多肽at03在治疗原发性胆汁性胆管炎药物中的应用
阅读说明：本技术 多肽at03在治疗原发性胆汁性胆管炎药物中的应用 (Application of polypeptide AT03 in medicine for treating primary biliary cholangitis ) 是由 张斌智 叶淑银 于 2021-01-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种多肽AT03在治疗原发性胆汁性胆管炎药物中的应用,该多肽AT03的氨基酸序列为：Val-His-Val-Val-R-1；其中,R-1＝-NH-2。本发明经过大量的实验研究证明该多肽AT03对胆总管结扎大鼠胆汁淤积性肝硬化模型具有治疗效果,具体表现在能够改善肝脏胆汁淤积、肝内胆道梗阻和肝细胞损伤以及肝脏组织纤维化进程,能够应用于制备治疗原发性胆汁性胆管炎的药物。(The invention discloses an application of a polypeptide AT03 in a medicine for treating primary biliary cholangitis, wherein the amino acid sequence of the polypeptide AT03 is as follows: Val-His-Val-Val-R 1 (ii) a Wherein R is 1 ＝‑NH 2 . A large number of experimental studies prove that the polypeptide AT03 has a treatment effect on cholestatic cirrhosis models of common bile duct ligation rats, specifically can improve hepatic cholestasis, hepatic biliary obstruction and hepatic cell injury and liver tissue fibrosis progress, and can be applied to preparation of medicaments for treating primary biliary cholangitis.)
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，具体而言，本发明涉及一种多肽AT03的新用途，即该多肽AT03在治疗原发性胆汁性胆管炎药物中的应用。
背景技术
原发性胆汁性胆管炎(primary biliary cholangitis，PBC)，是一种比较罕见的进行性胆汁淤积性肝脏疾病，其特征是肝内胆汁淤积，胆管细胞受到破坏，导致肝纤维化及肝硬化一系列并发症，死亡率是普通人的三倍(Prince M,Chetwynd A,Newman W,etal.Survival and symptom progression in a geographically based cohort ofpatients with primary biliary cirrhosis:follow-up for up to 28years[J].Gastroenterology,2002,123(4):1044-51.)。一开始该病被命名为原发性胆汁性肝硬化(Primary biliary cirrhosis,PBC)，后来为了更准确地描述病状，于2015年正式更名为原发性胆汁性胆管炎(夏玉敬,周莹群,郭传勇.PBC命名共识解读：从原发性胆汁性肝硬化到原发性胆汁性胆管炎[J].世界临床药物,2015,(12):793-796.)。PBC的早期症状主要是疲劳、瘙痒，也有些研究发现患者在诊断时无症状。随着病情的加重，PBC甚至会发展到肝硬化、肝癌(佘春晖,王静,刘斌.原发性胆汁性胆管炎治疗新进展[J].中华风湿病学杂志,2019,23(1):60-63.)。
PBC(Primary biliary cholangitis)多发生在年龄阶段为40-60岁的女性身上。流行病学调查资料显示，PBC在加拿大的患病率为22.4/10万、日本为2.7/10万、澳大利亚为1.9/10万、英国则为20～25/10万(Griffiths,L.,J.K.Dyson,and D.E.Jones,The newepidemiology of primary biliary cirrhosis.Semin Liver Dis,2014.34(3):p.318-28.)，美国的患病率为40.2/10万(Kim,W.R.,et al.,Epidemiology and natural historyof primary biliary cirrhosis in a US community.Gastroenterology,2000.119(6):p.1631-6.)，在中国PBC的患病率则高达49.2/10万，其中40岁以上女性的患病率为155.8/10万(Liu,H.,et al.,Prevalence of primary biliary cirrhosis in adultsreferring hospital for annual health check-up in Southern China.BMCGastroenterol,2010.10:p.100.)。
熊去氧胆酸(ursodeoxycholic acid，UDCA)于1982年通过美国FDA批准上市，是最早获批治疗胆管炎的药物。但有40％的PBC患者对UDCA治疗没有足够的反应，起不到治疗的效果(Pares A,Caballeria L,Rodes J.Excellent long-term survival in patientswith primary biliary cirrhosis and biochemical response to ursodeoxycholicAcid[J].Gastroenterology,2006,130(3):715-20.)。2016年，奥贝胆酸(obeticholicacid，OCA)经美国FDA批准上市，终结了在PBC治疗上面UDCA长达19年孤儿药的历史。OCA作为一种通过激动法尼醇X受体调节胆汁酸代谢的药物，主要用于对UDCA应答不佳的PBC患者。无论是单用OCA还是OCA和UDCA联用都能显著降低治疗组总胆红素(TBIL)、碱性磷酸酶(ALP)等生化指标的值(]Nevens F,Andreone P,Mazzella G,et al.A Placebo-Controlled Trial of Obeticholic Acid in Primary Biliary Cholangitis[J].NewEngland Journal of Medicine,2016,375(7):631-643.)。但值得注意的是，使用OCA治疗有更高的可能出现瘙痒这一不良反应，剂量越高、发生率也越高，有的试验中一些PBC患者甚至因为出现瘙痒而停止治疗(Kowdley K V,Luketic V,Chapman R,et al.A randomizedtrial of obeticholic acid monotherapy in patients with primary biliarycholangitis[J].Hepatology,2018,67(5):1890-1902.)。
目前，对PBC的治疗仍不尽人意，因此寻找更好的治疗药物迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多肽AT03的新用途，即该多肽在治疗原发性胆汁性胆管炎中的应用。本发明经过大量的实验研究证明该多肽AT03对胆总管结扎(BDL)大鼠胆汁淤积性肝硬化模型具有治疗效果，具体表现在能够改善肝脏胆汁淤积(检测指标包括血清总胆红素T-BIL，直接胆红素D-BIL和间接胆红素I-BIL)、肝内胆道梗阻(检测指标为血清碱性磷酸酯酶ALP)和肝细胞损伤(检测指标为谷丙转氨酶ALT及谷草转氨酶AST)以及肝脏组织纤维化进程(H&E染色病理切片)，能够应用于制备治疗原发性胆汁性胆管炎的药物。
为达上述目的，本发明提供一种多肽AT03在制备用于预防或治疗原发性胆汁性胆管炎的药物中的应用，所述多肽AT03的氨基酸序列为：Val－His－Val－Val－R1；
其中，R1＝－NH2。
本发明的另一方面是提供一种组合物，该组合物包含上述多肽AT03。
本发明的组合物为药物组合物，以本发明的多肽AT03作为活性成分添加药学上可接受载体和/或辅料制成药物组合物。
通过细胞和动物实验显示，本发明的多肽AT03没有不良反应发生，可用于预防或治疗原发性胆汁性胆管炎。
本领域技术人员可以理解，本发明的药物组合物适用于各种给药方式，例如口服给药、经皮给药、静脉给药、肌肉内给药、局部给药、经鼻给药等。根据所采用的给药方式，可将本发明的多肽AT03的药物组合物制成各种合适的剂型，其中包含至少一种有效剂量的本发明的多肽AT03和至少一种药学上可接受的药用载体。适当剂型的实例为片剂、胶囊、糖衣片剂、粒剂、口服溶液和糖浆，用于皮肤表面的油膏和药贴，气雾剂、鼻喷剂，以及可用于注射的无菌溶液。
含有本发明多肽AT03的药物组合物可以制成溶液或者冻干粉末以用于胃肠外给药，在使用前可加入适当溶剂或其他可药用的载体将粉末重新配置，液体配方一般是缓冲液、等渗溶液和水溶液。
本发明的药物组合物的用量可以在一个较大范围内变动，本领域技术人员可以根据一些客观的因素，如根据疾病的种类、病情严重程度、病人体重、剂型以及给药途径等因素很容易的加以确定。
本发明的优点：
1)具有良好的生物学活性；
2)具有良好的治疗原发性胆汁性胆管炎的药效作用；
3)合成产率高，稳定性好，易于放大生产，且成本低。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为在BDL大鼠胆汁淤积性肝硬化模型中，给予多肽AT03后血清总胆红素T-BIL统计图。
图2为在BDL大鼠胆汁淤积性肝硬化模型中，给予多肽AT03后血清直接胆红素D-BIL统计图。
图3为在BDL大鼠胆汁淤积性肝硬化模型中，给予多肽AT03后血清间接胆红素I-BIL统计图。
图4为在BDL大鼠胆汁淤积性肝硬化模型中，给予多肽AT03后对模型动物肝脏功能血液生化ALP统计图。
图5为在BDL大鼠胆汁淤积性肝硬化模型中，给予多肽AT03后对模型动物肝脏功能血液生化ALT统计图。
图6为在BDL大鼠胆汁淤积性肝硬化模型中，给予多肽AT03后对模型动物肝脏功能血液生化AST统计图。
图7为在BDL大鼠胆汁淤积性肝硬化模型中，给予多肽AT03后模型动物肝脏H&E染色病理切片图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。除非另有说明，否则所用试剂或仪器均可以通过市购获得。
本发明的实验结果采用GraphPad Prism软件进行分析，数据以平均值±标准误差(Mean±SEM)表示，并通过t检验进行评价。模型组与对照组比较，以*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001表示，给药组与模型组比较，以#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001表示。以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的大鼠均为健康雄性SD大鼠，年龄为4-6周，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
实施例1、多肽AT03的制备
多肽AT03的氨基酸序列为：Val-His-Val-Val-R1；其中，R1＝-NH2。本实施例中，AT03采用Fmoc固相多肽合成法，由羧基端向氨基端方向合成，多肽AT03的氨基酸按照前述氨基酸顺序依次连接。
(1)多肽合成
本发明的制备条件采用MBHAR(Amide-MBHA-Resin酰胺保护的MBHA树脂)或者王树脂，以活化脂的方法，脱Fmoc保护基合成。
本发明的茚检试剂包括以下组分：
试剂1：20g苯酚/5mL乙醇；
试剂2：0.05 0.001M KCN(水)/2.5mL吡啶；
试剂3：0.5g茚三酮/10mL乙醇；
茚检试剂的使用比例为试剂1:试剂2:试剂3＝l:2:l(滴)，沸水中加热3-10min。
本发明的多肽AT03的制备方法具体包括以下步骤：
A.处理树脂：称取一定量MBHA树脂(1％交联度，200-400目，取代值0.5mmol/g)于合成仪中，加入DCM搅拌30min，抽干，再用DMF洗4次，每次2min，挑取少量树脂进行茚检，若树脂颜色无改变，表明正常，可使用。
B.脱Fmoc保护：20％哌啶(溶于DMF中)洗4次，每次2min，然后用DMF洗4次，每次2min，在第3次洗之后茚检，茚检显蓝紫色表明Fmoc已脱，可接下一个氨基酸。
C.缩合反应：将氨基酸、HOBT、HBTU依次加入烧杯中，加入DMF使其溶解，DMF体积尽量小，加入DIEA启动反应后，立即加入到合成仪中，之后用少量DMF冲洗烧杯和合成仪壁(投料量＝树脂取代值(mmol/g)×m(树脂质量g)×M(肽的分子量g/mol)×几倍过量，氨基酸、HBTU、HOBT加入3倍过量，DIEA为液体碱，起到活化酯反应，加入6倍过量，保证每步接近99％成功)。整个反应体系用氩气保护。反应搅拌1h，抽干，用DMF洗3次，每次2min，茚检无改变，说明氨基酸已接到树脂上。
D.每接一个氨基酸，都重复步骤B、C，直至接肽完成为止。
E.多肽切割：
a.多肽AT03的氨基酸全部连接完成后，用20％哌啶脱F-moc保护，洗4次，每次2min，然后用DMF洗4次，每次2min，茚检显色后，用DCM洗2次，每次3min，甲醇洗1次，每次3min，再用DCM洗1次，每次3min，甲醇洗2次，每次3min。经过处理后，移开搅拌棒，用胶塞密封合成仪，再使用真空泵彻底抽干，至少2h以上，直至树脂完全干燥呈粉末状。
b.在抽干的合成仪中加入切割剂(TFA:Tis:水＝95:2.5:2.5(V/V/V))，反应3h，每20min搅拌1min，用圆底烧瓶收集切割剂，并用TFA洗涤2次，每次5min(5mL/次)，收集的TFA与之前收集的切割剂合并。
c.将所得的切割剂在旋转蒸发仪上减压抽干，把预先冷却的乙醚(50-80mL)加入到圆底烧瓶中，用力摇晃进行沉淀，静置。待白色固体沉淀到底部，使用滴管吸取上清液，加入分液漏斗中，补加等体积水，摇晃(中间放气几次)，静置。这时，分液漏斗内部的液体会进行分层，把下层水相流入圆底烧瓶中，将沉淀进行溶解(如果不好溶解，可加醋酸调节溶解性)。
d.轻轻摇晃圆底烧瓶(防止乳化)，使得溶解彻底，然后倒入分液漏斗，把水相流入烧杯收集，多次冲洗，每次冲洗后收集水相。
e.用保鲜膜密封烧杯，插孔、标记，-80℃过夜存放，然后真空冷冻干燥处理。
(2)粗肽脱盐
由于粗肽中存在反应过程中生成的副产物、盐和一些其他杂质，因此要对粗肽进行脱盐处理，初步除去杂质。首先称取一定量的sephadex G-25(约50-100目)，加入5-10倍去离子水，加热溶胀3h，装柱。待自然沉降完全后，用10％醋酸平衡柱子2h左右，然后上样、10％醋酸进行洗脱，收集核酸蛋白紫外检测仪220nm处有吸收峰的溶液，同样用保鲜膜密封烧杯，插孔、标记，-80℃过夜存放，然后真空冷冻干燥处理。
(3)脱盐产物的纯化和纯度分析
用高效液相色谱进行纯化：制备柱为C18反相制备柱，规格为XBridgeTMBEH130Prep C18(10μm，19×250mm)，洗脱体系为20％-80％乙腈/水/0.1％三氟乙酸，持续60min，流速：8mL/min，收集主峰。待真空冷冻干燥后，送质谱(ESI-MS)进行验证。
纯化产物的纯度分析：分析柱为C18反相制备柱，规格为XBridgeTMBEH130PrepC18(10μm，4.6×250mm)，洗脱体系为10％-90％乙腈/水/0.1％三氟乙酸，持续30min，流速：mL1mL/min，根据220nm色谱图积分，计算纯度。
合成的多肽采用高效液相色谱进行纯化(纯度>95％)，并通过高分辨质谱进行表征。
基于以上合成步骤，合成得到本发明的多肽AT03。
实施例2、本发明的多肽AT03对胆总管结扎(BDL)大鼠胆汁淤积性肝硬化模型的改善治疗作用
本实施例的具体方法如下。
1.受试药物：多肽AT03，阳性对照药物(熊去氧胆酸，UDCA)。保存条件-20℃。
造模方法:实验动物术前采用3％戊巴比妥钠按60mg/kg剂量进行麻醉，腹部皮肤常规消毒后，沿腹正中线切开，暴露胆总管，将胆总管近肝门部进行双侧缝扎，查腹腔内无活动性出血后常规关腹，假手术组仅开腹并游离胆总管后关腹，术后根据动物反应，给予抗生素进行术后护理，正常对照组动物不做任何处理。
分组方法：将50只SD大鼠，雄性，体重180-250g，周龄5周，随机分为5组。分别为：1)正常对照组(Control group)，PBS，腹腔注射，n＝10；2)假手术对照组(Sham group)，PBS，腹腔注射，n＝10；3)BDL模型对照组(Model group)，PBS，腹腔注射，n＝10；4)阳性药物对照组，UDCA，口服灌胃，80mg/kg，n＝10；5)多肽治疗组，多肽AT03,150ug/kg，腹腔注射，n＝10。
给药频率：阳性药物对照组，每天一次给药，给药周期共14天。其余组别隔天一次给药，给药周期共14天。其中多肽AT03的溶媒为PBS，UDCA的溶媒为0.5％羧甲基纤维素钠混悬配制(0.5％CMCNa)，所有试剂和UDCA均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
检测方法：试验终点，大鼠颈静脉采血，分离血清。药物治疗周期结束36小时，实验动物经安乐死后进行解剖，取肝脏组织，称重后，10％甲醛固定，石蜡包埋，切成3μm厚的切片，然后在二甲苯中脱蜡，梯度乙醇水合，H&E染色，脱水、透明，封固，显微镜下观察并拍摄肝脏组织病理学改变。
2.药效评价：
胆总管结扎术是目前构建肝硬化动物模型的经典造模方法，该疾病模型所致疾病状态与人体继发性胆汁淤积肝硬化的发病机制相吻合，能够反映人体因长期胆汁淤积所致肝纤维化及肝硬化的疾病进程，本发明选用SD大鼠作为试验动物种属进行模型构建及药效评价。肝外胆管梗阻可引起梗阻部位以上胆管扩张、胆汁淤积、胆管内压力增高，并可引发肝内胆小管扩张破裂，导致肝细胞缺血坏死，进而发展为胆汁淤积性肝纤维化及肝硬化。在连续2周(14天)治疗周期内，基于肝脏功能血液生化及肝脏组织病理学特征等指标的改变，评价多肽AT03对胆总管结扎诱导大鼠肝硬化模型的治疗作用。
3.实验方法：
苏木素-伊红(H&E)染色：取石蜡包埋的组织切片，60℃烘1h。脱蜡水化：二甲苯20分钟→二甲苯20分钟→无水酒精15分钟→无水酒精15分钟→95％酒精10分钟→90％酒精5分钟→80％酒精5分钟。染色：苏木精7分钟→自来水冲洗干净→1％盐酸乙醇分化1s→自来水冲洗→伊红染色15s-20s→自来水冲洗。脱水透明：75％酒精1s→85％酒精1s→95％酒精1s→100％酒精1s→二甲苯1s→二甲苯1s。封片晾干30分钟，树胶封片。
在胆总管结扎(BDL)大鼠胆汁淤积性肝硬化模型中，给予150μg/kg的多肽AT03后，血液检测胆汁淤积性指标统计结果如图1至图3所示。血液生化检测肝功能指标结果如图4至图6所示。大鼠动物肝脏H&E染色病理切片如图7所示。
从图1、图2和图3的结果可以看出，BDL大鼠模型经本发明的多肽AT03给药治疗后，正常对照组及假手术对照组动物血清总胆红素T-BIL在试验周期内代谢稳定，未见明显异常。BDL模型对照组动物血清胆红素代谢状态明显受阻，血清总胆红素T-BIL、直接胆红素D-BIL及间接胆红素I-BIL水平显著升高，与同时期正常对照组动物相比具有明显统计学差异(P<0.001)，提示模型动物在试验手术诱导下出现明显胆汁淤积反应。多肽AT03在设定剂量(150μg/kg)连续治疗两周后与BDL模型对照组相比具有明显改善趋势，多肽治疗组动物血清T-BIL、D-BIL和I-BIL改善效应明显，与BDL模型对照组相比具有统计学差异(P<0.05)。
从图4的结果可以看出，经过本发明多肽AT03治疗后，血清中血清碱性磷酸酯酶(ALP)下降。ALP可反应胆道梗阻及肝内胆管细胞进行性病变的，可用于肝脏内胆汁排泄障碍、肝外梗阻、肝纤维化/肝硬化诊断分析。
从图5和图6的结果可以看出，本发明多肽AT03对模型动物胆汁淤积诱导肝损伤进程具有明显改善作用。至试验终点，治疗组血清ALT和AST水平与BDL模型对照组相比明显降低。
从图7病理切片可以看出，经过本发明多肽AT03的治疗，模型动物肝脏炎性细胞聚集得到了较为明显的改善；多肽治疗组小鼠肝脏纤维化得到了改善。说明本发明的多肽AT03可以很好的抑制ECM的积累，治疗改善肝脏纤维化进程。
综上所述，本发明的多肽AT03具有改善肝脏胆汁淤积、肝内胆道梗阻和肝细胞损伤以及肝脏组织纤维化进程的作用，具有能够应用于制备治疗原发性胆汁性胆管炎的药物的前景。
当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求书所界定的保护范围。
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