具体实施方式

本发明能够由分析色谱分析，特别是在薄层或HPLC(高效液相色谱或高压液相色谱)柱上，在正相、反相或其他情况下，通过制备液相色谱提出最佳可能的纯化折衷。

所述制备液相色谱可以从低压到高压实施，并且特别包括名称：快速色谱、MPLC(中压液相色谱)和HPLC。实施压力仅受所用色谱系统的限制，尤其是分离工具可以承受的压力。“低压”通常是指约几巴至几十巴的压力；“高压”通常是指几十巴至几百巴，或甚至更高的压力。

为此，本发明提出了一种由计算机实施的方法，所述方法指导用户从提供分析数据一直到定义所有可能实施制备液相色谱的条件。所有步骤可以自动执行，而无需提示用户输入数据或做出选择。

因此，该方法对于色谱领域的新手来说特别令人感兴趣。

但是，即使用户具有一定的色谱专业知识水平，所述方法就其可以减少确定操作条件所需的时间而言仍然是有利的；此外，所述方法可以包括由用户直接实施的步骤，这使所述用户能够与所使用的算法进行交互(专家模式)。

所述方法包括访问用户可用的分离工具的表。该表可以是数据库的形式，所述数据库列出用户库存中的所有工具，并且包括与所述工具的主要特征相对应的字段：工具的类型(例如：柱、筒)、工具的构成材料(塑料、不锈钢等)、尺寸(内径、宽度等)、固定相的性质、固定相的粒度、固定相的制造商或供应商等。在本文的其余部分，出于简洁的原因，将使用术语“柱”，但是对于所使用的分离工具的类型没有任何限制。以特别有利的方式，所述制备工具使得有可能实施不同的色谱技术，尤其是能够在不同压力下(从低压到高压)，以正相和/或反相实施的技术。

所述方法可以有利地在由申请人以商品名puriFlash^TM出售的色谱系统中实施，但是也可以在其他系统中实施。这些系统通常包括流动相罐、泵、进样器、分离工具、检测器、数据记录器和馏分收集器。这样的系统对于本领域技术人员是众所周知的，因此在本文中将不进行更详细地描述。

所述方法可以包括访问用户可用的色谱系统(或装置)表。所述方法考虑了用户根据产品开发阶段表达的需求，例如在达到的纯度方面，以提出最合适的色谱系统。系统的定义考虑了装置的滞留体积和必要的泵送功率。因此，所述方法使得可以根据待纯化产品和所需的纯度来选择最合适的色谱工具和系统。

控制单元包括处理器，所述处理器被配置为实施以下描述的一定数量的算法，或者与实施所述算法的远程计算机通信。任选地，在固体样品的情况下，系统还可以包括固体进样载体(通常称为干负载)；该载体布置在柱上游的流动相回路上。

图1的逻辑图说明了所述方法的总体架构。

下文依次描述不同的模态。

有趣的是，所有模态都是经过排序的，使得可以它们可以任选地全部由TLC分析数据实现，这些数据是用户库存中最通常可用的数据，而当TLC分析数据不可用或不令人满意时采用其他类型的分析数据。因此，当一种类型的分析数据无法为用户提供制备液相色谱方案时，将自动引导所述用户至能够最终提出分离液相色谱方案的另一种类型的分析数据。因此，即使他是色谱方面的新手，从提供分析数据到获得制备液相色谱方案，用户将完全被引导。

自然地，根据样品的性质(极性的或非极性的)和可用分析数据的性质，仅可以执行这些步骤中的一些，用户自由地从所述模态的任一种启动所述方法的实施。然而，系统被配置为能够处理以下详述的所有类型的分析数据。

在第一步骤中，通过界面提示用户选择分析液相色谱方法，所述方法被实施以获得待使用的分析数据。从以下方法中进行选择，所述方法通过界面建议给用户：

-薄层色谱法(TLC)，

-高效液相色谱法(HPLC)。

如果合适，所述选择还包括用于获得HPLC柱上数据的色谱模式。色谱模式通常选自：

-正相液相色谱法(NPLC)，

-反相液相色谱法(RPLC)，

-亲水作用色谱法(HILIC)：该技术对小极性分子的分离特别有利。

-疏水作用色谱法(HIC)：该技术对疏水性的氨基酸、多肽和蛋白质的分离特别有利。

在第二步骤中，通过界面将通过先前选择的方法获得的分析数据作为输入数据提供给处理器。如下面将详细描述的，这些数据可以由用户在表中手动输入，或者从存储有数据的便携式设备(例如，智能手机或平板电脑)中导入。

第一系列情况(P)涉及极性样品。

根据第一种可能(方框1)，用户在可用的TLC板上获得所考虑样品的分析数据。

TLC分析数据的处理一直是发明人最初开发的目的。

首先，回顾使用的量的定义：

-保留因数Rf是表征化合物在薄层色谱(TLC)板上洗脱的相对量。它是溶质的迁移距离与流动相迁移距离之间的比率。因此，完全洗脱的溶质的保留因数等于1。未被流动相携带的溶质的保留因数等于0。

-k是表征柱中溶质保留的热力学量，其等于(tr-t0)/t0或(Vr-V0)/V0，其中tr是溶质的保留时间，t0是流动相通过柱所需的时间，Vr是从柱中吸收溶质所需的流动相体积，V0是柱的孔体积。

对于同一个色谱系统，存在将保留因数Rf和k联系起来的基本关系：

k＝(1-Rf)/Rf

-Δk是独立于柱几何形状的相对量，其是在给定温度下由给定流动相在给定固定相上洗脱的给定溶质的特征。

-在制备液相色谱中，收集溶质所需的流动相体积是真正有用的量。此体积Vs，有时称为CV，以柱的滞留体积为单位表示，以考虑到不同的柱几何形状：

Vs＝CV＝Vr/V0＝1+k。

图2以示意图的方式示出了具有两个斑点的TLC板，两个斑点各对应于化合物a、b，化合物a、b中的一种是感兴趣的化合物，另一种是其最接近的临近物(neighbour)。d_s是样品的沉积线(由字母D表示)与溶剂前沿(由字母F表示)之间的距离。d_a是样品沉积线和对应于化合物a的斑点中心之间的距离，d_b是样品沉积线和对应于化合物b的斑点中心之间的距离。

Rf_a＝d_a/d_s

Rf_b＝d_b/d_s

Vs_a＝CV_a＝1/Rf_a＝1+k_a

Vs_b＝CV_b＝1/Rf_b＝1+k_b

因此：ΔCV＝CV_b-CV_a

k＝K_tr×(1/Rf-1)，其中K_tr＝常数＝1

Δk＝K_tr×[(1/Rf_b-1)–(1/Rf_a-1)]

因此：ΔCV＝Δk

本发明可以用TLC板实施，TLC板的感兴趣的化合物的保留因数Rf在0.01至1.0之间，感兴趣的化合物与其最接近的临近物(或其两个最邻近的临近物)之间的保留差Δk大于或等于0.20且ΔRf≥0.02。

可以考虑存在于TLC板上的一种到全部化合物，所述化合物能够在整个TLC板上铺展。因此，始终可以实现从薄层色谱到制备液相色谱的转置，这使得可以向用户提出纯化方案，而无需用户进行额外的操控。

该处理的独创性在于它考虑了振幅Δε°(也就是说，两种溶剂单独实施的洗脱力之间的差)和纯溶剂混合物的洗脱力随混合物的组成的非线性变化，ε°是溶剂的洗脱力。

计算定义了代表覆盖软件中输入的溶剂洗脱力的所有振幅的五个工作振幅。

另外，发明人已经根据化合物在TLC板上的绝对和相对位置定义了感兴趣的化合物的四个保留区域。

例如，对于配对的环己烷/乙酸乙酯(Δε°＝0.38)，定义了以下区域：

(0.01<Rf≤0.07)-(0.08≤Rf≤0.40)-(0.40<Rf≤0.9)-(0.9<Rf<1.0)

并且，对于这些区域中的每一个，已经定义了以下六个强溶剂条件，以逐步地模拟洗脱力的曲率(强溶剂是流动相中最易洗脱溶剂)：

(0<％强S≤4)-(5≤％强S≤8)-(9≤％强S≤13)-(14≤％强S≤20)-(21≤％强S≤53)-(54≤％强S<100)，

其中％强S为流动相中强溶剂的体积百分比。

对于这些保留区域中的每一个，关键对或三元组(也就是说，分辨最差的峰对或峰三元组)的Δk的计算使得可能在已知柱的孔体积V0时提出一定数量的梯度条件和等度条件，并作为柱粒度的函数(方框4)。

这导致总共1215种情况(对于这些情况中的115种，分离是不可能的)。

使洗脱梯度的形状适应每个ΔCV值，同时考虑了相同的因数ΔCV对应于在前述四个保留区域中的每个中不同的保留因数的差ΔRf的事实。

由这些元素，已构建了计算机算法，以对相对于四个区域的所有条件进行排序，并生成独特的制备液相色谱方案。该算法基于柱的尺寸集成了直接放大因数的计算，以根据待纯化样品量使用。所述因数是分析色谱和制备液相色谱中的材料量之间的放大因数。

用户指示作为补充输入数据的待纯化样品质量。

用户还可以从以溶液或固体沉积(干负荷)引入中选择待纯化产品的引入模式。

一种算法基于负载方程式计算色谱柱的几何形状与性质之间的最佳相关性，从而改善制备液相色谱的成本/生产率比。

由TLC中溶质的Rf和ΔRf计算初始条件和梯度形状。建议的不同梯度曲线是基于具有正相极性(正相模式)的HPLC中溶剂的二元混合物的洗脱力的曲线形状。

根据分离难度Δk和ΔRf排序六个柱的分类(方框6)。此分类是从柱的表中进行的，使得提案在用户的库存中至少包含三个柱。此分类考虑了柱的类型、固定相的类型以及感兴趣的化合物的分子量。

因此，根据目标应用和输入数据来调节从所有可用柱中建议的柱的显示。

有利地请用户来验证所选择的柱(方框7)。

存在输入分析数据的不同方法。

根据一个实施方案，用户手动将分析数据输入表中以完成(方框2)。数据输入通常包括：

-对于TLC：Rf、感兴趣的化合物、溶剂和待纯化质量；

-对于HPLC：化合物的保留时间、柱上游的滞留体积总和、柱的内径和其高度、固定相的粒度、分析柱的滞留体积、进样的流速和体积。

根据一个特别有利的实施方案，用户在其支配下具有智能便携式设备(例如智能手机或平板电脑)，所述设备配备有用于TLC分析数据的获取以及将所述数据传输到用于精心制作制备液相色谱方案的处理器的应用程序(方框3)。这样的应用程序具有使薄层色谱步骤及其处理更加快速且简单的优势。

所述应用程序具有以下功能：

(1)自动检测TLC板上的化合物：

由用户直接拍摄或从位于用户智能手机中的照片库下载的TLC板照片，算法区分(如果对比度允许)形状的轮廓，并在其中心放置一个点以指示存在化合物。如果算法不自动识别化合物，则用户可以手动识别化合物或进行更正。他还必须放置代表样品沉积线和溶剂前沿的两条线。

(2)识别感兴趣的化合物并计算保留因数(Rf)和ΔCV(＝Δk)

一旦识别所有化合物，用户便通过点击它们来指示感兴趣的化合物。对于每个感兴趣的化合物，显示保留因数Rf。如果用户愿意，通过按下专用按钮，他可以来查看他的化合物是否在合适的工作区域内。所述区域通常为0.1至0.4。

用户还可以通过点击专用于此目的的按钮来显示ΔCV(＝Δk)。这些是根据上下化合物的布置计算出来的。

应用程序以“MinΔCV”的形式传达最小的ΔCV(＝Δk)。由该数据，显示警告消息，向用户指示分离的难度级别。例如，手动模式可能包括三个难度级别:

-易，对应于大于4的“minΔCV”，

-标准，对应于1.5至4的“minΔCV”，

-难，对应于小于1.5的“minΔCV”。

(3)输入溶剂和待纯化样品的量：

请用户输入待纯化样品量，并选择已使用的溶剂(最多两种)及其各自的百分数比例。对于每种溶剂，如果他愿意，用户可以指示是否存在添加物，并添加关于它们的注释，或者以更一般的方式在下面的屏幕上添加关于它们的注释。

然后显示一个汇总他的数据的屏幕。

(4)将该信息直接安全传输到色谱系统：

可以将上述数据保存在用户的个人数据库中，通过电子邮件发送给用户，或者通过蓝牙或Wi-Fi将其信息发送到制备液相色谱系统。

(5)使应用程序与制备液相色谱系统配对：

所述应用程序包括参数化模块，所述参数化模块可通过文件传输协议(FTP)通过Wi-Fi将色谱系统与所述应用程序配对，分析数据的档案将在其中存档和阅读。这个参数化模块也可以使用户能够输入他的电子邮件地址来接收文件。

(6)所述数据的归档和重复发送：

应用程序有利地包括归档模块，在归档模块中，用户如果愿意的话可以归档他的数据。在这种情况下，数据将仅能从他的智能手机查询。如果需要，用户可以再次和按其意愿多次将TLC板的分析数据发送到色谱系统。

以有利的方式，发送是通过.json文件完成的，该文件包含板的照片、已归于其的名称、感兴趣的化合物的Rf、一般的在板上的注释、待纯化产品量的指示、溶剂名称、它们的％比例，添加物的提及以及对溶剂的可能注释(如果适用)。所有这些数据均通过以下所述的处理算法读取，以精心制作制备液相色谱方案的建议。

然而，可能会发生TLC分离不令人满意的情况，这是例如由于感兴趣的峰的位置，由于待进行纯化的溶剂的性质或量大于用户的库存，由于库存中没有合适的柱的事实等。

在这种情况下，处理器启动算法，所述算法通过改变分析条件(尤其是所用的强溶剂或溶剂对)，可以在等度洗脱时获得不同于初始分离的分离(方框5)。这使得有可能确定在最佳保留区域中具有最佳潜力的实验条件以获得有效的纯化。为此目的，所述算法基于吸附色谱法原理，R.L.Snyder,ed.M.Dekker(1968)中描述的通用图。

所述算法计算特定于上述五个工作幅度中的每一个的强溶剂百分比的极限值。

然后，提出了制备液相色谱条件(前面所述的方框6)。

在没有分析TLC数据的情况下，但如果分析色谱图可用(方框9)，则使用另一个模块，如下所述。

在通过HPLC得到的色谱图的情况下，两个峰之间的分离度由以下关系来定义：

Rs＝2x(t_R2-t_R1)/(ω₂-ω₁)，

其中t_R是峰的保留时间，ω是峰底宽度。

结论是，Rs越大，两个峰之间的分离越好。

在第一种情况下(方框10)，分析固定相与柱的列表至少一个柱的分析固定相相同。从输入的分析柱中，算法识别柱的列表中的一个或多个柱，其相对于固定相的材料、其商品名称和其接枝的字段被保持。输入待纯化样品的量。

另一种算法(方框11)选择在压力方面与系统兼容的柱，同时考虑了固定相的性质、颗粒的尺寸、溶剂的性质和柱的材料。

算法根据柱的内径和长度以及所用固定相颗粒的孔体积百分比计算出放大比。

将待纯化的原始样品质量除以所述放大比，以计算要进行的进样次数。

最后，算法执行从分析柱的梯度方法向制备液相色谱柱的梯度方法的转置。这种转置基于柱尺寸的直接比率、梯度斜率的重新计算、其步长和其时间以及所用颗粒的孔体积百分比。它还考虑了柱的滞留体积V0和设备的延迟体积。因此，它预测压力的演变和溶剂的消耗。输入表格用以计算保留时间的化合物的分析保留时间类似地转换为制备液相色谱柱上的预测保留时间。

在用户没有固定相与分析评估的固定相相同的柱的情况下(方框12)，算法在柱的列表中识别相对于固定相性质的字段是否对应于(a)未处理的二氧化硅、(b)C18以外接枝二氧化硅或(c)C18接枝二氧化硅。

在情况(a)和(b)(二氧化硅或C18以外接枝二氧化硅)中，所述算法识别相对于固定相和柱的列表中的接枝类型的字段是否可以关联；肯定地，所述算法提出了直接转移。

在情况(c)中(C18接枝二氧化硅，其可能因所进行的接枝而在选择性上有很大差异)，已经预先构建了表，称为“Atom表”，其汇总了不同制作和制造商的基于C18接枝二氧化硅的数百个柱的实验数据。所述算法根据极值对实验值进行归一化。对于每个分析柱和每个资格标准，计算了相对于所有其他柱的欧几里得距离。归一化后，每个标准的每个距离相加在一起，成为该柱相对于所有其他柱的参比值。标准之一在于定义相对于疏水性的统一参数。

所述算法在所述Atom表中搜索固定相的字段、与输入的分析柱相同的接枝构造和类型(方框13)。

如果识别出，则所述算法计算Atom表中所有固定相的选择性的邻近度(欧几里得距离)。它通过递增次序对响应进行分类，并且仅保留接近度值小于0.17的候选。

所述算法将其结果与Atom表进行比较，并基于进样次数及其在柱列表中的存在，根据标准仅保留六个候选，这转化为它们在用户实际库存中的事实。

以下步骤是对于方框11描述的步骤。

在用户没有任何合适的柱的情况下(方框14)，则通知他必须购买合适的柱的事实。根据所购买的柱，以下步骤是对于方框11描述的步骤。

如果未找到直接正相的方案(方框15)，则进行正相筛选(方框16)。这样的筛选在于研究在来自HPLC柱或快速色谱柱的分析柱中正相中不同选择性的分离。

在该筛选结束时，算法选择具有最佳纯化势的柱(方框17)。算法可以任选地提出洗脱条件，从而有可能获得不同的分离。

然后，算法依靠所选柱的分离的分析色谱图(方框18)。

在第一种情况下(方框19)，分析固定相与柱的列表中至少一个柱的固定相相同。由输入的分析柱，算法识别柱的列表中的一个或多个柱，其相对于固定相的材料、其构造和接枝的字段被保持。输入待纯化样品的量。

另一种算法(方框20)选择在压力方面与系统兼容的柱，考虑了固定相的性质、颗粒的尺寸、溶剂的性质和柱的材料。

算法根据柱的内径和长度以及所用固定相颗粒的孔体积百分比计算出放大比。

将待纯化的原始样品质量除以所述放大比，以计算要进行的进样次数。

最后，算法执行从分析柱的梯度方法向制备液相色谱柱的梯度方法的转置。这种转置基于柱尺寸的直接比率、梯度斜率的重新计算、其步长和其时间以及所用颗粒的孔体积百分比。它还考虑了柱的滞留体积V0。因此，它预测压力的演变和溶剂的消耗。输入表格用以计算保留时间的化合物的分析保留时间以相同的方式转换为制备液相色谱柱上的预测保留时间。

在用户没有固定相与分析评估的固定相相同的柱的情况下(方框21)，算法在柱的列表中识别相对于固定相性质的字段是否对应于(a)未处理的二氧化硅、(b)C18以外接枝二氧化硅或(c)C18接枝二氧化硅(方框22)。

在情况(a)和(b)(二氧化硅或C18以外接枝二氧化硅)中，所述算法识别相对于固定相和柱的列表中的接枝类型的字段是否可以关联；肯定地，所述算法提出了直接转移(方框20)。

在情况(c)中(C18接枝二氧化硅，其可能因所进行的接枝而在功能上有很大差异)，已经预先构建了表，称为“Atom表”，其汇总了不同的制作和制造商的数百种基于C18接枝二氧化硅的柱的实验数据。所述算法根据极值对实验值进行归一化。对于每个分析柱和每个资格标准，计算了相对于所有其他柱的欧几里得距离。归一化后，每个标准的每个距离相加在一起，成为该柱相对于其他所有柱的参比值。标准之一在于定义相对于疏水性的统一参数。

所述算法在所述Atom表中搜索固定相的字段、与输入的分析柱相同的接枝构造和类型(方框13)。

如果识别出，则所述算法计算Atom表中所有固定相的选择性的邻近度(欧几里得距离)。它通过递增次序对响应进行分类，并且仅保留接近度值小于0.17的候选。

所述算法将其结果与Atom表进行比较，并基于进样次数及其在柱列表中的存在，根据标准仅保留六个候选，其中至少三个柱在用户实际库存中。

以下步骤是对于方框20描述的步骤。

在用户没有任何合适的柱的情况下(方框23)，则通知他必须购买合适的柱的事实。根据所购买的柱，以下步骤是对于方框20描述的步骤。

如果在正相筛选后未发现方案，但存在反相方案(方框24)，则进入涉及非极性或中等极性(NP/MP)样品的第二系列情况。

根据第一种可能，可得分离的分析色谱图(方框25)。

根据方框26-30的方法的实施与以上参考方框10-14描述的实施类似，因此不再描述。

在没有可用的反相方案的情况下(方框31)，所述系统建议实施对来自HPLC或快速色谱系统的反相中不同选择性的分离的研究(框32)。

算法可以分两步从热力学参数p和q已知的一组柱中确定具有最令人感兴趣的分离势的柱(方框33)。第一步骤是确定流动相条件，对于所述条件，从待纯化混合物中洗脱出的化合物的最后一种的保留因数约为10，并使得可能重新计算等度洗脱条件，以便每个其他柱达到此相同的目的。第二步骤是在等度洗脱下将样品进样至每个柱中，然后通过比较色谱图，选择最相关的柱。

根据第一种可能，可得分离的分析色谱图(方框34)。

根据方框35-39的方法的实施与以上参考方框10-14和26-30描述的实施类似，因此不再描述。

在所有情况下，一旦选定的柱已放置在色谱系统中的适当位置，处理器便根据计算的操作模式启动色谱的实施(方框8)。

以一种特别有利的方式，可以通过以下描述的算法来加速制备液相色谱法。

这种加速的可能性，一方面，使用户满足更迅速地终止纯化的需求，以便能够处理已成为优先事项的另一任务，和/或另一方面，减少分析时间，同时估计流速增加不会显著影响关键对的分离度。

为此，算法评估正在进行的纯化的最大可接受流速和压力因数(尤其考虑相关色谱系统的极限压力、柱的极限压力以及潜在的干负载压力)，作为TLC分析数据的分离难度Δk和HPLC分析数据的Rs的函数(方框40)。算法实时自动调节梯度法至新条件。用户可以选择在纯化的任何时刻触发加速。此操作是可逆的，并在完全安全的情况下进行，而没有任何产品损失。

参考文献

US 7,686,959