阅读说明：本技术 腈水解酶BnNIT2的应用及消除饲料中腈化物毒性的方法 (Application of nitrilase BnNIT2 and method for eliminating toxicity of nitrile compounds in feed ) 是由 罗会颖 张亨 姚斌 王亚茹 柏映国 黄火清 苏小运 王苑 涂涛 张�杰 于 2020-08-13 设计创作，主要内容包括：本发明涉及农业生物技术领域,具体涉及腈水解酶RmNIT的应用及消除饲料中腈化物毒性的方法。本发明确定Brassica napu来源的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白为腈水解酶,其最适pH为7.0,最适温度为45℃。50℃处理10 min约剩余50%酶活力,50℃处理1 h约剩余10%酶活力,在pH 6-8范围内37℃处理1 h,剩余80%酶活力,适合于在食品、饲料、医药等行业中应用,消除菜籽粕中的抗营养物质。(The invention relates to the technical field of agricultural biology, in particular to application of nitrilase RmNIT and a method for eliminating toxicity of nitrile compounds in feed. The amino acid sequence of Brassica napu source is determined to be shown in SEQ ID NO: the protein shown in 1 is nitrilase, the optimum pH value is 7.0, and the optimum temperature is 45 ℃. 50 percent of enzyme activity is remained after 10 min of 50 ℃, 10 percent of enzyme activity is remained after 1 h of 50 ℃, 80 percent of enzyme activity is remained after 1 h of 37 ℃ of pH 6-8, and the method is suitable for application in food, feed, medicine and other industries and can eliminate anti-nutritional substances in rapeseed dregs.)

腈水解酶BnNIT2的应用及消除饲料中腈化物毒性的方法

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及腈水解酶RmNIT的应用及消除饲料中腈化物毒性的方法。

背景技术

我国有丰富的杂粕蛋白质资源如：棉粕，菜籽粕，棕榈粕，花生粕等。在目前市场上优质蛋白质饲料资源严重短缺的情况下，杂粕蛋白质资源拥有良好的应用前景。但杂粕中抗营养物质的存在严重影响杂粕在饲料中的添加。如棉酚、凝结素等多酚类化合物能降低饲料中蛋白消化率；植酸、硫代葡糖苷等影响动物对微量元素的吸收等。现阶段消除抗营养物质的方法有物理法、化学法及生物法，其中饲料酶制剂的应用是消除抗营养物质有效的方式。

菜籽粕是杂粕资源中的一大类别，消除菜籽粕中的抗营养物质对其在饲料中的应用具有重大推动作用。菜籽粕中一类抗营养物质为硫代葡糖苷，简称硫苷，是广泛存在于十字花科及相关物种含硫次生代谢物，目前已从数百种植物中发现120多种硫苷。硫苷能引起饲用动物甲状腺肿大，从而造成其生长发育迟缓，使菜籽粕难以作为优质饲料蛋白资源加以充分应用。硫代葡糖苷本身无毒，其降解产物如腈类化合物对动物生长发育有害。菜籽粕中的腈种类有很多，主要有：3-羟基-4-戊烯腈、4- 戊烯腈、3-丁烯腈、3-吲哚乙腈等。

腈水解酶（Nitrilase；EC 3.5.5.1）是腈水解酶超级家族中的一种重要催化剂，它作为一种重要的工业酶不仅能将腈类化合物转化为高附加值的工业、食品和医药等产品的中间体，还能够直接将有毒腈化物转化为相应的无毒酸和氨，处理环境中的腈类污染物。

发明内容

本发明的目的是提供Brassica napu来源的酶作为腈水解酶的应用。

本发明的再一目的是提供一种消除饲料中腈化物毒性的方法。

Brassica napu来源的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白为腈水解酶。 其中，该酶全长343个氨基酸，理论分子量为37 kDa。

腈水解酶BnNIT2的最适pH为7.0，最适温度为45 ℃。50 ℃ 处理10 min约剩余50%酶活力，50℃处理1 h约剩余10 %酶活力。在pH 6-8范围内37℃处理1 h，剩余80 %酶活力。

上述腈水解酶基因的DNA全序列分析结果表明，腈水解酶BnNIT2结构基因全长为1029bp，通过基因工程常规操作，以全合成的方法获得了对应于所述SEQ ID NO：1氨基酸序列的该腈水解酶的核苷酸序列，如SEQ ID NO：2所示。

根据本发明的消除饲料中腈化物毒性的方法，所述方法包括使用氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的酶水解饲料中腈化物的步骤。

根据本发明的消除饲料中腈化物毒性的方法，所述酶在30-50℃、pH6.0-pH8.0的条件下水解饲料中腈化物。

根据本发明的消除饲料中腈化物毒性的方法，所述酶在45℃、pH7.0的条件下水解饲料中腈化物。

根据本发明的消除饲料中腈化物毒性的方法，所述饲料为菜籽粕。

本发明提供了上述腈水解酶的应用。运用基因工程手段来产业化生产腈水解酶。该腈水解酶有效地催化菜籽粕中3-羟基-4-戊烯腈、4- 戊烯腈、3-丁烯腈、3-吲哚乙腈等，从而可作应用于饲料、食品、医药等工业。根据本发明的技术方案就可以实现利用基因工程手段生产性质优良适合工业应用的腈水解酶。

附图说明

图1显示腈水解酶BnNIT2的最适pH值；

图2显示腈水解酶BnNIT2的pH稳定性；

图3显示腈水解酶BnNIT2的最适反应温度；

图4显示腈水解酶BnNIT2的热稳定性。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：pET28a载体，大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）。

2、酶类及其它生化试剂：限制性内切酶，FastPfuDNA聚合酶， DNA回收试剂盒，质粒小提中量试剂盒。

3、培养基：

（1）LB液体培养基：5 g/L酵母粉，10 g/L蛋白胨，10 g/L NaCl。

（2）LB固体培养基：在固体培养基的基础上加15 g/L琼脂粉。

（3）卡纳霉素：100 mg/mL，0.22 μM滤膜滤灭。

（4）50×TAE：57.1 mL/L冰醋酸，242 g/L Tris碱，50 M EDTA，调至pH8.0

（5）A液：2.5 g氢氧化钠、18.7 g磷酸氢二钠和15.9 g磷酸钠,含250 mg有效氯的次氯酸钠溶液，pH为11.7,ddH2O定容至500 mL，得氢氧化钠与次氯酸钠复配液。

B液：5.0 g苯酚和0.025 g亚硝基铁***,ddH2O定容至 500 mL,制得苯酚与亚硝基铁***复配液。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J．萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1 BnNIT2基因的合成及表达载体构建

利用NCBI数据库数据检索得到Brassica napu来源的酶 (NCBI Reference Sequence:XP_013699468.1)，命名BnNIT2。根据其氨基酸序列，并依据大肠杆菌偏好的密码子进行密码子优化，并根据表达载体pET28a的特点设计了酶切位点NcoI和XhoI。

表1 本实验所需的引物

引物名称	引物序列(5'---3')	引物长度(bp)
			<i>BnNIT2</i>F	AAGGAGATATACCATGAGCACGCTCA	26
<i>BnNIT2</i>R	A TGGTGGTGGTGCTCGAGTTTTTCCTTGGCCT	31

以合成的BnNIT2基因为模板，设计合成了带有NcoI和XhoI限制性酶切位点的引物F和R（见表1），对BnNIT2基因进行扩增。并利用NcoI和XhoI酶切PCR产物，连接进入表达载体pET28a (Invitrogen, San Diego)，腈水解酶BnNIT2的序列***到上述表达载体的下游，形成正确的阅读框架，构建成大肠杆菌表达载体pET28a-BnNIT2，转化大肠杆菌感受态细胞Trans1。阳性转化子进行DNA测序，测序表明序列正确的转化子用于大量制备重组质粒。表达质粒载体DNA，转化大肠杆菌表达菌株BL21（DE3），37°C培养1天，挑取在LB平板上生长的转化子进行进一步的表达实验。

实施例2重组腈水解酶的制备

（1）将重组菌株挑取单菌落于20 mL的LB液体培养基中（含卡那霉素50 mg/mL）,37 ℃，220rpm过夜培养。

（2）将种子液按1：100转接于500 mL LB液体培养基中（含卡那霉素50 mg/mL）,37 ℃，220 rpm培养。

（3）OD600约0.6～0.8时加入终浓度为1.0 mM的IPTG。16 ℃，180 rpm培养约20个小时。

（4）取诱导后的菌液，4℃，4000 rpm离心8 min,收集菌体。

（5）将收集的细胞用20 mL A液悬浮，加入200 μL 蛋白酶抑制剂，混匀。

（6）用超声波破碎仪对细胞进行破碎。破碎细胞频率为每间隔4s破碎3s，超声破碎时间为2 h。可适当延长时间使细胞澄清。

（7）破碎后，4℃，13000 rpm离心50 min，取上清纯化。

（8）制备层析柱。加入2-3 mLNTA树脂于层析柱中，静止30 min左右用10倍树脂体积的ddH₂O进行洗脱，之后用10倍树脂体积的A液平衡。

（9）将离心后的上清蛋白加入到层析柱中，降低初始流速，收集穿透液。重复上样一次。

（10）以A,B液为母液配制咪唑浓度分别为10 mM、20 mM、50 mM和200 mM的洗脱液。依次加入洗脱液收集蛋白。

（11）取少量样品加入蛋白上样缓冲液，混匀后于沸水煮沸5 min,12000 rpm离心1min。取8 μL进行SDS-PAGE电泳。

（12）根据电泳条带确定最适洗脱体积并收集纯度较高的融合蛋白，采用Brandford法测定蛋白浓度。蛋白在液氮速冻后于-80 ℃保存。

实施例3重组腈水解酶部分性质分析

采用苯酚-次氯酸钠法对实施例2获得的重组腈水解酶进行活性分析。具体方法如下：反应介质采用 100 mM、pH 7.2的磷酸钠缓冲液，反应底物为 20 mM 戊烯腈，反应体系体积为 500 uL，反应在 30°C的水浴锅上进行。将蛋白样品在 30°C 下温浴20 min，随后加入到含有底物的磷酸缓冲液中开始计时。反应结束后加入1 M HCl (0.5 mL)终止反应。反应终止后，取10μL加入到含有ddH₂O 500 μL的EP管中,依次加入 B 液、A 液各 250μL,混合均匀,37 ℃恒温水浴加热20 min后,测定612 nm 处吸光度,绘制标准曲线。酶活(1 U)的定义为：在标准反应条件下，每 min 形成1 µmol氨所对应的酶量，测定需重复 3 次。

（1）腈水解酶BnNIT2的最适pH及pH稳定性

经纯化的(实施例2)表达的腈水解酶BnNIT2在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为pH 1.0～3.0 甘氨酸-盐酸缓冲液，pH3.0～8.0的柠檬酸一磷酸氢二钠系列缓冲液及pH 8.0～l0.0是Tris-HCl系列缓冲液。纯化的腈水解酶BnNIT2在不同pH的缓冲体系．45°C下测定的最适pH结果（图1）表明：BnNIT2的最适pH为7.0，在pH6-pH8范围内，该酶能够维持其70%以上的酶活力。

将酶液在不同pH值的缓冲液中于37°C下处理60 min，再测定酶活性以研究酶的pH稳定性。结果表明（图2），分析结果表明pH6.0-pH8.0之间能够维持80%以上的酶活力。

（2）腈水解酶BnNIT2反应最适温度及热稳定性

纯化的腈水解酶BnNIT2在pH 7.0条件下，测定不同温度（30-50℃）下的酶活性，分析实验结果表明显示，该酶的最适反应温度为45℃，在50℃时具有40%以上的酶活力（图3）。耐温性测定为腈水解酶在不同温度下处理不同时间，再在45°C下进行酶活性测定。热稳定性实验表明：该腈水解酶在50 ℃ 处理10 min约剩余50%酶活力，50℃处理1 h约剩余10%酶活力。（图4）。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 腈水解酶BnNIT2的应用及消除饲料中腈化物毒性的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 343

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ser Thr Leu Lys Asn Thr Thr Gln Val Asn Gly Asp Ala Ser Ser

1 5 10 15

Ser Ile Val Arg Ala Thr Ile Val Gln Ala Ser Thr Val Tyr Asn Asp

20 25 30

Thr Pro Lys Thr Ile Glu Lys Ala Glu Lys Leu Ile Ala Glu Ala Ala

35 40 45

Ser Asn Gly Ser Glu Leu Val Val Phe Pro Glu Gly Phe Ile Gly Gly

50 55 60

Tyr Pro Arg Gly Phe Arg Phe Gly Ile Ala Val Gly Ile His Asn Glu

65 70 75 80

Glu Gly Arg Asp Asp Phe Arg Lys Tyr His Ala Ser Ala Ile His Val

85 90 95

Pro Gly Pro Glu Val Asp Lys Leu Ala Glu Leu Ala Arg Lys Asn Asn

100 105 110

Val Tyr Leu Val Met Gly Ala Ile Glu Lys Asp Gly Tyr Thr Leu Tyr

115 120 125

Cys Thr Ala Leu Phe Phe Asn Ser Glu Gly Arg Phe Leu Gly Lys His

130 135 140

Arg Lys Val Met Pro Thr Ser Leu Glu Arg Cys Ile Trp Gly Phe Gly

145 150 155 160

Asp Gly Ser Thr Ile Pro Val Tyr Asp Thr Pro Ile Gly Lys Leu Gly

165 170 175

Ala Ala Ile Cys Trp Glu Asn Arg Met Pro Leu Tyr Arg Thr Ala Leu

180 185 190

Tyr Gly Lys Gly Val Glu Leu Tyr Cys Ala Pro Thr Ala Asp Gly Ser

195 200 205

Lys Glu Trp Gln Ser Ser Met Met His Ile Ala Met Glu Gly Gly Cys

210 215 220

Phe Val Leu Ser Ala Cys Gln Phe Cys Gln Arg Lys Asp Phe Pro Ala

225 230 235 240

His Val Asp His Leu Phe Thr Asp Trp Tyr Asp Asp Gln His Asp Glu

245 250 255

Ala Ile Val Ser Gln Gly Gly Ser Val Ile Ile Ser Pro Leu Gly Lys

260 265 270

Val Leu Ala Gly Pro Asn Phe Glu Ser Glu Gly Leu Ile Thr Ala Asp

275 280 285

Leu Asp Leu Gly Asp Ile Ala Arg Ala Lys Leu Tyr Phe Asp Val Val

290 295 300

Gly His Tyr Ser Lys Pro Asp Val Phe Asn Leu Thr Val Asn Glu His

305 310 315 320

Pro Lys Lys Pro Val Thr Phe Val Ser Lys Thr Val Lys Ala Glu Asp

325 330 335

Asp Thr Glu Ala Lys Glu Lys

340

<210> 2

<211> 1029

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgagcacgc tcaaaaacac gacgcaagtt aacggcgatg ccagcagcag tattgtgcgc 60

gcgaccattg ttcaagccag caccgtgtac aatgataccc cgaagacgat cgagaaggcc 120

gaaaagctga tcgccgaggc cgcgagcaat ggcagtgagc tcgttgtttt tccggagggc 180

tttatcggcg gttacccacg cggttttcgc ttcggcattg ccgtgggcat ccacaacgaa 240

gaaggccgcg acgattttcg caagtatcat gccagcgcga tccacgtgcc gggcccggaa 300

gttgataaac tggccgagct ggcgcgcaag aacaacgtgt atctggtgat gggcgccatc 360

gagaaggacg gctatacgct gtactgcacc gccctcttct tcaacagcga aggtcgcttt 420

ctgggcaaac accgcaaagt tatgccgacc agcctcgaac gttgcatctg gggtttcggc 480

gacggcagta cgatcccggt gtacgatacg ccgatcggca aactgggcgc cgcgatttgc 540

tgggagaacc gcatgccgct gtatcgcacc gcgctgtatg gcaaaggcgt tgaactgtac 600

tgcgcgccaa ccgccgatgg cagcaaagag tggcagagca gcatgatgca catcgcgatg 660

gaaggcggtt gtttcgttct gagcgcgtgc cagttctgcc agcgtaaaga tttcccggcc 720

catgtggatc atctgtttac cgactggtac gatgaccagc acgacgaagc gatcgttagc 780

caaggcggta gcgttatcat cagcccgctg ggtaaggttc tcgcgggtcc gaatttcgag 840

agcgaaggtc tgatcaccgc cgatctggat ctgggtgaca tcgcgcgtgc gaagctgtac 900

ttcgacgtgg ttggtcacta cagcaagccg gacgttttca atctgaccgt gaacgaacac 960

ccgaagaaac cagtgacctt cgtgagcaag accgtgaaag cggaggacga caccgaggcc 1020

aaggaaaaa 1029