一种除湿的发酵型小分子肽及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种除湿的发酵型小分子肽及其制备方法和应用 (Dehumidifying fermented small molecular peptide and preparation method and application thereof ) 是由 赵海峰 赵国安 康明 葛振龙 皮子凤 刘志强 杨茂君 高波 韩葳葳 李婉南 韩璐 于 2020-12-22 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种除湿的发酵型小分子肽及其制备方法和应用,所述发酵型小分子肽包括ADFW和HADF。本发明以红色食品为原料,通过采用合适的水解条件,制备得到了富含本发明小分子肽的水解物,本发明的小分子肽具有较高的抗氧化活性,由此所得到的多肽水解物对于除湿,特别是治疗丘疹样荨麻疹、湿疹、皮肤瘙痒具有重要意义。有望在抗衰老、美容方面取得功效。(The invention relates to a dehumidifying fermentation type small molecular peptide and a preparation method and application thereof, wherein the fermentation type small molecular peptide comprises ADFW and HADF. The hydrolysate rich in the small molecular peptide is prepared by taking red food as a raw material and adopting proper hydrolysis conditions, the small molecular peptide has higher antioxidant activity, and the obtained polypeptide hydrolysate has important significance for dehumidifying, particularly treating papular urticaria, eczema and skin pruritus. Is expected to have the effects of resisting aging and beautifying.)
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种除湿的发酵型小分子肽及其制备方法和应用。
背景技术
红色食品是指食品为红色、橙红色或棕红色的食品。这类食品富含天然活性植物色素(如番茄红素、花青素、辣椒红素、甜菜红素等)、胡萝卜素、铁、蛋白质和部分氨基酸，是优质蛋白质、碳水化合物、膳食纤维、B族维生素和多种无机盐的重要来源，可以弥补粳米、白面中的营养缺失。科学研究表明，红色食品有治疗缺铁性贫血和缓解疲劳的作用，对乳腺癌等肿瘤疾病有防治作用，给人以兴奋感，有增加食欲，光洁皮肤，增强表皮细胞再生和防止皮肤衰老，预防感冒等作用。经常食用红色食品，可以进一步提高对主食中营养的利用率，山楂、红参等食品还有治疗癌症的功效。被称为“红色生力军。”营养学家认为，红色蔬果最典型的优势在于它们都是富含天然铁质的食物，例如常吃的花生、大枣等都是贫血患者的天然良药，也适合女性经期失血后的滋补。所以，红色蔬果，女人尽可放心多吃。红色食品中还含有致病微生物的“杀手”一一巨噬细胞，可以有效地抵御感冒病毒等微生物，增强人体抵抗感冒的能力。
但是上述涉及的红色食品传统的应用方法大多作为普通食品或者提取其中的活性天然植物色素进行开发利用，极少关注其中的蛋白质类成分。科学研究发现，多种食物的蛋白水解物(小分子肽)具有较强的抗氧化能力，而市面上一些普遍的抗氧化剂如维生素E等,虽然能够清除活性氧，但对已造成的损伤修复效果较弱且会产生副作用。本发明对红色食品中的复合小分子肽进行开发利用，弥补了普通抗氧化剂不具有损伤后修复功能的缺陷,更全面地开发利用了红色食品的营养价值。
采用酶水解蛋白制备抗氧化肽是主流的方法，但由于许多蛋白酶有特异性的酶切位点及蛋白质氨基酸序列的独特性，因此选用不同的蛋白及酶组合对于生成具有独特功能性的肽化合物具有重要意义。就现有的酶解方法而言，有些使用了无特异性或广泛特异性的蛋白酶，这样的生产重复性低并且会产生游离氨基酸，或是肽链会被水解的过小导致功能性降低，最后产物的收率也较低，总体而言还缺乏稳定、高效制备抗氧化肽的方法。
本申请的发明人在先申请CN111357865A公开了一种红色食品复合小分子肽及制备方法和在细胞修复中的应用，包括以下原料：赤小豆、红米、红慧米、红南瓜、花生、大枣、山楂、红藜麦、枸杞子、洛神花、红参；所述基于红色食品原料的复合小分子肽的制备方法包括以下步骤:原料粉的制备；发酵产物的制备；酶解产物的制备；复合小分子肽成品的制备。本发明提出的复合小分子肽，具有纯天然，无添加的特点，色泽鲜红诱人，食欲感强，食用人群广，口感好，营养价值高，具有修复受损细胞、延缓衰老、去除氧自由基、补气血及增强免疫力的保健功效。但是，由于该多肽水解物中活性成分含量较低，特别是作为活性成分的ADF的抗氧化性还有待进一步提高，由此所得到的多肽水解物除湿的效果有待进一步改进。
发明内容
本发明的目的是提供一种除湿的发酵型小分子肽及其制备方法和应用。具体而言，为了实现本发明的目的，本发明拟采用如下的技术方案：
本发明一方面涉及一种除湿的发酵型小分子肽，其包括ADFW和HADF。
在本发明的一个优选实施方式中，所述ADFW的含量为0.9wt％以上，HADF的含量为0.7wt％以上。
本发明另一方面还涉及含有上述发酵型小分子肽的水解物，其中包含60wt％以上的短肽，所述短肽是指肽链长度为10个以下3个以上的肽。
本发明另一方面还涉及上述水解物的制备方法，其特征在于通过如下步骤制备得到：
(1)将重量份为赤小豆200～300；红米红慧米红南瓜花生山楂红糖大枣50～100；红藜麦枸杞子 猴头菇粉茯苓10-30；洛神花红参破壁粉碎，溶解在水中；
(2)加入纤维素酶和果胶酶的混合物，调节pH至4-5，加热反应液至50-60℃，放入搅拌器中，酶促水解1-3小时；
(3)水解之后加入胰蛋白酶和菠萝蛋白酶，搅拌均匀得到反应液，调节反应液的pH至7-8，加热反应液至50-60℃，放入搅拌器中，酶促水解时间为2-4小时；
(4)水解之后加入丝氨酸蛋白酶，在pH6.5-7.5和50-60℃温度下进行酶促水解3-5小时；
(5)在热处理使酶变性；
(6)离心并回收液相；
(7)先通过4-6kDa膜对液相进行超滤和渗滤并回收渗透物；
(8)再通过150-300Da膜对来自超滤的渗透物进行纳米过滤并回收渗余物；
(9)进行冷冻干燥，得到水解物。
本发明另一方面涉及上述小分子肽作为抗氧化剂和/或除湿中的应用。
本发明另一方面还涉及上述水解物在除湿中的应用以及在制备治疗丘疹样荨麻疹、湿疹和/或皮肤瘙痒的药物或食品中的应用。
有益效果
本发明通过采用合适的水解条件，制备得到了富含本发明小分子肽的水解物，本发明的小分子肽具有较高的抗氧化活性，由此所得到的多肽水解物对于除湿，特别是治疗丘疹样荨麻疹、湿疹、皮肤瘙痒具有重要意义。有望在抗衰老、美容方面取得功效。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
实施例1：
(1)称量赤小豆300g、红米300g、红慧米300g、红南瓜300g、花生200g、山楂150g、红糖150g、大枣100g、红藜麦50g、枸杞子30g、猴头菇粉30g、茯苓30g、洛神花30g及红参30g；水清洗干净，烘干去除水分并使用破壁机破壁粉碎，备用；
(2)加入纤维素酶(2.0％/DM)和果胶酶(1.0％/DM)的混合物，调节pH至4.5，加热反应液至55℃，放入搅拌器中，在40rpm的条件下反应，酶促水解2小时；
(3)水解2小时之后加入胰蛋白酶(1.5％/DM)和菠萝蛋白酶(2.0％/DM)，搅拌均匀得到反应液，调节反应液的pH至7.5，加热反应液至55℃，放入搅拌器中，在40rpm的条件下反应，酶促水解时间为3h；
(4)水解之后加入丝氨酸蛋白酶(1.5％DM)，在pH 7.0和55℃温度下进行酶促水解4小时；
(5)在85℃下热处理45分钟以使酶变性；
(6)离心并回收液相；
(7)先通过5kDa膜对液相进行超滤和渗滤并回收渗透物；
(8)再通过200Da膜对来自超滤的渗透物进行纳米过滤并回收渗余物；
(9)进行冷冻干燥，得到水解物。经过测试，所述水解物中包含62％重量的短肽、27％的多糖以及11％的其它物质。
比较例1：
参照实施例1，其区别在于步骤(3)中不加入胰蛋白酶。由此得到的得到水解物，经过测试，所述水解物中包含47％重量的短肽、35％的多糖以及18％的其它物质。
比较例2：
参照实施例1，其区别在于步骤(3)中不加入菠萝蛋白酶。由此得到的得到水解物，经过测试，所述水解物中包含37％重量的短肽、32％的多糖以及31％的其它物质。
比较例3：
参照实施例1，其区别在于先进行步骤(4)，再进行步骤(3)。由此得到的得到水解物，经过测试，所述水解物中包含53％重量的短肽、28％的多糖以及19％的其它物质。
对于上述水解产物，通过测定ORAC值(μmol TE/mmol)和DPPH值(μmol TE/mmol)来比较其抗氧化活性，实验结果如表1所示。
表1：水解物抗氧化活性测试结果
从上述比较结果来看，实施例1的抗氧化活性高于比较例1-3，由此说明实施例1的水解产物具有较高的抗氧化活性。
对于由实施例1和比较例1-3所得到的水解物，分析其包含的短肽的含量，通过检测发现，实施例1中丰度最高的短肽为ADFW和HADF，其含量达到水解物的0.92％和0.76％，而在比较例中ADFW和HADF的含量最高的是比较例3，仅为0.57％和0.53％。
为了进一步确定是否是由于ADFW和HADF的存在使得水解物的抗氧化活性较高，对于检测出的丰度较高的短肽，使用通常的肽的化学合成方法即Fmoc固相合成法来合成，作为抗氧化活性测定用的样品，作为比较，以CN111357865A所得到的丰度最高的ADF作为对照。对于合成的短肽，测定ORAC值(μmol TE/mmol)DPPH值(μmol TE/mmol)，将各肽序列的分析结果汇总于表2。
表2：短肽抗氧化活性测试结果
基于上表可以看出，通过同时包含表现出高ORAC值和表现出高DPPH值的ADFW和HADF，从而使得水解物的抗氧化性能全面优异，特别是，相比于CN111357865A所公开的ADF，本发明的肽具有更高的抗氧化活性。
水解物除湿效果:
一、临床资料
试验方法：随机、阳性药对照临床研究。
安全性评价指标：一般体格检查，血、尿、大便常规，肝、肾功能、心电图，不良反应等。
病例数：治疗组40例，阴性对照组40例，阳性对照组40例，共120例,临床表现丘疹样荨麻疹、湿疹、皮肤瘙痒。
二、试验药品
治疗组：本发明实施例1所制备得到的水解物，每次10g，温开水送服，每日3次。
阴性对照组：不进行处理。
阳性对照组：CN111357865A实施例1所制备的小分子肽溶液，每次40g(干物质量为10g)，加热后送服，每日3次。
三、受试者治疗
疗程：1周，观察期内，每天随访1次，除有严重不良反应者外，观察1周后，一般不再进行随访。
四、统计结果
从上表可以看出，采用本发明的水解物能够有效缓解丘疹样荨麻疹、湿疹、皮肤瘙痒。此外，在观察期间未见明显不良反应，也未见肝、肾功能及造血系统损害，表明本发明的小分子肽使用安全。
以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。
序列表
<110> 吉林省特医食品生物科技有限公司
中国科学院长春应用化学研究所
<120> 一种除湿的发酵型小分子肽及其制备方法和应用
<130> CP20786
<141> 2020-12-22
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> 植物(plant)
<400> 1
Ala Asp Phe Trp
1
<210> 2
<211> 4
<212> PRT
<213> 植物(plant)
<400> 2
His Ala Asp Phe
1
<210> 3
<211> 3
<212> PRT
<213> 植物(plant)
<400> 3
Ala Asp Phe
1
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