具体实施方式

本发明提供了过表达TaHAK1在提高水稻钾胁迫耐性中的应用。在本发明中，所述过表达TaHAK1的方法优选包括：将TaHAK1蛋白的过表达载体转入水稻中，得到能够过表达TaHAK1的转基因水稻；所述过表达载体优选包括骨架载体和TaHAK1的编码序列；所述骨架载体优选包括pCUN-1301质粒；所述TaHAK1的编码序列优选为使用引物对通过PCR扩增得到；所述引物对优选包括如SED ID NO:1所示的正向引物：5’-GCCGGTACCATGCGGAGAAGGTCTCCGACTCG-3’，SED ID NO:1；和如SED ID NO:2所示的反向引物：5’-CGCGTCGACTATCTCGTATGTGATCCCGACTTGAGC-3’，SED ID NO:2。所述TaHAK1基因的序列如SED ID NO:3所示：>TraesCS4D02G308200.1

ATGTCGGTCCAGGCGGAGGAGCCGCGGGACACGGAGACAGCGCCTGCCCCGCTCAAGCGCCATGACTCGCTTTGGGGTGATGCAGAGAAGGTGTCCCATACCAACCACCATGGCTCCCGGGTGAGCTGGGTCCGGACGCTGAGCCTCGCCTTCCAGAGCGTCGGCATCATCTACGGCGACATCGGGACGTCGCCGCTCTACGTCTACTCCAGCACCTTCCCCGACGGCATCAAGCACAACGACGACCTCCTGGGCGTCCTGTCGCTCATCATCTACACCCTCATCATAATACCCATGCTCAAGTACGTCTTCATCGTGCTCTACGCAAACGACAACGGAGATGGTGGCACGTTTGCGCTTTACTCCCTGATATCGCGGTATGCAAAGATCAGGCTGATACCGGACCAGCAGGCCGAGGATGCTGCGGTGTCGAATTACCGGATAGAAGCGCCCAACTCGCAGCTGAGGAGGGCGCAGTGGGCCAAGCAGAAGCTCGAGTCTAGCAAGGCGGCCAAGATCGCGCTCTTCACCCTCACCATCCTCGGCACATCCATGGTGATCGGCGATGGAACCTTGACGCCCGCAATCTCTGTGCTGTCTGCAGTGAGTGGGATCAGAGAAAAAGCACCAAGCCTCACTCAAACACAAGTGGTGCTCATCTCGGTGGCGATCCTGTTCATGCTCTTCTCGGTCCAGCGTTTCGGGACCGACAAGGTCGGCTACACGTTTGCTCCTGTCATCTCGGTGTGGTTCCTTTTCATTGCGGGCATCGGCTTGTACAACCTCGTCATTCATGATGTCGGTGTCCTACGGGCCTTCAATCCGATATATATCATACAGTACTTCAAGAGGAATGGCAAGGAGGGATGGGTTTCACTTGGTGGAGTCATCTTGTGTGTCACAGGCACAGAAGGTATGTTTGCTGACCTGGGACATTTCAACATCAGGGCTGTTCAGATCAGCTTCAACGGCATCTTGTTCCCGGCTGTTGGGCTGTGTTACATCGGCCAGGCGGCTTACCTGAGGAAATTCCCAGAGAACGTGGCAAACACCTTCTATAGATCTATCCCAGCACCAATGTTCTGGCCAACCTTCATCGTTGCCATCCTTGCTGCCATCATAGCAAGCCAAGCTATGCTGTCCGGCGCATTTGCCATCCTCTCCAAGGCTCTGTCTCTGGGTTGCATGCCCAGGGTTCAAGTCATCCACACATCACACAAATACGAGGGGCAGGTGTACATTCCTGAAGTCAACTTCATAATGGGATTGGCGAGCATCGTAGTCACCGTCGCCTTCAGAACCACCACAAGCATCGGGCATGCTTATGGGATCTGTGTTGTTACTACATTCATCATCACCACCCACCTGATGACTGTCGTGATGCTCCTCATATGGAAGAAGCACGTCATCTTCATCGCGCTCTTCTACGTCGTGTTTGGCTCCATAGAGATGATCTACCTCTCTTCCATACTGTCGAAATTCATCGAGGGCGGGTACCTCCCCATCTGCTTCGCACTGGTCGTGATGAGCCTGATGGCGGCATGGCACTACGTCCAAGTCAAGAGGTACTGGTACGAGCTGGACCACATCGTGCCTACTAGTGAACTGACAGTGCTGCTCGAGAAGAACGATGTGAGGAGGATCCCAGGGGTTGGCCTCCTCTACACGGAGCTGGTCCAGGGAATCCCTCCGGTGTTCCCTCGGCTGATCGAGAGGATACCATCCGTGCACTCCATCTTCATGTTCATGTCCATCAAGCACCTGCCCATCTCACGTGTACTGCCCGCAGAGAGGTTTCTCTTCCGGCAGGTCGGCCCGAGGGAGCAGCGGATGTTCCGCTGCGTGGCGCGGTATGGATATACCGACACGCTGGAGGAGCCCAAGGAGTTTGTTGCCTTCCTCATGGATGGGCTCAAGATGTTCATTCAAGAGGAGAGCGCATTCGCACACAACGAAGTGGAGGAGATCACCGCTGGTGGTGAAGCTTCCAATGATCAGCCATCTATGGCATCGGGGCGATCCACACGCAATGCAGTGCACAGCGAGGAGATGGTCCAAGCCAGGGTGAGCAGCCACTCGTCGGGGAGGATCGGTAGCTTCCACTCCAACCGGACAGTTGAGGAGGAGAAGCAACTGATTGACAGAGAGGTGGAACACGGGATGGTGTATCTGATGGGGGAGGCCAATGTCACCGCCAAAGCCAACTCCTCGGTCTTCAAGAAGGTGGTGGTCAACTATGTTTACACATTCTTGAGGAAGAACTTGACGGAGGGGCACAAGGCACTAGCCATTCCGAAAGATCAGTTGCTCAAAGTTGGGATCACATATGAGATATAG，SED ID NO:3；所述TaHAK1蛋白的序列如SED ID NO:4所示：>TraesCS4D02G308200.1

MSVARDTTAAKRHDSWGDAKVSHTNHHGSRVSWVRTSASVGIIYGDIGTSYVYSSTDGIKHNDDGVSIIYTIIIMKYVIVYANDNGDGGTAYSISRYAKIRIDADAAVSNYRIANSRRAWAKKSSKAAKIATTIGTSMVIGDGTTAISVSAVSGIRKASTTVVISVAIMSVRGTDKVGYTAVISVWIAGIGYNVIHDVGVRANIYIIYKRNGKGWVSGGVICVTGTGMADGHNIRAVISNGIAVGCYIGAAYRKNVANTYRSIAMWTIVAIAAIIASAMSGAAISKASGCMRVVIHTSHKYGVYIVNIMGASIVVTVARTTTSIGHAYGICVVTTIITTHMTVVMIWKKHVIIAYVVGSIMIYSSISKIGGYICAVVMSMAAWHYVVKRYWYDHIVTSTVKNDVRRIGVGYTVGIVRIRISVHSIMMSIKHISRVARRVGRRMRCVARYGYTDTKVAMDGKMISAAHNVITAGGASNDSMASGRSTRNAVHSMVARVSSHSSGRIGSHSNRTVKIDRVHGMVYMGANVTAKANSSVKKVVVNYVYTRKNTGHKAAIKDKVGITYI，SED ID NO:4。

在本发明中，所述钾胁迫优选包括低钾胁迫和缺钾胁迫，所述低钾胁迫中钾含量优选小于等于3mM K/L，大于0mM K/L，在本发明实施例中，低钾胁迫中钾含量为0.3mM K/L，所述缺钾胁迫中，钾含量优选为0mM K/L(在实际操作中钾离子由其他元素替代)。本发明过表达TaHAK1基因的水稻在低钾及缺钾的状态下仍能够表现出优良的成长状态，植株的干重、根系和叶片的生物量显著高于对照植株，同时在低钾条件下，转基因水稻植株的K含量在根系和叶片中积累均显著上升；然而在缺钾条件下，转基因水稻植株的K含量仅在地上部显著高于野生型，在根系中则显著降低，说明在缺钾条件下，TaHAK1基因影响了K在水稻根系向叶片的转移，提高了转基因水稻耐低钾的能力。

本发明还提供了过表达TaHAK1在提高钾胁迫水稻植株干重中的应用。在本发明中，在低钾和缺钾条件下，过表达TaHAK1的水稻植株均能够有效提高根系和叶片的干重。

本发明还提供了过表达TaHAK1在提高钾胁迫水稻根系和叶片中钾含量的应用。在本发明中，在低钾状态下，过表达TaHAK1的水稻植株根系干重相较于野生型水稻增加量高达1.33倍，叶片干重的增加量高达1.19倍；在缺钾状态下，过表达TaHAK1的水稻植株叶片干重增加量高达1.19倍。

本发明还提供了过表达TaHAK1在提高钾胁迫水稻中钾从根系向叶片的转移中的应用。在本发明中，在低钾状态下，过表达TaHAK1的水稻植株的K含量显著上升，最高高达34.2％；在缺钾状态下，过表达TaHAK1的水稻植株的K含量在地上部分增高，地下部分降低，说明说明在缺钾条件下，过表达TaHAK1的水稻植株中的过表达载体影响了K在水稻根系向叶片的转移。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的过表达TaHAK1在提高水稻钾胁迫耐性中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

TaHAK1蛋白及其编码基因的获得

1.1提取小麦总RNA和制备cDNA

1)提取小麦总RNA：取0.1g小麦幼苗根系作为材料，在液氮中研磨得到冻干粉，将冻干粉转入到含1mLTrizol试剂(购自Invitrogen)的1.5mL离心管中，充分混匀；在25℃的环境中放置5min；向离心管中加入预冷氯仿0.2mL，摇晃15s，25℃放置2～3min；离心(4℃，12000rpm，15min)；将上清(约0.5mL)转移到新的1.5mL离心管中，再加入预冷异丙醇0.5mL，25℃放置10min；离心(4℃，12000rpm，15min)；取沉淀，将沉淀用75％乙醇(1mL)清洗2次，将经过清洗的沉淀放置于超净台吹3～5min；加入50μLDEPC-ddH2O重悬沉淀，即得到提取的总RNA溶液，检测质量后，将其保存-70℃备用。准备做反转录的模板。

2)RT-PCR：参照RT-PCR试剂盒(购自Taraka)说明书，稀释提取得到的总RNA溶液；根据RNA的定量结果，每1μg RNA中加入0.5μg Oligo dT引物，加入DEPC-ddH₂O补充至7.5μL，混匀后在65℃变性5min，再置于冰上放置5min；瞬时离心后，加入12.5μL反转录混合物(包括5×ReactionBuffer，2.5μL；dNTPMixture(2.5mM)，3.0μL；Reverse TranscriptaseEnzymes，0.5μL；RNase Inhibitor，0.5μL；DEPC-ddH₂O，6.0μL)。混匀后，PCR条件：42℃，1h；95℃，10min；完成cDNA反转录得到cDNA，测定cDNA浓度备用。

1.2TaHAK1的扩增

根据TaHAK1的序列，设计引物，所述TaHAK1的序列如SED ID NO:3所示。

设计得到的引物中正向引物如SED ID NO:5所示：5’-ATGTCGCTCCAGGTCGAGG-3’，SED ID NO:5；

反向引物如SED ID NO:6所示：5’-CTATATCTCGTATGTGATCCCGA-3’，SED ID NO:6；

加入1.1制备得到的cDNA作为模板，配置反应体系如下：Prime Star(10μL)；正反向引物SED ID NO:5和SED ID NO:6(各1μL)；cDNA(1μL)；蒸馏水(8μL)。然后利用PCR扩增，扩增程序：预变性(94℃，1min)；PCR扩增32循环(变性，94℃，10min；复性，56℃，15s；延伸，72℃，1min)后，72℃继续延伸10min，得到PCR产物，将PCR产物在琼脂糖凝胶电泳分离，电泳图如图1所示，电泳分离得到约2337bp的PCR产物条带。

将PCR产物回收，并进行测序。测序结果显示PCR产物的核苷酸序列和SED ID NO:3序列一致。说明扩增得到TaHAK1的序列。

实施例2

TaHAK1蛋白及其编码基因的应用

2.1TaHAK1超表达载体的构建

设计一对引物，正向引物序列如SED ID NO:1所示；反向引物如SED ID NO:2所示。利用SED ID NO:1和SED ID NO:2经过PCR扩增得到TaHAK1基因的编码序列，回收片段，即为PCR产物。

利用限制性内切酶KpnI和BamHI对骨架载体pCUN-1301质粒进行双酶切，酶切体系为：质粒10μL(1mg)、10x酶切缓冲液5μL、BamHI 1μL(10U/μL)、KpnI 0.8μL(10U/μL)，加ddH₂O补充反应体系至50μL，37℃酶切3h。用琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离，回收线性化的pUN1301大片段，即为载体片段。

利用T4连接酶将上述PCR产物和载体片段连接，其中载体片段和PCR产物的比例为1:3，根据浓度分别稀释加入载体片段2.0μL和PCR产物6.0μL，再加入T4DNA连接酶1.0μL和10x连接酶缓冲液1.0μL，混匀后离心，在16℃的条件下连接10h，得到连接产物即为过表达pCAMBIA1300-TaHAK1载体。将连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，利用含有卡那霉素的抗性平板筛选培养16h得到单克隆，利用PCR检测单克隆阳性，测序验证PCR的检测结果。pCAMBIA1300-TaHAK1载体的物理图谱如图2所示，其中分别包含Ubi(玉米泛素基因)启动子，TaHAK1基因和Nos-T(农杆菌胭脂碱合成酶终止子)。

2.2TaHAK1转基因水稻的获得及鉴定

(1)TaHAK1转基因水稻的获得

利用电激仪将2.1构建得到的过表达载体转入到农杆菌EHA105菌株中，在卡那霉素的抗性平板筛选阳性克隆，检测TaHAK1是否转入。挑选检测正确的阳性克隆制备工程菌，将其导入到日本晴水稻(Oryza sativa L.)的愈伤组织中；导入后使用含300mg/L头孢霉素的无菌水洗涤愈伤组织4～5遍，用无菌滤纸吸干水分；将愈伤组织转移到含有潮霉素和头孢霉素的N₆D₂培养基上进行筛选；培养基每2周更换一次，连续进行3代培养，选择生长状态良好的愈伤组织将其转移到分化培养基培养，设置光周期为白天光照(12h，28℃)，夜晚黑暗(12h，24℃)；每周更换一次培养基，至分化出幼苗；选择生长发育健壮的幼苗转移到生根培养基上生根培养，待幼苗长至10cm左右，打开容器封口膜，炼苗2～3天，然后将幼苗移入人工气候室栽培，即为T0代转基因幼苗。具体操作过程如图3所示。

(2)TaHAK1转基因水稻的鉴定

提取上述T0代转基因幼苗(编号#1～#8)的DNA，利用筛选标记基因潮霉素引物检测转基因水稻是否含有带有潮霉素基因，结果如图4中A所示，由图4中A可知，除野生型(WT)外，检测植株均含有潮霉素基因。说明这些株系携带了过表达载体的筛选标记基因。

在此基础上，在载体基因的插入位点上游附近设计引物LBP(正向引物F如SED IDNO:7所示：5’-AAAAGGAAGGTGGCTCCTAC-3’，反向引物R如SED ID NO:8所示：5’-TCCCTCGGCCCGACCTG-3’)，将LBP和插入基因下游片段(RP)组合，扩增结果如图4中B所示，由图4中B可知，载体引物和基因下游引物组合扩增结果大于基因本身的引物，说明TaHAK1基因在转基因水稻中被过量表达。将上述携带过表达载体的植株进行加代培养，在大量种植的T2代植株中，分别提取上述含有目的基因和标记基因转基因植株的总蛋白质。利用HA标签抗体，检测这些株系在蛋白水平上的表达量。检测结果如图4中C所示：转基因株系TaHAK1-OE1和TaHAK1-OE3在蛋白水平上的表达量远高于其他株系。这2个株系被用于后续试验。

2.3转基因水稻在K胁迫耐性中作用的检测

将筛选得到的纯合株系TaHAK1-OE1和TaHAK1-OE3的种子单独发芽，待其长到3叶期，挑选生长发育一致的苗子，分为3份，对不同类型植株(对照组为野生型不携带过表达载体的植株，标记为WT)进行正常(+K，6.0mM K/L)、低钾(LK，0.3mM K/L)、缺钾(DK，0mM K/L)处理。

钾胁迫14天后，水稻的长势结果如图5所示，由图5可知，转基因水稻植株在LK和DK条件下的生长发育状态明显好于野生型植株。

对水稻对其生物量测定如图6、表1所示。图6中Root指根，Leaf指叶。

表1水稻生物量测定数据

由图6和表1可知，在LK和DK条件下，转基因水稻植株的干重分别比对照植株增加，其中LK条件下，转基因水稻植株TaHAK1-OE1和TaHAK1-OE3分别在根系增加1.32和1.33倍，在叶片中增加1.10和1.19倍；在DK条件下，转TaHAK1水稻植株的2个株系分别在叶片中显著增加1.18和1.19倍，而根系中差异不显著。

对水稻体内K含量测定如图7、表2所示。图7中Root指根，Leaf指叶。

表2水稻体内K含量测定

由图7和表2可知，在LK条件下，转基因水稻植株的K含量在根系和叶片中积累均显著上升(分别比对照增加34.2％、35.4％和19.2％、33.1％)；在DK条件下，转TaHAK1水稻植株的K含量仅在地上部显著高于野生型(1.93和1.81倍)，在根系中则显著降低(0.47和0.38倍)，说明在缺钾条件下，转基因水稻中的过表达载体影响了K在水稻根系向叶片的转移。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 河南农业大学

<120> 过表达TaHAK1在提高水稻钾胁迫耐性中的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gccggtacca tgcggagaag gtctccgact cg 32

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgcgtcgact atctcgtatg tgatcccgac ttgagc 36

<210> 3

<211> 2337

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtcggtcc aggcggagga gccgcgggac acggagacag cgcctgcccc gctcaagcgc 60

catgactcgc tttggggtga tgcagagaag gtgtcccata ccaaccacca tggctcccgg 120

gtgagctggg tccggacgct gagcctcgcc ttccagagcg tcggcatcat ctacggcgac 180

atcgggacgt cgccgctcta cgtctactcc agcaccttcc ccgacggcat caagcacaac 240

gacgacctcc tgggcgtcct gtcgctcatc atctacaccc tcatcataat acccatgctc 300

aagtacgtct tcatcgtgct ctacgcaaac gacaacggag atggtggcac gtttgcgctt 360

tactccctga tatcgcggta tgcaaagatc aggctgatac cggaccagca ggccgaggat 420

gctgcggtgt cgaattaccg gatagaagcg cccaactcgc agctgaggag ggcgcagtgg 480

gccaagcaga agctcgagtc tagcaaggcg gccaagatcg cgctcttcac cctcaccatc 540

ctcggcacat ccatggtgat cggcgatgga accttgacgc ccgcaatctc tgtgctgtct 600

gcagtgagtg ggatcagaga aaaagcacca agcctcactc aaacacaagt ggtgctcatc 660

tcggtggcga tcctgttcat gctcttctcg gtccagcgtt tcgggaccga caaggtcggc 720

tacacgtttg ctcctgtcat ctcggtgtgg ttccttttca ttgcgggcat cggcttgtac 780

aacctcgtca ttcatgatgt cggtgtccta cgggccttca atccgatata tatcatacag 840

tacttcaaga ggaatggcaa ggagggatgg gtttcacttg gtggagtcat cttgtgtgtc 900

acaggcacag aaggtatgtt tgctgacctg ggacatttca acatcagggc tgttcagatc 960

agcttcaacg gcatcttgtt cccggctgtt gggctgtgtt acatcggcca ggcggcttac 1020

ctgaggaaat tcccagagaa cgtggcaaac accttctata gatctatccc agcaccaatg 1080

ttctggccaa ccttcatcgt tgccatcctt gctgccatca tagcaagcca agctatgctg 1140

tccggcgcat ttgccatcct ctccaaggct ctgtctctgg gttgcatgcc cagggttcaa 1200

gtcatccaca catcacacaa atacgagggg caggtgtaca ttcctgaagt caacttcata 1260

atgggattgg cgagcatcgt agtcaccgtc gccttcagaa ccaccacaag catcgggcat 1320

gcttatggga tctgtgttgt tactacattc atcatcacca cccacctgat gactgtcgtg 1380

atgctcctca tatggaagaa gcacgtcatc ttcatcgcgc tcttctacgt cgtgtttggc 1440

tccatagaga tgatctacct ctcttccata ctgtcgaaat tcatcgaggg cgggtacctc 1500

cccatctgct tcgcactggt cgtgatgagc ctgatggcgg catggcacta cgtccaagtc 1560

aagaggtact ggtacgagct ggaccacatc gtgcctacta gtgaactgac agtgctgctc 1620

gagaagaacg atgtgaggag gatcccaggg gttggcctcc tctacacgga gctggtccag 1680

ggaatccctc cggtgttccc tcggctgatc gagaggatac catccgtgca ctccatcttc 1740

atgttcatgt ccatcaagca cctgcccatc tcacgtgtac tgcccgcaga gaggtttctc 1800

ttccggcagg tcggcccgag ggagcagcgg atgttccgct gcgtggcgcg gtatggatat 1860

accgacacgc tggaggagcc caaggagttt gttgccttcc tcatggatgg gctcaagatg 1920

ttcattcaag aggagagcgc attcgcacac aacgaagtgg aggagatcac cgctggtggt 1980

gaagcttcca atgatcagcc atctatggca tcggggcgat ccacacgcaa tgcagtgcac 2040

agcgaggaga tggtccaagc cagggtgagc agccactcgt cggggaggat cggtagcttc 2100

cactccaacc ggacagttga ggaggagaag caactgattg acagagaggt ggaacacggg 2160

atggtgtatc tgatggggga ggccaatgtc accgccaaag ccaactcctc ggtcttcaag 2220

aaggtggtgg tcaactatgt ttacacattc ttgaggaaga acttgacgga ggggcacaag 2280

gcactagcca ttccgaaaga tcagttgctc aaagttggga tcacatatga gatatag 2337

<210> 4

<211> 565

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ser Val Ala Arg Asp Thr Thr Ala Ala Lys Arg His Asp Ser Trp

1 5 10 15

Gly Asp Ala Lys Val Ser His Thr Asn His His Gly Ser Arg Val Ser

20 25 30

Trp Val Arg Thr Ser Ala Ser Val Gly Ile Ile Tyr Gly Asp Ile Gly

35 40 45

Thr Ser Tyr Val Tyr Ser Ser Thr Asp Gly Ile Lys His Asn Asp Asp

50 55 60

Gly Val Ser Ile Ile Tyr Thr Ile Ile Ile Met Lys Tyr Val Ile Val

65 70 75 80

Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Asp Gly Gly Thr Ala Tyr Ser Ile Ser Arg

85 90 95

Tyr Ala Lys Ile Arg Ile Asp Ala Asp Ala Ala Val Ser Asn Tyr Arg

100 105 110

Ile Ala Asn Ser Arg Arg Ala Trp Ala Lys Lys Ser Ser Lys Ala Ala

115 120 125

Lys Ile Ala Thr Thr Ile Gly Thr Ser Met Val Ile Gly Asp Gly Thr

130 135 140

Thr Ala Ile Ser Val Ser Ala Val Ser Gly Ile Arg Lys Ala Ser Thr

145 150 155 160

Thr Val Val Ile Ser Val Ala Ile Met Ser Val Arg Gly Thr Asp Lys

165 170 175

Val Gly Tyr Thr Ala Val Ile Ser Val Trp Ile Ala Gly Ile Gly Tyr

180 185 190

Asn Val Ile His Asp Val Gly Val Arg Ala Asn Ile Tyr Ile Ile Tyr

195 200 205

Lys Arg Asn Gly Lys Gly Trp Val Ser Gly Gly Val Ile Cys Val Thr

210 215 220

Gly Thr Gly Met Ala Asp Gly His Asn Ile Arg Ala Val Ile Ser Asn

225 230 235 240

Gly Ile Ala Val Gly Cys Tyr Ile Gly Ala Ala Tyr Arg Lys Asn Val

245 250 255

Ala Asn Thr Tyr Arg Ser Ile Ala Met Trp Thr Ile Val Ala Ile Ala

260 265 270

Ala Ile Ile Ala Ser Ala Met Ser Gly Ala Ala Ile Ser Lys Ala Ser

275 280 285

Gly Cys Met Arg Val Val Ile His Thr Ser His Lys Tyr Gly Val Tyr

290 295 300

Ile Val Asn Ile Met Gly Ala Ser Ile Val Val Thr Val Ala Arg Thr

305 310 315 320

Thr Thr Ser Ile Gly His Ala Tyr Gly Ile Cys Val Val Thr Thr Ile

325 330 335

Ile Thr Thr His Met Thr Val Val Met Ile Trp Lys Lys His Val Ile

340 345 350

Ile Ala Tyr Val Val Gly Ser Ile Met Ile Tyr Ser Ser Ile Ser Lys

355 360 365

Ile Gly Gly Tyr Ile Cys Ala Val Val Met Ser Met Ala Ala Trp His

370 375 380

Tyr Val Val Lys Arg Tyr Trp Tyr Asp His Ile Val Thr Ser Thr Val

385 390 395 400

Lys Asn Asp Val Arg Arg Ile Gly Val Gly Tyr Thr Val Gly Ile Val

405 410 415

Arg Ile Arg Ile Ser Val His Ser Ile Met Met Ser Ile Lys His Ile

420 425 430

Ser Arg Val Ala Arg Arg Val Gly Arg Arg Met Arg Cys Val Ala Arg

435 440 445

Tyr Gly Tyr Thr Asp Thr Lys Val Ala Met Asp Gly Lys Met Ile Ser

450 455 460

Ala Ala His Asn Val Ile Thr Ala Gly Gly Ala Ser Asn Asp Ser Met

465 470 475 480

Ala Ser Gly Arg Ser Thr Arg Asn Ala Val His Ser Met Val Ala Arg

485 490 495

Val Ser Ser His Ser Ser Gly Arg Ile Gly Ser His Ser Asn Arg Thr

500 505 510

Val Lys Ile Asp Arg Val His Gly Met Val Tyr Met Gly Ala Asn Val

515 520 525

Thr Ala Lys Ala Asn Ser Ser Val Lys Lys Val Val Val Asn Tyr Val

530 535 540

Tyr Thr Arg Lys Asn Thr Gly His Lys Ala Ala Ile Lys Asp Lys Val

545 550 555 560

Gly Ile Thr Tyr Ile

565

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgtcgctcc aggtcgagg 19

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctatatctcg tatgtgatcc cga 23

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aaaaggaagg tggctcctac 20

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tccctcggcc cgacctg 17