通过引入er值大于97/3的手性化合物M-2-2，使得目标化合物I-1的合成收率大大提高，粗品收率高达80％以上，纯化拆分的难度、周期以及成本都大大降低，成功实现了1.5公斤级原料药粗品的放大纯化。
更进一步的，本发明通过结合其他一些关键点的工艺条件优化，如缩合剂、裂解液的类型和当量，以及反应温度、时间等，进一步提高了目标化合物I-1的的收率、纯度。
具体实施方式
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的化合物的制备方法进行详细描述。
实施例中所使用的主要实验设备信息如下表1所示：
表1
序号
设备名称
设备规格
厂家
1
多肽合成仪
20L
海南建邦
2
多肽沉降釜
40L
海南建邦
3
多肽裂解仪
10L
海南建邦
4
大容量冷冻离心机
2L
/
5
CS-Prep工业制备色谱系统
DAC200
江苏汉邦
6
真空冷冻干燥机
Pilot2-4M
博医康
本发明所使用的物料缩写含义如下表2所示：
表2
实施例1中间体M-1的制备
步骤(1)中间体树脂Fmoc-D-Lys(Boc)-2-CTC Resin(R-1)的制备
向20L多肽合成仪中加入2-氯三苯基甲基氯树脂(1219.3g)，再加入DCM(12.2L)，溶胀10min。称取Fmoc-D-Lys(Boc)-OH(1238.7g，2647mmol)加入DCM(6L)充分溶解，再加入DIEA(650mL，3960mmol)。将上述反应液加入20L树脂中，充分搅拌均匀，25℃反应2h。加入MeOH(260mL，10273mmol)和DIEA(650mL，3960mmol)，反应0.5h封端，排干溶液，用6×6L DMF洗涤树脂，完成反应，得到目标树脂R-1。取部分树脂用哌啶/DMF溶液(V/V＝1/3)进行脱保护，并利用紫外分光光度法测定Fmoc含量，计算树脂R-1的替代度为1.08mmol/g。
步骤(2)中间体树脂H-D-Lys(Boc)-2-CTC Resin(R-1-a)的制备
使用哌啶/DMF溶液(V/V＝1/3)处理步骤(1)所得树脂10min，排干溶液；再加入4L哌啶/DMF(V/V＝1/3L)继续处理10min。排干溶液，用6×6L DMF洗涤树脂，Kaiser Test检测呈紫色，完全脱保护，抽掉溶液，得到目标树脂R-1-a。
步骤(3)中间体树脂Fmoc-D-Leu-D-Lys(Boc)-2-CTC Resin(R-2)的制备
将S-2(932.4g，2641mmol)、HOBT(357.7g，2650mmol)和HBTU(1009.8g，2664mmol)溶解于DMF(4L)，保温0-5℃，然后加入DIEA(650mL，3960mmol)，搅拌活化15min。将该反应液加入步骤(2)所得树脂中，25℃反应1.5h，排干溶液，用6×6L DMF洗涤树脂，Kaiser Test检测呈黄色，反应完全，得到目标树脂R-2。
步骤(4)中间体树脂H-D-Leu-D-Lys(Boc)-2-CTC Resin(R-2-a)的制备
使用哌啶/DMF溶液(V/V＝1/3)处理步骤(3)所得树脂10min，排干溶液；再加入4L哌啶/DMF(V/V＝1/3L)继续处理10min。排干溶液，用6×6L DMF洗涤树脂，Kaiser Test检测呈紫色，完全脱保护，抽掉溶液，得到目标树脂R-2-a。
步骤(5)中间体树脂Fmoc-D-Phe-D-Leu-D-Lys(Boc)-2-CTC Resin(R-3)的制备
将S-3(1024.3g，2647mmol)、HOBT(358.4g，2655mmol)和HBTU(1002.4g，2645mmol)溶解于DMF(4L)，保温0-5℃，然后加入DIEA(650mL，3960mmol)，搅拌活化15min。将该反应液加入步骤(4)所得树脂中，25℃反应1.5h，排干溶液，用6×6L DMF洗涤树脂，Kaiser Test检测呈黄色，反应完全，得到目标树脂R-3。
步骤(6)中间体树脂H-D-Phe-D-Leu-D-Lys(Boc)-2-CTC Resin(R-3-a)的制备
使用哌啶/DMF溶液(V/V＝1/3)处理步骤(3)所得树脂10min，排干溶液；再加入4L哌啶/DMF(V/V＝1/3L)继续处理10min。排干溶液，用6×6L DMF洗涤树脂，Kaiser Test检测呈紫色，完全脱保护，抽掉溶液，得到目标树脂R-3-a。
步骤(7)中间体树脂Boc-D-Phe-D-Phe-D-Leu-D-Lys(Boc)-2-CTC Resin(R-4)的制备
将S-4(700.1g，2642mmol)、HOBT(360.3g，360.3g mmol)和DIC(410mL，2640mmol)溶解于DMF(4L)，保温0-5℃，搅拌活化15min。将该反应液加入步骤(6)所得树脂中，25℃反应1.5h，排干溶液，用6×6L DMF洗涤树脂，Kaiser Test检测呈黄色，反应完全。用6×6LMeOH洗涤树脂，然后于33℃真空干燥至恒重，得到2270.3g目标树脂R-4，收率为95％。
步骤(8)中间体Boc-D-Phe-D-Phe-D-Leu-D-Lys(Boc)-OH(M-1)的制备
向20L反应釜中加入2260.2g树脂R-4，加入15L裂解液(体积浓度为25％的三氟乙醇的二氯甲烷溶液)，室温搅拌反应2h。转移至10L多肽裂解仪中抽滤，滤液浓缩，滤饼用3×3L二氯甲烷洗涤。滤液浓缩干，得到的白色固体于34℃真空干燥至恒重，最终获得1015.9g中间体M-1，类白色固体，收率为93.7％。
ESI-MS(m/z):754.5(M+H)+。
HPLC purity:97.23％(220nm)。
实施例2中间体M-2的制备
步骤(1)现场制备手性硼试剂(-)-Ipc2BH
将(+)-α-蒎烯(705mL)缓慢滴加到硼烷二甲硫醚络合物的四氢呋喃溶液(2.0mol/L，1.1L)中，温度保持在-5～5℃，加完继续保温反应5h。在-5～5℃下减压除去溶剂和游离二甲硫醚，随后补加无水四氢呋喃(450mL)和(+)-α-蒎烯(70mL)，继续保温反应3天，得到的手性硼试剂(-)-Ipc2BH溶液直接用于下一步硼氢化反应。
步骤(2)中间体M-2-1的制备
将步骤(1)中的反应液降温至-25～-20℃后，加入N-叔丁氧羰基-吡咯啉(250.2g)的四氢呋喃(450mL)溶液，加完保温反应2天。缓慢滴加甲醇(500ml)淬灭反应，保温-10～0℃继续反应2h。减压浓缩得到的无色油状物用4L甲醇和4L碳酸钾溶液(0.25g/mL)溶解，再用3×3L石油醚萃取，分液。石油醚相再用4L甲醇和4L碳酸钾溶液(0.25g/mL)洗涤、分液。合并的水相用3×3L石油醚反萃进一步除杂，然后用稀盐酸酸化至pH 1～2。加入氯化钠至饱和后，用3×3L乙酸乙酯萃取，合并的有机相经饱和食盐水洗涤和无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩后得527.8g中间体M-2-1，黄色油状物，直接用于下一步酯化反应。
步骤(3)中间体M-2-2的制备
将步骤(2)中的黄色油状物溶于1L醋酸异丙酯，加入230g频哪醇，室温反应2h。反应液浓缩后通过快速硅胶柱层析纯化，得到450g中间体M-2-2，无色油状物。三步总收率为51％(按N-Boc-吡咯啉计)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.54-3.49(m,2H),3.24-3.18(m,2H),2.04-1.95(m,1H),1.81-1.70(m,1H),1.62-1.50(m,1H),1.48(s,9H),1.22(s,12H).
LCMS：m/z＝298.1；er＝97.2/2.8。
HPLC purity：97.82％(220nm)。
步骤(4)中间体M-2的制备
将M2-2(438.6g，1477mmol)溶于入二氯甲烷(2.2L)中，缓慢加入1.1L TFA，搅拌反应1h。反应液浓缩干，加入DCM(1.5L)稀释，冰浴下缓慢加入DIEA调节至pH 8，得到中间体M-2的溶液，直接用于下一步液相缩合反应。
实施例3中间体M-3的制备
将M-1(929.3g，1232mmol)、HOSu(184.2g，1602mmol)加入50L反应釜中，加入13L二氯甲烷溶解。降至10℃，加入DIC(247mL)的二氯甲烷溶液(500mL)，保温5～10℃反应2h，得到M-1的活化酯。然后依次加入DIEA(609mL，3692mmol)和实施例2中的M-2溶液，升温至20～25℃反应1h。加入5L 1mol/L的盐酸溶液，搅拌并分液，水相用二氯甲烷(600mL)洗涤，合并的有机相依次用3×10L水和10L饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥，过滤浓缩后得到1478.7g中间体M-3，深棕色液固混合物。
实施例4目标化合物I-1([(S)-1-(D-苯丙氨酰-D-苯丙氨酰-D-亮氨酰-D-赖氨酰)吡咯烷-3-基]硼酸盐酸盐)的制备
将M-3(1477.9g，1232mmol)溶于4.5L二氯甲烷，缓慢加入1.1L三氟醋酸，常温反应1.5h。反应液浓缩得到油状物，用三氟醋酸稀释后缓慢加入到装有40L甲基叔丁基醚的50L沉淀罐中。将析出的胶质状固体冷冻离心，所得固体用3×15L甲基叔丁基洗涤、浓缩，35℃真空干燥至恒重，得到1140.6gI-1的粗品，白色固体，粗收率为80.5％。将粗品用HPLC液相制备纯化和转盐，获得397g纯度大于99％、dr为99.81/0.19的目标化合物I-1的成品，总收率为48％。
LCMS：m/z＝651.4(M+H)+；
HPLC purity：99.50％(220nm)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.08–9.04(m,1H),8.51–8.49(m,1H),8.31–8.01(m,7H),7.77(s,2H),7.44–7.36(m,2H),7.34–7.17(m,8H),4.66–4.55(m,1H),4.50–4.41(m,1H),4.38–4.32(m,1H),4.05–4.01(m,1H),3.63–3.59(m,1H),3.55–3.51(m,1H),3.34–3.27(m,1H),3.26–3.16(m,1H),3.15–3.01(m,2H),3.00–2.94(m,1H),2.88–2.82(m,1H),2.80–2.66(m,2H),2.06–1.86(m,1H),1.80–1.42(m,9H),1.41–1.24(m,2H),0.92–0.87(m,6H).
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
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