一种小金胶囊或小金丸或小金片质量的指纹图谱检测方法
阅读说明：本技术 一种小金胶囊或小金丸或小金片质量的指纹图谱检测方法 (Fingerprint spectrum detection method for quality of Xiaojin capsules, Xiaojin pills or Xiaojin tablets ) 是由 梁鑫淼 蒋慧 金高娃 刘艳芳 徐青 向阳 于 2019-08-27 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种小金胶囊/丸/片的HPLC指纹图谱检测方法及其标准指纹图谱,其中所述测定方法,包括以下步骤：(1)供试品溶液的制备：取小金胶囊/丸/片,采用有机溶剂进行提取,提取液用微孔滤膜过滤,即得供试品溶液；(2)对照品溶液制备：分别配制、11羰基-β-乙酰乳香酸对照品溶液；(3)测定方法：采用高效液相色谱进行测定；(4)标准指纹谱的建立,通过与单味药材进行比对,对小金胶囊/丸/片标准指纹图谱进行单味药材饮片来源归属,以验证所得到的标准指纹图谱。通过对比待检样品指纹图谱与标准指纹图谱的相似程度,有利于各企业更好地控制投料及跟踪产品质量,也有利于质检部门监控小金胶囊/丸/片的质量。(The invention relates to an HPLC fingerprint detection method and a standard fingerprint of a Xiaojin capsule/pill/tablet, wherein the detection method comprises the following steps: (1) preparation of a test solution: extracting XIAOJIN Capsule/pill/tablet with organic solvent, and filtering the extractive solution with microporous membrane to obtain test solution; (2) preparation of a reference solution: respectively preparing 11 carbonyl-beta-acetyl boswellic acid reference substance solutions; (3) the determination method comprises the following steps: measuring by high performance liquid chromatography; (4) establishing standard fingerprint spectrum, comparing with single medicinal material, and performing single medicinal material decoction piece source attribution on to Xiaojin capsule/pill/tablet standard fingerprint spectrum to verify the obtained standard fingerprint spectrum. By comparing the similarity degree of the fingerprint spectrum of the sample to be detected and the standard fingerprint spectrum, the method is beneficial to various enterprises to better control the feeding and track the product quality and is also beneficial to quality inspection departments to monitor the quality of the small gold capsules/pills/tablets.)
技术领域
本发明涉及中药制剂检测技术领域，具体是小金胶囊/丸/片的HPLC指纹图谱的检测方法及其标准指纹图谱，以及小金胶囊/丸/片HPLC标准指纹图谱色谱峰在单味药材中的归属。
背景技术
小金胶囊、小金丸、小金片均由麝香或人工麝香、木鳖子、制草乌、枫香脂、醋乳香、醋没药、五灵脂、酒当归、地龙、香墨共十味药材按相同比例组成。《中国药典》2015年版一部规定：小金胶囊制法为木鳖子(去壳去油)50g、制草乌50g、枫香脂50g、醋乳香25g、醋没药25g、五灵脂(醋炙)50g、酒当归25g、地龙50g、香墨4g九味粉碎成细粉，过筛，混匀，加淀粉适量，制成颗粒，加入麝香或人工麝香10g混匀，装入胶囊，制成1000粒；小金丸制法为木鳖子(去壳去油)150g、制草乌150g、枫香脂150g、醋乳香75g、醋没药75g、五灵脂(醋炙)150g、酒当归75g、地龙150g、香墨12g九味粉碎成细粉，加入麝香或人工麝香30g混匀过筛，每100g粉末加淀粉25g，混匀，另用5g淀粉制稀糊，泛丸，低温干燥，即得；小金片制法为制草乌75g、枫香脂75g、醋乳香37.5g、醋没药37.5g、酒当归37.5g、地龙75g、香墨6g粉碎成细粉，木鳖子(去壳去油)75g粉碎成粗粉，用70％乙醇作溶剂，浸渍48小时后缓缓渗漉，漉液回收乙醇，浓缩成相对密度为1.06-1.10(50℃)的浸膏。五灵脂(醋炒)75g加水煎煮三次，每次1小时，滤过，合并滤液，浓缩成相对密度为1.06-1.10(50℃)的浸膏。合并上述两种浸膏，浓缩成相对密度为1.20-1.25(50℃)的浸膏，与上述细粉混匀，低温干燥，粉碎，过筛，用淀粉适量制糊，制成颗粒，干燥，加入研细的麝香或人工麝香15g，混匀，压制成1000片，即得。
小金胶囊/丸/片具有散结消肿，化瘀止痛之功，主治寒湿痰瘀，阻于经络之流注、痰核、瘰疬、乳岩、乳癖。小金胶囊/丸/片临床疗效显著，颇受古今医家青睐，现广泛用于乳腺、甲状腺及前列腺疾病的治疗，为当今临床治疗乳腺增生的首选中成药。
现行标准仅有《中国药典》2015年版一部，标准中采用双酯型生物碱限量(TLC法)和麝香酮含量测定(GC法)对小金胶囊/丸/片中的草乌和麝香或人工麝香进行质量控制，尚有多味药材缺乏有效的控制指标，以上评价方法指标单一，尚不能对小金胶囊/丸/片质量做出全面充分的评价。
目前以指纹谱控制小金胶囊/丸/片的质量，国内外尚未见专利公开及文献报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种小金胶囊/丸/片的HPLC指纹图谱检测方法及其标准指纹图谱，该方法基于高效液相色谱技术构建指纹图谱，可以高效地检测出小金胶囊/丸/片中麝香、枫香脂、没药、五灵脂的特征峰。其中所述测定方法，包括以下步骤：(1)供试品溶液的制备：取小金胶囊/丸/片，采用有机溶剂进行提取，提取液用微孔滤膜过滤，即得供试品溶液；(2)对照品溶液制备：分别配制、11羰基-β-乙酰乳香酸对照品溶液；(3)测定方法：采用高效液相色谱进行测定；(4)标准指纹谱的建立：采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》将得到的某些批次的样品指纹图谱拟合为一个标准指纹图谱。根据以上步骤，得到具有24个共有峰的小金胶囊/丸/片标准指纹图谱，通过与单味药材进行比对，对19个共有峰的来源进行了归属。通过对比待检样品指纹图谱与标准指纹图谱的相似程度，可以反映小金胶囊/丸/片的质量，有利于各企业更好地控制投料及跟踪产品质量，也有利于质检部门监控小金胶囊/丸/片的质量。
本发明提供了一种小金胶囊/丸/片HPLC指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：
(1)色谱条件与适用性试验：Symmetry C18(250mm×4.6mm，5μm)，以乙腈为流动相A，以体积分数为0.10％的磷酸水溶液为流动相B；检测波长为240nm；流速为1.mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL；理论塔板数按11羰基-β-乙酰乳香酸峰计应大于4000。所述洗脱梯度为：
时间(min)
流动相A(％)
流动相B(％)
0-40
12％→98％
88％→2％
40-55
98％→98％
2％→2％
(2)供试品溶液的制备：取样品适量，研细，加入有机溶剂，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用有机溶剂补足减失的重量，摇匀，过滤膜，滤液即为供试品溶液。
(3)对照品溶液的制备：精密称定11羰基-β-乙酰乳香酸，加有机溶剂制成一定浓度的对照品溶液。
(4)建立HPLC标准指纹图谱；
(5)进行方法学试验，试验包括如下内容：
1)标准指纹图谱色谱峰归属；
2)被测溶液的稳定性试验；
3)仪器精密度试验；
4)重复性试验。
(6)样品测定：按色谱条件，精密吸取待测样品溶液10μL，注入液相色谱仪，记录55分钟色谱图，测试样品色谱图与标准指纹图谱基本一致，利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》对测试样品色谱图与标准指纹图谱的相似度进行计算，根据相似度计算结果对测试样品的质量进行评价。
发明的有益效果是：
本发明基于高效液相色谱建立了小金胶囊/丸/片HPLC标准指纹图谱，本发明中建立的色谱方法重现性好，简便易操作，并对标准指纹图谱中的共有峰进行了单味药材来源归属。通过对比待检样品所得指纹图谱与标准指纹图谱的相似程度，可以反映小金胶囊/丸/片的质量，有利于各企业更好地控制投料及跟踪产品质量，也有利于质检部门监控小金胶囊/丸/片的质量。
附图说明
图1为小金胶囊/丸/片标准指纹图谱(1-24为24个共有峰，,17号峰为11羰基-β-乙酰乳香酸)；
图2为A公司S7批小金胶囊样品和麝香、木鳖子、草乌、枫香脂、乳香、没药、五灵脂、当归、地龙、香墨药材色谱图；
图3为A-G共8个公司44批小金胶囊/丸片的HPLC指纹图谱叠加图。
具体实施方式
为了更加详细的介绍本发明，下面结合具体实施例进一步阐明本发明。
实施例1一种小金胶囊/丸/片的指纹图谱检测方法及标准指纹图谱的建立包括以下内容：
1仪器与试药
1.1仪器
Waters Alliance高效液相色谱仪(2695梯度泵，2998二极管阵列检测器，自动进样器，柱恒温系统，Empower色谱工作站)，1/10万电子分析天平(XS105型，METTLER)，超声仪(KQ5200DE型)。
1.2试药
11羰基-β-乙酰乳香酸(中国药品生物制品检定所，批号：786-9001)。乙腈、磷酸试剂为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯；小金胶囊样品为A-G公司提供，批号见表1；
表1A-G公司小金胶囊测试样品批号
2方法与结果
2.1色谱条件与系统适用性试验：Symmetry C18(250mm×4.6mm，5μm)，以乙腈为流动相A，以体积分数为0.10％的磷酸水溶液为流动相B；检测波长为240nm；流速为1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL；理论塔板数按11羰基-β-乙酰乳香酸峰计应大于4000。所述洗脱梯度为：
表2梯度洗脱表
2.2供试品溶液的制备：取样品适量，研细，取2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇25mL，称定重量，超声处理(功率300W，频率40Hz，水温控制在30℃以下)35min，放冷，再次称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，滤液即为供试品溶液。
2.3对照品溶液的制备：精密称定11羰基-β-乙酰乳香酸，加甲醇制成每1mL甲醇含2.01mg11羰基-β-乙酰乳香酸的对照品的溶液，即得。
2.4HPLC标准指纹图谱的建立：目前获得国家食品药品监督管理局批准文号的小金胶囊仅有A、E两个厂家，A公司的样品在本次抽样中抽到的批次较多，共有15批，表明其市场份额较大，并且抽中的15样品的相似度在0.954～0.999之间，表明A厂家样品质量稳定，故标准指纹谱以A厂家15批样品拟合生成。建立过程为：测定A公司15批小金胶囊HPLC指纹图谱，利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件对得到的指纹图谱分析比较，拟合生成小金胶囊/丸/片HPLC标准指纹图谱。小金胶囊/丸/片HPLC标准指纹图谱具有24个共有峰(参见附图1)。
2.5方法学试验
2.5.1标准指纹图谱色谱峰归属
取A公司S7批小金胶囊和人工麝香、木鳖子、制草乌、枫香脂、醋乳香、醋没药、五灵脂、酒当归、地龙、香墨药材，按照2.2供试品溶液的制备方法制备得到供试品溶液，按2.1项色谱条件对样品溶液进行分析，将得到的色谱图进行对比，结合光谱数据对色谱峰进行归属，色谱图见图2，色谱峰归属结果见表3：
表3小金胶囊标准指纹图谱色谱峰归属表
2.5.2精密度试验
取A公司S7批样品，按照2.2供试品溶液的制备方法制备得到供试品溶液，连续进样6次，以11羰基-β-乙酰乳香酸所对应的17号峰色谱峰为参照峰，计算出1-24号共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于4.2％。将测得的色谱图数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》，由软件计算，结果6次测定供试品图谱与标准指纹图谱的平均相似度为1.000，RSD＝0.00％(n＝6)，见表4，试验表明本方法的仪器精密度良好。
表4精密度试验结果
1
2
3
4
5
6
RSD
相似度
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
0.00％
2.5.3稳定性试验
取A公司S7批样品，按照2.2供试品溶液的制备方法制备得到供试品溶液，分别在时间点为0，2，4，6，8，12，24，36，48h进样，以11羰基-β-乙酰乳香酸所对应的17号峰色谱峰为参照峰，计算出1-24号共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于6.4％。将测得的色谱图数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》，由软件计算，结果9次测定供试品图谱与标准指纹图谱的平均相似度为1.000，RSD＝0.00％(n＝9)，见表5，试验表明表明供试品溶液在48小时内稳定性良好。
表5稳定性试验结果
0
2
4
6
8
12
24
36
48
RSD
相似度
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
0.999
1.000
1.000
1.000
0.00％
2.5.4重现性试验
取A公司S7批样品，分别在第一天称取1份，第二天称取1份，第三天称取6份，按照2.2供试品溶液的制备方法制备得到供试品溶液，分别进样，以11羰基-β-乙酰乳香酸所对应的17号峰色谱峰为参照峰，计算出1-24号共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于6.0％。将测得的色谱图数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》，由软件计算，结果8次测定供试品图谱与标准指纹图谱的平均相似度为0.998，RSD＝0.00％(n＝8)，见表6，试验表明该方法重现性好。表6稳定性试验结果
1
2
3
4
5
6
7
8
RSD
相似度
0.983
1.000
1.000
1.000
1.000
0.999
1.000
1.000
0.00％
2.6样品测定
按色谱条件，精密吸取待测样品溶液10μL，注入液相色谱仪，记录55分钟色谱图。测定不同厂家不同批号共44批小金胶囊/丸/片的指纹图谱，44批样品重叠图见图3，利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》对得到的测试样品色谱图与标准指纹图谱的相似度进行计算。从测定结果看出，各厂家样品的相似度差异较大，故将合格样品指纹图谱与标准指纹图谱的相似度暂定为应不低于0.70，44批样品指纹图谱与标准指纹图谱的相似度计算结果汇总以及合格率见表7。
表7各厂家相似度汇总表
本发明可以高效地检测出小金胶囊/丸/片中麝香、枫香脂、没药、五灵脂的特征峰。通过与单味药材进行比对，对小金胶囊/丸/片标准指纹图谱进行单味药材饮片来源归属，以验证所得到的标准指纹图谱。通过对比待检样品指纹图谱与标准指纹图谱的相似程度，可以反映小金胶囊/丸/片的质量，有利于各企业更好地控制投料及跟踪产品质量，也有利于质检部门监控小金胶囊/丸/片的质量。
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