阅读说明：本技术 鲜地黄中艾里莫酚烷型地黄倍半萜a和地黄倍半萜b的制备方法及其应用 (Preparation method and application of eremophilane-type rehmannia sesquiterpene A and rehmannia sesquiterpene B in fresh rehmannia ) 是由 刘晏灵 冯卫生 曹彦刚 阚玉璇 任英杰 王梦娜 郑晓珂 于 2020-11-28 设计创作，主要内容包括：本发明涉及鲜地黄中艾里莫酚烷型地黄倍半萜A和地黄倍半萜B的制备方法及其应用,可有效解决快速从鲜地黄中制备两个具有肾细胞保护活性的艾里莫酚烷型倍半萜类化合物和制备治疗肾细胞保护药物中的应用问题,技术方案是,将鲜地黄切碎,用丙酮组织破碎提取,制备粗提取物,硅胶柱色谱初步分离,将二氯甲烷-甲醇体积比为100:1洗脱流份经硅胶柱色谱进一步分离,得地黄倍半萜A；将二氯甲烷-甲醇体积比为50:1洗脱流份经MCI gel CHP-20柱色谱进一步分离,得地黄倍半萜B。本发明新颖独特,稳定可靠,分离效率高、时间短,溶剂消耗量小,样品回收率高,得到的目标成分纯度高,有效用于制备治疗各种原因引起的肾损伤的药物,开拓了鲜地黄的药用价值和商业价值。(The invention relates to a preparation method and application of an eremophilane-type rehmannia sesquiterpene A and an eremophilane-type rehmannia sesquiterpene B in fresh rehmannia, which can effectively solve the application problems of rapidly preparing two eremophilane-type sesquiterpene compounds with renal cell protection activity from fresh rehmannia and preparing drugs for treating renal cell protection, and has the technical scheme that fresh rehmannia is cut up, is subjected to tissue disruption and extraction by acetone to prepare a crude extract, is subjected to preliminary separation by silica gel column chromatography, and is eluted fractions with the volume ratio of dichloromethane to methanol of 100:1 are further separated by silica gel column chromatography to obtain the rehmannia sesquiterpene A; and (3) further separating the eluted fractions with the volume ratio of dichloromethane to methanol of 50:1 by MCI gel CHP-20 column chromatography to obtain the rehmannia sesquiterpene B. The method is novel, unique, stable and reliable, has high separation efficiency, short time, small solvent consumption and high sample recovery rate, obtains high-purity target components, is effectively used for preparing the medicine for treating the renal injury caused by various reasons, and develops the medicinal value and the commercial value of the fresh rehmannia.)

鲜地黄中艾里莫酚烷型地黄倍半萜A和地黄倍半萜B的制备方 法及其应用

技术领域

本发明涉及医药，特别是一种鲜地黄中艾里莫酚烷型地黄倍半萜A和地黄倍半萜B的制备方法及其应用。

背景技术

脓毒症是一种常见的致命性疾病，能导致宿主无法反应性控制入侵机体的微生物及其产物的活动性感染，而引起全身炎性反应综合征，进一步发展成脓毒性休克、多器官功能障碍综合征(MODS)。肾脏作为MODS最常受累器官之一，急性肾损伤(AKI)是脓毒症最常见的并发症之一。据相关研究报道约50％的脓毒症患者会合并AKI，70％患者的死亡与AKI相关。由于脓毒症所致AKI的发生机制复杂，各种机制之间相互交错，保护和受损作用可能重叠，因此迄今并没有针对脓毒症所致AKI的特效治疗药物，针对上述机制的相关药物尚处于研究阶段，包括TLR拮抗剂、重组碱性磷酸酶、间充质干细胞等。

中草药在细胞保护方面的应用历史悠久，从中草药中寻找具有肾细胞保护的活性物质，研制特异性强、毒副作用小的新型药物具有重要的社会效益和经济效益。

地黄是玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch新鲜或干燥块根，最早出现于魏吴普《神农本草经》。根据其功能主治，地黄入药有鲜，生，熟之分。清代汪昂《本草备要》将干地黄、生地黄、熟地黄明确单列介绍，并指出：“生则寒，干则凉，熟则温。故分为三条，以便施用。”化学成分研究表明鲜地黄主要包括环烯醚萜苷类，紫罗兰酮类和苯乙醇类化合物，并具有多样的生物活性，如抗肿瘤，降血糖以及抗炎等活性。那么如何将鲜地黄中两个痕量的艾里莫酚烷型地黄倍半萜A和地黄倍半萜B快速制备出来，并用于制备治疗肾损伤药物，至今未见有公开报导。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术缺陷，本发明之目的就是提供一种鲜地黄中艾里莫酚烷型地黄倍半萜A和地黄倍半萜B的制备方法及其应用，可有效解决快速从鲜地黄中制备两个具有肾细胞保护活性的艾里莫酚烷型倍半萜类化合物和制备治疗肾细胞保护药物中的应用问题。

本发明解决的技术方案是，一种鲜地黄中艾里莫酚烷型地黄倍半萜A和地黄倍半萜B的制备方法，所述的倍半萜类化合物地黄倍半萜A和地黄倍半萜B分子结构式(化学结构式)为：

制备方法包括以下步骤：

(1)、制备粗提取物，方法是，将鲜地黄切碎，每次用鲜地黄重量6-9倍量的体积浓度为70％的丙酮组织破碎提取3次，每次1-3min，合并丙酮提取液，减压浓缩，得浓缩物，加浓缩物重量体积3-5倍量的蒸馏水混悬，依次加入与混悬液等体积的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯，减压回收溶剂，得乙酸乙酯萃取部位的鲜地黄粗提取物浸膏；所述的重量体积是指固体物以g计，液体物以mL计，以下同(注：如加浓缩物重量体积3-5倍量的蒸馏水混悬，是指浓缩物为1g时，蒸馏水为3-5mL)；

(2)、硅胶柱色谱初步分离：乙酸乙酯萃取部位的鲜地黄粗提取物浸膏经硅胶柱色谱初步分离，用体积比为100:1、90:1、80:1、70:1、60:1、50:1、30:1、15:1、5:1的二氯甲烷-甲醇系统进行梯度洗脱，每个洗脱部位用量为柱体积的8倍，流速为15mL/min，每200mL为1个流份，分别收集二氯甲烷-甲醇体积比为100:1、50:1洗脱流份；

(3)、地黄倍半萜A的制备：将二氯甲烷-甲醇体积比为100:1洗脱流份经硅胶柱色谱进一步分离，用体积比为80:1、50:1、40:1、30:1、20:1、10:1的石油醚-乙酸乙酯系统进行梯度洗脱，每个梯度用量为柱体积的8倍，流速为6mL/min，每20mL为1个流份，收集石油醚-乙酸乙酯体积比为20:1洗脱流份；石油醚-乙酸乙酯体积比为20:1洗脱流份采用半制备液相进行纯化，用体积比为32:68的甲醇-水进行洗脱10min，流速为2mL/min，得地黄倍半萜A；

(4)、地黄倍半萜B的制备：将二氯甲烷-甲醇体积比为50:1洗脱流份经MCI gelCHP-20柱色谱进一步分离，用体积比为0:100、10:90、20:80、30:70、50:50、70:30、90:10、100:0的甲醇-水系统进行梯度洗脱，每个梯度用量为柱体积的8倍，流速为10mL/min，每200mL为1个流份，收集甲醇-水体积比为20:80洗脱流份，甲醇-水体积比为20:80洗脱流份采用半制备液相进行纯化，用体积比为23:77的甲醇-水进行洗脱10min，流速为2mL/min，得地黄倍半萜B。

本发明方法制备的地黄倍半萜A、地黄倍半萜B具有抑制肾小管上皮细胞NRK 52e凋亡的保护作用，实现地黄倍半萜A、地黄倍半萜B在制备治疗各种原因引起的肾损伤的药物中的应用。

本发明新颖独特，稳定可靠，采用硅胶柱色谱法富集目标成分，再用硅胶、ODS等柱色谱法结合制备液相分离纯化，可快速从鲜地黄中分离得到两个艾里莫酚烷型地黄倍半萜A和地黄倍半萜B，分离效率高、时间短，溶剂消耗量小，样品回收率高，得到的目标成分纯度高，对脂多糖诱导的肾小管上皮细胞NRK 52e凋亡具有一定的保护作用，有效用于制备治疗各种原因引起的肾损伤的药物，开拓了鲜地黄的药用价值和商业价值，经济和社会效益显著。

附图说明

图1为本发明化合物地黄倍半萜A、地黄倍半萜B的分子结构图。

具体实施方式

以下结合具体情况和实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。

本发明在具体实施中，可由以下实施例给出。

实施例1

本发明在具体实施中，一种鲜地黄中艾里莫酚烷型地黄倍半萜A和地黄倍半萜B的制备方法，包括以下步骤：

(1)、制备粗提取物，方法是，将鲜地黄20kg切碎，每次用鲜地黄重量7倍量的体积浓度为70％的丙酮组织破碎提取3次，每次2min，合并丙酮提取液，减压浓缩，得浓缩物，加浓缩物重量体积4倍量的蒸馏水混悬，依次加入与混悬液等体积的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯，减压回收溶剂，得乙酸乙酯萃取部位的鲜地黄粗提取物浸膏；

(2)、硅胶柱色谱初步分离：乙酸乙酯萃取部位的鲜地黄粗提取物浸膏20.3g，用过100-200筛的硅胶20g拌样，上含有过100-200筛的硅胶200g的硅胶柱，硅胶柱色谱初步分离，用体积比为100:1、90:1、80:1、70:1、60:1、50:1、30:1、15:1、5:1的二氯甲烷-甲醇系统进行梯度洗脱，每个洗脱部位用量为柱体积的8倍，流速为15mL/min，每200mL为1个流份，分别收集二氯甲烷-甲醇体积比为100:1、50:1洗脱流份；

(3)、地黄倍半萜A的制备：将二氯甲烷-甲醇体积比为100:1洗脱流份经硅胶柱色谱进一步分离，用体积比为80:1、50:1、40:1、30:1、20:1、10:1的石油醚-乙酸乙酯系统进行梯度洗脱，每个梯度用量为柱体积的8倍，流速为6mL/min，每20mL为1个流份，收集石油醚-乙酸乙酯体积比为20:1洗脱流份；石油醚-乙酸乙酯体积比为20:1洗脱流份采用半制备液相进行纯化，用体积比为32:68的甲醇-水进行洗脱10min，流速为2mL/min，得地黄倍半萜A(化合物1)；

(4)、地黄倍半萜B的制备：将二氯甲烷-甲醇体积比为50:1洗脱流份经MCI gelCHP-20柱色谱进一步分离，用体积比为0:100、10:90、20:80、30:70、50:50、70:30、90:10、100:0的甲醇-水系统进行梯度洗脱，每个梯度用量为柱体积的8倍，流速为10mL/min，每200mL为1个流份，收集甲醇-水体积比为20:80洗脱流份，甲醇-水体积比为20:80洗脱流份采用半制备液相进行纯化，用体积比为23:77的甲醇-水进行洗脱10min，流速为2mL/min，得地黄倍半萜B(化合物2)。

化合物结构鉴定：

上述两个化合物，经过核磁共振光谱(¹H-NMR、¹³C-NMR、HSQC、HMBC、¹H-¹H COSY、NOESY)及高分辨质谱(HR-ESI-MS)光谱技术鉴定了其化学结构：

化合物1，黄色油状，易溶于甲醇。(c 0.04,MeOH),经HR ESI MS测定得到其准分子离子峰[M-H]^-m/z：265.1457(C₁₅H₂₁O₄计算值为265.1435)。

¹H NMR(500MHz,CD₃OD)中，低场区有两个双键上的氢信号δ6.78(1H,t,J＝4.0Hz,H-8),6.28(1H,s,H-2)；两个连氧亚甲基的氢信号δ3.68(2H,m,H-10)和3.65(2H,m,H-11)，三个不连氧亚甲基的氢信号δ2.80(1H,d,J＝17.6Hz,H_a-4),2.26(2H,m,H-7),2.23(1H,m,H_b-4),1.52(2H,m,H-6),一个次甲基的氢信号δ1.70(1H,m,H-5)，以及两个甲基氢信号δ1.01(3H,s,CH₃-12),0.98(3H,s,CH₃-13)。

¹³C NMR(125MHz,CD₃OD)中共出现15个碳信号，提示该化合物可能为一个倍半萜类化合物，δ190.9(C-1)为羰基碳信号，δ166.7(C-3),142.9(C-8a),137.0(C-8),125.7(C-2)为双键碳信号，δ79.2(C-9)，66.0(C-10)和65.6(C-11)为连氧碳信号，δ_C 19.8(C-13),15.8(C-12)。通过分析¹H-¹H COSY谱发现分子结构中存在2个自旋体系，分别为S1：C-2(δ125.7)/C-3(δ166.7)/C-4(δ40.9)；S2：C-5(δ40.1)/C-6(δ27.3)/C-7(δ27.1)/C-8(δ137.0)。

HMBC谱中，H-5(δ1.70)与C-3和C-4a有远程相关，H-4(δ2.80和2.23)与C-3，C-4a和C-13有远程相关，确定S1的C-4和S2的C-5连在C-4a上；由H-2(δ6.28)与C-4，C-8a和C-9有远程相关，H-8(δ6.78)与C-1有远程相关，提示S1的C-2，S2的C-8通过C-1，C-8a连接成环；H-10(δ3.68)与C-3，C-9和C-11有远程相关，提示C-10，C-11，和S1的C-2连在C-9。以上分析可知，该化合物为艾里莫酚烷型倍半萜衍生物。

NOE谱中，H-12与H-13有NOE关系，说明处于同一侧。其绝对构型通过ECD法可以确定手性碳C-4a与C-5的绝对构型为(4aR,5S)。综合以上分析，可得出化合物的结构，为(4aR,5S)-4a，5-二甲基-3-(1,2,3-三羟基丙烷-2-基)-4a,5,6,7-四氢萘-1(4H)，文献检索发现为一新化合物，命名为地黄倍半萜A(remophilanetriol A)。

化合物2，黄色油状，易溶于甲醇。(c 0.0.026,CH₃OH)，经HR ESI MS测定得到准分子离子峰[M+H]⁺m/z：285.1696(C₁₅H₂₅O₆计算值为285.1684)。

¹H NMR(500MHz,CD₃OD)中，δ6.28(1H,s,H-2)为双键上的氢信号；δ3.67(2H,m,H-10),3.64(2H,m,H-11)和3.60(1H,m,H-7)为连氧碳上的氢信号；在δ0.93(3H,s,CH₃-12),0.74(3H,s,CH₃-13)处显示2个甲基氢信号。

¹³C NMR(125MHz,CD₃OD)中共出现15个碳信号，提示该化合物可能为一个倍半萜类化合物，δ202.9(C-1)为羰基碳信号，δ165.4(C-3)和125.6(C-2)为双键碳信号，δ78.9(C-9)，70.5(C-7),66.3(C-10)和65.8(C-11)为连氧碳信号。该化合物与1的核磁共振数据非常相似，提示二者具有相同的骨架类型，区别在于连在C-8,C-8a位的双键被饱和，以及C-7处有羟基取代。分析¹H-¹H COSY谱，发现结构含有C-2(δ125.6)/C-3(δ165.4)/C-4(δ41.4),C-5(δ42.4)/C-6(δ40.2)/C-7(δ70.5)/C-8(δ30.9)/C-8a(δ54.1)结构片段。在NOESY图谱中，H-7/H-5/H-8a有偶合，说明在环的同一侧。其绝对构型通过ECD法可得知手性碳的构型为(4aR,5S,7R,8aR)。综合以上分析，可以得出化合物的结构，为(4aR,5S,7R,8aR)-7-羟基-4a,5-二甲基-3-(1,2,3-三羟基丙烷-2-基)-4a,5,6,7,8,8a-六氢萘-1(4H)，经文献检索发现为一新化合物，命名为地黄倍半萜B(remophilanetriol B)。

表1化合物1和2的核磁数据

a NMR spectroscopic data were recorded in CD₃OD at 500MHz(¹H NMR)and125MHz(¹³CNMR)

上述两个化合物均属于鲜地黄中两个具有肾细胞保护活性的两个艾里莫酚烷型地黄倍半萜A和地黄倍半萜B。

实施例2

本发明一种鲜地黄中艾里莫酚烷型地黄倍半萜A和地黄倍半萜B的制备方法，包括以下步骤：

(1)、制备粗提取物，方法是，将鲜地黄30.91kg切碎，每次用鲜地黄重量6倍量的体积浓度为70％的丙酮组织破碎提取3次，每次3min，合并丙酮提取液，减压浓缩，得浓缩物，加浓缩物重量体积3倍量的蒸馏水混悬，依次加入与混悬液等体积的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯，减压回收溶剂，得乙酸乙酯萃取部位的鲜地黄粗提取物浸膏；

(2)、硅胶柱色谱初步分离：乙酸乙酯萃取部位的鲜地黄粗提取物浸膏30.16g，用过100-200筛的硅胶30g拌样，上含有过100-200筛的硅胶300g的硅胶柱，经硅胶柱色谱初步分离，用体积比为100:1、90:1、80:1、70:1、60:1、50:1、30:1、15:1、5:1的二氯甲烷-甲醇系统进行梯度洗脱，每个洗脱部位用量为柱体积的8倍，流速为15mL/min，每200mL为1个流份，分别收集二氯甲烷-甲醇体积比为100:1、50:1洗脱流份；

(3)、地黄倍半萜A的制备：将二氯甲烷-甲醇体积比为100:1洗脱流份经硅胶柱色谱进一步分离，用体积比为80:1、50:1、40:1、30:1、20:1、10:1的石油醚-乙酸乙酯系统进行梯度洗脱，每个梯度用量为柱体积的8倍，流速为6mL/min，每20mL为1个流份，收集石油醚-乙酸乙酯体积比为20:1洗脱流份；石油醚-乙酸乙酯体积比为20:1洗脱流份采用半制备液相进行纯化，用体积比为32:68的甲醇-水进行洗脱10min，流速为2mL/min，得地黄倍半萜A；

(4)、地黄倍半萜B的制备：将二氯甲烷-甲醇体积比为50:1洗脱流份经MCI gelCHP-20柱色谱进一步分离，用体积比为0:100、10:90、20:80、30:70、50:50、70:30、90:10、100:0的甲醇-水系统进行梯度洗脱，每个梯度用量为柱体积的8倍，流速为10mL/min，每200mL为1个流份，收集甲醇-水体积比为20:80洗脱流份，甲醇-水体积比为20:80洗脱流份采用半制备液相进行纯化，用体积比为23:77的甲醇-水进行洗脱10min，流速为2mL/min，得地黄倍半萜B。

上述两种化合物经过核磁共振(¹H-NMR、¹³C-NMR、HSQC、HMBC、¹H-¹H COSY、NOESY)及高分辨率质谱(HR-ESI-MS)等光谱学技术进行鉴定(鉴定过程同实施例1中的化合物的结构鉴定)，其分别为属于鲜地黄中两个具有肾细胞保护活性的两个鲜地黄中艾里莫酚烷型倍半萜类化合物地黄倍半萜A和地黄倍半萜B。

实施例3

本发明一种鲜地黄中艾里莫酚烷型地黄倍半萜A和地黄倍半萜B的制备方法，包括以下步骤：

(1)、制备粗提取物，方法是，将鲜地黄26.65kg切碎，每次用鲜地黄重量9倍量的体积浓度为70％的丙酮组织破碎提取3次，每次1min，合并丙酮提取液，减压浓缩，得浓缩物，加浓缩物重量体积5倍量的蒸馏水混悬，依次加入与混悬液等体积的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯，减压回收溶剂，得乙酸乙酯萃取部位的鲜地黄粗提取物浸膏；

(2)、硅胶柱色谱初步分离：乙酸乙酯萃取部位的鲜地黄粗提取物浸膏25.86g，用过100-200筛的硅胶26拌样，上含有过100-200筛的硅胶260g的硅胶柱，经硅胶柱色谱初步分离，用体积比为100:1、90:1、80:1、70:1、60:1、50:1、30:1、15:1、5:1的二氯甲烷-甲醇系统进行梯度洗脱，每个洗脱部位用量为柱体积的8倍，流速为15mL/min，每200mL为1个流份，分别收集二氯甲烷-甲醇体积比为100:1、50:1洗脱流份；

(3)、地黄倍半萜A的制备：将二氯甲烷-甲醇体积比为100:1洗脱流份经硅胶柱色谱进一步分离，用体积比为80:1、50:1、40:1、30:1、20:1、10:1的石油醚-乙酸乙酯系统进行梯度洗脱，每个梯度用量为柱体积的8倍，流速为6mL/min，每20mL为1个流份，收集石油醚-乙酸乙酯体积比为20:1洗脱流份；石油醚-乙酸乙酯体积比为20:1洗脱流份采用半制备液相进行纯化，用体积比为32:68的甲醇-水进行洗脱10min，流速为2mL/min，得地黄倍半萜A；

(4)、地黄倍半萜B的制备：将二氯甲烷-甲醇体积比为50:1洗脱流份经MCI gelCHP-20柱色谱进一步分离，用体积比为0:100、10:90、20:80、30:70、50:50、70:30、90:10、100:0的甲醇-水系统进行梯度洗脱，每个梯度用量为柱体积的8倍，流速为10mL/min，每200mL为1个流份，收集甲醇-水体积比为20:80洗脱流份，甲醇-水体积比为20:80洗脱流份采用半制备液相进行纯化，用体积比为23:77的甲醇-水进行洗脱10min，流速为2mL/min，得地黄倍半萜B。

上述两种化合物经过核磁共振(¹H-NMR、¹³C-NMR、HSQC、HMBC、¹H-¹H COSY、NOESY)及高分辨率质谱(HR-ESI-MS)等光谱学技术进行鉴定(鉴定过程同实施例1中的化合物的结构鉴定)，其分别为属于鲜地黄中两个具有肾细胞保护活性的两个鲜地黄中艾里莫酚烷型倍半萜类化合物地黄倍半萜A和地黄倍半萜B。

本发明方法稳定可靠，其提取分离的地黄倍半萜A和地黄倍半萜B经试验，可有效抑制脂多糖(LPS)诱导的大鼠肾小管上皮细胞(NRK 52e)的凋亡，可有效用于制备治疗各种原因引起的肾损伤的药物，并经实验得到了充分证明，有关实验资料如下：

1.大鼠肾小管上皮细胞NRK 52e培养

NRK 52e细胞培养于37℃、含5％CO2的培养箱中培养，培养基为DMEM高糖培养基(含10％胎牛血清，100U·mL^-1青霉素和100μg·mL^-1链霉素)，两天换液一次。当细胞生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面时，用0.25％胰蛋白酶消化，传代。

2.MTT法检测化合物对脂多糖诱导的大鼠肾小管上皮细胞的保护作用

以培养基将细胞分散，使成为密度为2×10³cell·mL^-1的单细胞悬液，并以每孔0.2mL接种于96孔板中，培养24h后，将细胞分为模型组和不同给药组，正常组加入等量溶剂，模型组加入浓度为1mg·mL^-1的LPS溶液(终浓度为1μg·mL^-1)，不同给药组加入浓度为10μM的待测化合物和浓度为1μg·mL^-1的脂多糖。培养24h后每孔加入MTT溶液(5mg·mL^-1)20μl，37℃继续培养4小时，小心吸净培养液，每孔加入150μl DMSO，震荡10分钟，使结晶物完全溶解。以DMSO调零，用酶标仪在490nm下测定各孔的吸光度值(A)。

3.实验结果

通过MTT法检测地黄倍半萜A和地黄倍半萜B对LPS诱导的NRK 52e细胞凋亡的影响，经反复试验(10次以上)均取得了相同或相近似的结果。实验表明，本发明制备出的地黄倍半萜A和地黄倍半萜B可以有效抑制LPS诱导的NRK 52e细胞凋亡，可用于制备治疗各种原因引起的肾损伤的药物，也是治疗各种原因引起的肾损伤的药物上的创新，开辟了鲜地黄的药用新途径和商业价值，有显著的经济和社会效益。