一种酶法制备尿苷酸的方法
阅读说明：本技术 一种酶法制备尿苷酸的方法 (Method for preparing uridylic acid by enzyme method ) 是由 周浩 于 2019-10-29 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物制药和生物化工技术领域,公开了一种尿苷酸生产用酶组合物及一种酶法制备尿苷酸的方法。本发明所述酶组合物由胞苷脱氨酶、多聚磷酸激酶和尿苷-胞苷激酶组成。三种酶合理组合可以高效催化制备尿苷酸。本发明所述酶组合物可循环利用,成本低,节能环保。本发明所述酶法制备尿苷酸的方法以胞苷为底物,通过添加尿苷酸生产用酶组合物,可以低成本、安全可靠制备尿苷酸,降低现有路线的成本,使其适应规模化生产,为尿苷酸在生物催化和药品领域的使用提供保证。(The invention belongs to the technical field of biological pharmacy and biochemical engineering, and discloses an enzyme composition for producing uridylic acid and a method for preparing the uridylic acid by an enzyme method. The enzyme composition provided by the invention comprises cytidine deaminase, polyphosphate kinase and uridine-cytidine kinase. The reasonable combination of the three enzymes can efficiently catalyze and prepare uridylic acid. The enzyme composition disclosed by the invention can be recycled, is low in cost, and is energy-saving and environment-friendly. The method for preparing uridylic acid by the enzyme method takes cytidine as a substrate, and the enzyme composition for producing uridylic acid is added, so that the uridylic acid can be safely and reliably prepared at low cost, the cost of the existing route is reduced, the method is suitable for large-scale production, and the use of the uridylic acid in the fields of biological catalysis and medicines is guaranteed.)
技术领域
本发明属于生物制药和生物化工技术领域，具体涉及一种酶法制备尿苷酸的方法。
背景技术
尿苷一磷酸(uridine monophosphate，UMP)又名尿苷酸，是人体内嘧啶核苷酸从头合成的重要中间产物，是组成RNA的重要核苷酸之一。人体内嘧啶核苷酸的从头合成主要受到UMP的负反馈调节；可在体内进一步生成UDP(二磷酸尿苷)。
尿苷酸的钠盐5’-尿苷酸二钠可作为生产核酸类药物的重要中间体、保健食品和生化试剂，并用于制造尿苷二磷酸葡萄糖、尿苷三磷酸、聚腺尿苷酸等药物，在治疗多种重大的疾病方面起着重要的作用。
目前，随着尿苷三磷酸、二尿苷四磷酸、尿苷磷酸酶抑制剂等在医药领域应用范围的扩大，及尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因方面的应用，国内外科研机构和企业也加大了对5’-尿苷酸二钠的研究开发力度。
现有的尿苷酸的生产方法主要包括化学合成法和核糖核酸(Ribonucleic Acid，RNA)降解法。化学法是将尿苷溶解于酸性溶液中，将2,3位的羟基保护后再使用有毒的POCl3试剂作为磷酸化试剂合成尿苷酸，整个过程收率较高，但是反应过程中使用有毒试剂，高温高压、易爆，生产安全性差，容易造成污染。RNA降解法是使用5′-磷酸二酯酶降解来自于酵母细胞的RNA，整个过程相对环保但是产品分离困难，细胞裂解物难于处理。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种酶法制备尿苷酸的方法。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种酶组合物，由胞苷脱氨酶、多聚磷酸激酶和尿苷-胞苷激酶组成。
本发明所述酶组合物中胞苷脱氨酶(ccd)、尿苷-胞苷激酶(UCK)、多聚磷酸激酶(ppk)三种酶合理组合可以用于酶解催化合成UMP。
在一些实施方案中，所述的酶组合物中所述胞苷脱氨酶的活性为1000-2000U/L、所述多聚磷酸激酶的活性为600-1000U/L，所述尿苷-胞苷激酶的活性为1100-1500U/L。
本发明所述酶组合物中所述胞苷脱氨酶、多聚磷酸激酶和尿苷-胞苷激酶可以为通过基因工程技术通过PCR扩增目的片段、与载体连接转入宿主菌后诱导蛋白表达纯化后的高质量纯化的游离酶液。也可以是再经固定化处理后的固定化酶或固定化重组细胞。
本发明还提供了利用上述酶组合物制备尿苷酸的方法。
一种酶法制备尿苷酸的方法，在pH 7.0磷酸缓冲溶液中加入胞苷、六偏磷酸钠、ATP、MgCl2·6H2O混匀，加入上述的酶组合物，催化制得尿苷酸。
本发明所述方法以胞苷为底物，通过添加尿苷酸生产用酶组合物，可以低成本、安全可靠制备尿苷酸。具体反应式如下：
在一些实施方案中，本发明所述酶法制备尿苷酸的方法中所述的酶组合物中所述胞苷脱氨酶的活性为1000-2000U/L、所述多聚磷酸激酶的活性为600-1000U/L，所述尿苷-胞苷激酶的活性为1100-1500U/L。在一些具体实施例中，所述胞苷脱氨酶的活性为1000U/L、所述多聚磷酸激酶的活性为600U/L，所述尿苷-胞苷激酶的活性为100U/L。在一些具体实施例中，所述胞苷脱氨酶的活性为2000U/L、所述多聚磷酸激酶的活性为800U/L，所述尿苷-胞苷激酶的活性为1500U/L。在另一些具体实施例中，所述胞苷脱氨酶的活性为1500U/L、所述多聚磷酸激酶的活性为1000U/L，所述尿苷-胞苷激酶的活性为1100U/L。
在一些实施方案中，本发明所述酶法制备尿苷酸的方法中，所述胞苷的终浓度为16-24g/L，六偏磷酸钠的终浓度为50-80g/L，ATP的终浓度为1-2g/L，MgCl2·6H2O的终浓度为8-12g/L。在一些具体实施例中，所述胞苷的终浓度为20g/L，六偏磷酸钠的终浓度为80g/L，ATP的终浓度为1g/L，MgCl2·6H2O的终浓度为10g/L。在一些具体实施例中，所述胞苷的终浓度为16g/L，六偏磷酸钠的终浓度为60g/L，ATP的终浓度为1g/L，MgCl2·6H2O的终浓度为12g/L。在另一些具体实施例中，所述胞苷的终浓度为24g/L，六偏磷酸钠的终浓度为50g/L，ATP的终浓度为2g/L，MgCl2·6H2O的终浓度为8g/L。
作为优选，本发明所述酶法制备尿苷酸的方法中，所述催化反应条件为在pH 7.0、反应温度30-35℃条件下反应10-15小时。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种尿苷酸生产用酶组合物及一种酶法制备尿苷酸的方法。本发明所述酶组合物由胞苷脱氨酶、多聚磷酸激酶和尿苷-胞苷激酶组成。三种酶合理组合可以高效催化制备尿苷酸。本发明所述酶组合物可循环利用，成本低，节能环保。本发明所述酶法制备尿苷酸的方法以胞苷为底物，通过添加尿苷酸生产用酶组合物，可以低成本、安全可靠制备尿苷酸，降低现有路线的成本，使其适应规模化生产，为尿苷酸在生物催化和药品领域的使用提供保证。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例5固化酶循环活性降低曲线，横坐标为循环次数，纵坐标为酶活性。
具体实施方式
本发明公开了一种酶法制备尿苷酸的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
胞苷脱氨酶酶活测定方法：胞苷脱氨酶pynM转化体系：在50mL转化瓶中加入E.coli BL21/pET-28a/pynM超声破碎菌体10mL、0.1g胞苷或0.1g脱氧胞苷，30℃、150r/min转化反应2～3h，转化结束后，离心取上清备以后续检测。检测方法：高效液相色谱法定量检测(脱氧)尿苷。前处理：转化液离心后，上清液过0.22μm微孔膜用于高效液相色谱检测。条件：色谱柱：安捷伦C18柱(4.6mm×250mm i.d.5μm)；柱温：35℃；进样体积：20μL；流速1mL/min；检测波长260nm；流动相：A：超纯水；B：甲醇。梯度洗脱：0min，15％B，保持3min；3.0-3.5min，15-24％B；3.5min，24％保持5min；8.5-9.0min，24-35％B；35％B保持6min；15.0-16.0min，35-85％B；85％B保持6min；22.0-22.5min，85％-15％B；15％B保持5min。标准曲线的制作：精确称取(脱氧)尿苷标准品，约1.00mg-2.00mg，超纯水定容。各标准品配制6个梯度(1μg/mL,30μg/mL，60μg/mL，90μg/mL，120μg/mL，150μg/mL)。然后依次上样，每个浓度5次重复。取一定体积最高浓度的标准液混合在一起后，定容，然后HPLC分析(脱氧)尿苷检测的最优条件。
多聚磷酸激酶酶活测定方法：酶反应体系及反应条件如下：100mM Tris-HCl(pH8.0)，20mM MgCl2，1mM AMP，1mM六偏磷酸钠，30℃反应15min，沸水煮5min灭酶，离心，上清液过膜。采用HPLC检测ATP的含量，具体为C18HPLC色谱柱，250mm×4.6mm；流动相：磷酸三乙胺水溶液(其中磷酸含量0.6％(v/v)，用三乙胺调节pH至6.6)：甲醇＝90:10；紫外检测器，波长254nm，柱温30℃，流速1mL/min，进样量20μL。
尿苷-胞苷激酶酶活测定方法：尿苷-胞苷激酶pynF转化体系：在50mL转化瓶中加入E.coli BL21/pET-28a/pynF超声破碎菌体10mL、0.1g胞苷(或0.1g尿苷)，30℃、150r/min转化反应2-3h，转化结束后，离心取上清备以后续检测。检测方法：高效液相色谱法定量检测嘧啶核苷酸累积情况。前处理：转化液离心后，上清液过0.22μm微孔膜用于高效液相色谱检测。条件：色谱柱：安捷伦C18柱(4.6mm×250mm i.d.5μm)；柱温：35℃；进样体积：20μL；流速1mL/min；检测波长260nm；流动相：A：超纯水；B：甲醇。梯度洗脱：0min，15％B，保持3min；3.0-3.5min，15-24％B；3.5min，24％保持5min；8.5-9.0min，24-35％B；35％B保持6min；15.0-16.0min，35-85％B；85％B保持6min；22.0-22.5min，85％-15％B；15％B保持5min。标准曲线的制作：精确称取各核苷酸类(尿苷酸、胞苷酸)标准品，约1.00mg-2.00mg，超纯水定容。各标准品配制6个梯度(1μg/mL,30μg/mL，60μg/mL，90μg/mL，120μg/mL，150μg/mL)。然后依次上样，每个浓度5次重复。取一定体积最高浓度的标准液混合在一起后，定容，然后HPLC分析嘧啶核苷酸检测的最优条件。
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。其中，种子培养基配方为蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L。发酵培养基配方为蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 8g/L，甘油10g/L，磷酸一氢钾1.2g/L，磷酸二氢钾1.8g/L，硫酸镁1g/L。
实施例1、制备UMP生产用酶
根据三种酶基因的序列，设计3对扩增引物。提取大肠杆菌(Escherichia coli)菌株基因组DNA，以其为模板，PCR扩增胞苷脱氨酶(cytidine deaminase,ccd)和多聚磷酸激酶(PPK1)基因片段，并分别将其连接至pET28a载体(购于Novagene公司)；提取保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)基因组DNA，以其为模板，PCR扩增尿苷-胞苷激酶(UCK)基因片段，并将其连接至pET 28a载体(购于Novagene公司)。三种基因片段连接成功经测序正确后，分别转入E.coli BL21(DE3)菌株(上海唯地生物技术有限公司)。
其中，胞苷脱氨酶(cytidine deaminase,ccd)的序列为ATGCATCCACGTTTTCAAACCGCTTTTGCCCAACTTGCGGATAACTTGCAATCTGCACTGGAACCTATTCTGGCAGACAAGTACTTCCCCGCTTTGTTGACCGGGGAGCAAGTCTCATCGCTGAAGAGCGCAACGGGGCTGGACGAAGACGCGCTGGCATTCGCACTACTTCCGCTGGCGGCGGCCTGTGCGCGTACGCCATTGTCGAATTTTAATGTTGGCGCAATTGCGCGCGGTGTGAGCGGAACCTGGTATTTCGGTGCCAATATGGAATTTATTGGTGCGACAATGCAGCAAACCGTTCATGCCGAACAAAGCGCGATCAGCCACGCCTGGTTGAGTGGTGAAAAAGCGCTTGCAGCCATCACCGTTAACTACACGCCTTGTGGTCACTGCCGTCAGTTTATGAATGAACTGAACAGCGGTCTGGATCTGCGTATTCATCTGCCGGGCCGCGAGGCACACGCGCTGCGTGACTATCTGCCAGATGCCTTTGGGCCGAAAGATCTGGAGATTAAAACGCTGCTGATGGACGAACAGGATCACGGCTATGCGCTGACGGGTGATGCGCTTTCTCAGGCAGCGATTGCGGCGGCAAACCGTTCGCACATGCCTTACAGTAAGTCGCCAAGCGGTGTCGCGCTGGAATGTAAAGACGGTCGTATTTTCAGTGGCAGCTACGCTGAAAACGCCGCATTCAACCCGACTCTGCCACCGTTGCAGGGAGCGTTAATTCTGTTGAATCTCAAGGGTTATGATTACCCGGATATCCAGCGCGCGGTTCTGGCAGAAAAAGCCGATGCGCCGTTGATTCAGTGGGATGCCACCTCCGCAACGCTGAAAGCTCTCGGCTGTCACAGTATCGACCGAGTGCTTCTCGCTTAA；扩增引物序列为ccd-F:5’-3’:agtcgcatcatATGCATCCACGTTTTCAAACC，划线为酶切位点NdeI；ccd-R:3’-5’:gcgcgataGAATTCTTAAGCGAGAAGCACTCGGTCG，划线为酶切位点EcoRI。
多聚磷酸激酶(PPK1)的序列为ATGGGTCAGGAAAAGCTATACATCGAAAAAGAGCTCAGTTGGTTATCGTTCAATGAACGCGTGCTTCAGGAAGCGGCGGACAAATCTAACCCGCTGATTGAAAGGATGCGTTTCCTGGGGATCTATTCCAATAACCTTGATGAGTTCTATAAAGTCCGCTTCGCTGAACTGAAGCGACGCATCATTATTAGCGAAGAACAAGGCTCCAACTCTCATTCCCGCCATTTACTGGGCAAAATTCAGTCCCGGGTGCTGAAAGCCGATCAGGAATTCGACGGCCTCTACAACGAGCTATTGCTGGAGATGGCGCGCAACCAGATCTTCCTGATTAATGAACGCCAGCTCTCCGTCAATCAACAAAACTGGCTGCGTCATTATTTTAAGCAGTATCTGCGTCAGCACATTACGCCGATTTTAATCAATCCTGACACTGACTTAGTGCAGTTCCTGAAAGATGATTACACCTATCTGGCGGTGGAAATTATCCGTGGCGATACCATCCGTTACGCGCTGCTGGAGATCCCATCAGATAAAGTGCCGCGCTTTGTGAATTTACCGCCAGAAGCGCCGCGTCGACGCAAGCCGATGATTCTTCTGGATAACATTCTGCGTTACTGCCTTGATGATATTTTCAAAGGCTTCTTTGATTATGACGCGCTGAATGCCTATTCAATGAAGATGACCCGCGATGCCGAATACGATTTAGTGCATGAGATGGAAGCCAGCCTGATGGAGTTGATGTCTTCCAGTCTCAAGCAGCGTTTAACTGCTGAGCCGGTGCGTTTTGTTTATCAGCGCGATATGCCCAATGCGCTGGTTGAAGTGTTACGCGAAAAACTGACTATTTCCCGCTACGACTCCATCGTCCCCGGCGGTCGTTATCATAATTTTAAAGACTTTATTAATTTCCCCAATGTCGGCAAAGCCAATCTGGTGAACAAACCACTGCCGCGTTTACGCCATATTTGGTTTGATAAAGCCCAGTTCCGCAATGGTTTTGATGCCATTCGCGAACGCGATGTGTTGCTCTATTATCCTTATCACACCTTTGAGCATGTGCTGGAACTGCTGCGTCAGGCTTCGTTCGACCCGAGCGTACTGGCGATTAAAATTAACATTTACCGCGTGGCGAAAGATTCACGCATCATCGACTCGATGATCCACGCCGCACATAACGGTAAGAAAGTCACCGTGGTGGTTGAGTTACAGGCGCGTTTCGACGAAGAAGCCAACATTCACTGGGCGAAGCGCCTGACCGAAGCAGGCGTGCACGTTATCTTCTCTGCGCCGGGGCTGAAAATTCACGCCAAACTGTTCCTGATTTCACGTAAAGAAAACGGTGAAGTGGTGCGTTATGCACACATCGGGACCGGGAACTTTAACGAAAAAACCGCGCGTCTTTATACTGACTATTCGTTGCTGACCGCCGATGCGCGCATCACCAACGAAGTACGGCGGGTATTTAACTTTATTGAAAACCCATACCGTCCGGTGACATTTGATTATTTAATGGTATCGCCGCAAAACTCCCGCCGCCTATTGTATGAAATGGTGGACCGCGAGATCGCCAACGCGCAGCAAGGGCTGCCCAGTGGTATCACCCTGAAGCTAAATAACCTTGTCGATAAAGGCCTGGTTGATCGTCTGTATGCGGCCTCCAGCTCCGGCGTACCGGTTAATCTGCTGGTTCGCGGAATGTGTTCGCTGATCCCCAATCTGGAAGGCATTAGCGACAACATTCGTGCCATCAGTATTGTTGACCGTTACCTTGAACATGACCGGGTTTATATTTTTGAAAATGGCGGCGATAAAAAGGTCTACCTTTCTTCCGCCGACTGGATGACGCGCAATATTGATTATCGTATTGAAGTGGCGACGCCGCTGCTCGATCCGCGCCTGAAGCAGCGGGTACTGGACATCATCGACATATTGTTCAGCGATACGGTCAAAGCACGTTATATCGATAAAGAACTCAGTAATCGCTACGTTCCCCGCGGCAATCGCCGCAAAGTACGGGCGCAGTTGGCGATTTATGACTACATCAAATCACTCGAACAACCTGAATAA；扩增引物序列为ppk1-F5’-3’:gagtcacatATGGGTCAGGAAAAGCTATAC，划线为酶切位点NdeI；ppk1-R:3’-5’：agtcgaagaattcTTATTCAGGTTGTTCGAGTG，划线为酶切位点EcoRI。
尿苷-胞苷激酶(UCK)的序列为ATGGCTAAGCAGAAACCACTCGTCATTGGGATTGCCGGGGGGTCAGGCTCAGGAAAGACGACAGTCTCCAAAGAAATCAGCAAGCGCCTGCCAGCTGACCGGGTACTCATTCTGACTGAAGATGCTTACTACAACGACAATTCAGCCCTCAGCATGGATGAACGCAAGAAGATCAACTACGACCATCCCAATGCTTACGACACTGACCTCTTGATTGAGCAGCTGCAGGACCTGCTGGATGGCAAGGCAATTGAAATGCCGACCTACAACTTCAACATCCTCTCCCGGGCCAAGGACACTATTCATGTTGAGCCAGCCGACATCATCATCCTGGAAGGGATCCTGGTTTTGGCTACAGAAGAATTGCGGGAGTTCATGGACATCAAGCTTTTTGTCGACTCTGACGACGACATCCGCTTCATCCGCCGCTTGCAGCGGGACACCCAGGAACGGGGCCGGTCAATCGACTGGATCATCTCCCAGTACTTGGCTACGGTTAAACCAAGCTACAACCAGTTCGTTGAGCCAAGCAAGAAGTATGCCGACATCATCATCCCCCAGGGTGGGGAAAACCAAGTGGCCATCGACATGGTCTCCTCAAAGCTCTTGTCTATTATCAACGGCTAA；扩增引物序列为uck-F:5’-3’:CGGAATTCATGGCTAAGCAGAAAC，划线为酶切位点EcoRI；uck-R:3’-5’CCGCTCGAGTTAGCCGTTGATA，划线为酶切位点XhoI。
菌株在无菌条件下接入种子培养基，培养至对数生长期后接入5L发酵培养基的发酵罐中，继续培养至对数生长期后接入含50L发酵培养基的发酵罐中，培养5小时后加入1mMIPTG 25℃诱导20小时，离心收集菌体。
收获的菌体分别经超声或高压均质破碎后，离心收集上清并用镍离子亲和柱进行纯化，获得高质量纯化的酶。
制备固定化生产用酶或细胞：将4.0克聚乙二醇溶解在45m1的水中，加入6.0克聚乙烯醇(PVA)并将温度升到90-95℃溶解。待聚乙烯醇完全溶解后，将温度降至25-30℃，加入重组细胞或纯化的酶，混合均匀，用一次性吸管吸取混合液，并注在平面上形成圆片状，并在30℃温浴1小时。移入0.1M硫酸钠溶液稳定2-3小时，滤干并用灭菌水洗涤两次，置于磷酸缓冲液中待用。
使用上述测定酶活性的方法，检测到lmg/ml胞苷脱氨酶、多聚磷酸激酶和尿苷-胞苷激酶酶液活性分别约为1030U、200U和340U，其中1个活性单位(U)定义为将1μm底物在1分钟内完全转化为产物所需要的酶量。
实施例2、使用游离酶制备UMP
底物胞苷100g、六偏磷酸钠400g、ATP5g、MgCl2·6H2O 50g，加入5L pH7.0磷酸缓冲溶液中，搅拌均匀，调节pH至7.0。在反应液中加入胞苷脱氨酶：1000U/L、多聚磷酸激酶:600U/L、尿苷-胞苷激酶:1200U/L，反应期间控制pH保持在7.0，反应温度30-35℃，反应10小时后，HPLC检测反应上清液中UMP生成量为23.5g/L，纯度70％，胞苷转化率为85％。
HPLC检测条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A相为四丁基磷酸氢铵，B相为乙腈，检测波长260nm，流速1ml/min，柱温30℃，洗脱程序如表1所示。
表1洗脱程序
时间(min)
流动相A(％)
流动相B(％)
0.01
95
5
5
75
25
6
75
25
6.5
95
5
10
95
5
过滤收集的上清液通过大孔强碱性阴离子交换树脂离子交换层析、浓缩、结晶、干燥后制得成品UMP117g，纯度99％，总收率78％。
实施例3、使用固定化细胞制备UMP
底物胞苷80g、六偏磷酸钠300g、ATP5g、MgCl2·6H2O60g，加入5L pH7.0磷酸缓冲溶液中，搅拌均匀，调节pH至7.0。在反应液中加入各酶的固定化细胞，其中活性分别为胞苷脱氨酶：2000U/L、多聚磷酸激酶:800U/L、尿苷-胞苷激酶:1500U/L，反应期间控制pH保持在7.0，反应温度30-35℃。反应15小时后，HPLC检测反应上清液中UMP生成量16.4g/L，胞苷转化率为75％，纯度53％。HPLC检测条件同实施例2。
过滤收集的上清液通过大孔强碱性阴离子交换树脂离子交换层析、浓缩、结晶、干燥后制得成品UMP82g，纯度98％，总收率68％。
实施例4、使用固定化酶制备UMP
底物胞苷120g、六偏磷酸钠250g、ATP10g、MgCl2·6H2O 40g，加入5L pH7.0磷酸缓冲溶液中，搅拌均匀，调节pH至7.0。在反应液中加入各固定化酶，其中活性分别为胞苷脱氨酶：1500U/L、多聚磷酸激酶:1000U/L，尿苷-胞苷激酶:1100U/L，反应期间控制pH保持在7.0，反应温度30-35℃。反应13小时后，HPLC检测反应上清液中UMP生成量27.2g/L，胞苷转化率为83％，纯度65％。HPLC检测条件同实施例2。
过滤收集的上清液通过大孔强碱性阴离子交换树脂离子交换层析、浓缩、结晶、干燥后制得成品UMP136g，纯度98.6％，总收率75％。
实施例5、固定化酶或固定化细胞活性检测
UMP的三种生产用酶的固定化酶或固定化细胞可以循环使用，按照现有技术记载的公知的测定酶活性的方法对UMP的三种生产用固定化酶按1:1:1的质量比混合后循环反应20次进行跟踪检测，结果如图1。
结果显示UMP的三种生产用固定化酶随着循环次数的增加，酶活性逐渐降低。循环反应20次，酶活性仅降低约25％。UMP的三种生产用固定化酶在4℃储存时间一月以上的酶活性也仅降低约20-25％。
此外，UMP的三种生产用酶的固定化细胞的活性随着循环次数的增加或4℃储存时间的延长也仅降低20-25％。
序列表
<110> 杭州唯泰生物药业有限公司
马鞍山唯泰生物技术有限公司
<120> 一种酶法制备尿苷酸的方法
<130> MP1918557
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 885
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgcatccac gttttcaaac cgcttttgcc caacttgcgg ataacttgca atctgcactg 60
gaacctattc tggcagacaa gtacttcccc gctttgttga ccggggagca agtctcatcg 120
ctgaagagcg caacggggct ggacgaagac gcgctggcat tcgcactact tccgctggcg 180
gcggcctgtg cgcgtacgcc attgtcgaat tttaatgttg gcgcaattgc gcgcggtgtg 240
agcggaacct ggtatttcgg tgccaatatg gaatttattg gtgcgacaat gcagcaaacc 300
gttcatgccg aacaaagcgc gatcagccac gcctggttga gtggtgaaaa agcgcttgca 360
gccatcaccg ttaactacac gccttgtggt cactgccgtc agtttatgaa tgaactgaac 420
agcggtctgg atctgcgtat tcatctgccg ggccgcgagg cacacgcgct gcgtgactat 480
ctgccagatg cctttgggcc gaaagatctg gagattaaaa cgctgctgat ggacgaacag 540
gatcacggct atgcgctgac gggtgatgcg ctttctcagg cagcgattgc ggcggcaaac 600
cgttcgcaca tgccttacag taagtcgcca agcggtgtcg cgctggaatg taaagacggt 660
cgtattttca gtggcagcta cgctgaaaac gccgcattca acccgactct gccaccgttg 720
cagggagcgt taattctgtt gaatctcaag ggttatgatt acccggatat ccagcgcgcg 780
gttctggcag aaaaagccga tgcgccgttg attcagtggg atgccacctc cgcaacgctg 840
aaagctctcg gctgtcacag tatcgaccga gtgcttctcg cttaa 885
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agtcgcatca tatgcatcca cgttttcaaa cc 32
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcgcgataga attcttaagc gagaagcact cggtcg 36
<210> 4
<211> 2067
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgggtcagg aaaagctata catcgaaaaa gagctcagtt ggttatcgtt caatgaacgc 60
gtgcttcagg aagcggcgga caaatctaac ccgctgattg aaaggatgcg tttcctgggg 120
atctattcca ataaccttga tgagttctat aaagtccgct tcgctgaact gaagcgacgc 180
atcattatta gcgaagaaca aggctccaac tctcattccc gccatttact gggcaaaatt 240
cagtcccggg tgctgaaagc cgatcaggaa ttcgacggcc tctacaacga gctattgctg 300
gagatggcgc gcaaccagat cttcctgatt aatgaacgcc agctctccgt caatcaacaa 360
aactggctgc gtcattattt taagcagtat ctgcgtcagc acattacgcc gattttaatc 420
aatcctgaca ctgacttagt gcagttcctg aaagatgatt acacctatct ggcggtggaa 480
attatccgtg gcgataccat ccgttacgcg ctgctggaga tcccatcaga taaagtgccg 540
cgctttgtga atttaccgcc agaagcgccg cgtcgacgca agccgatgat tcttctggat 600
aacattctgc gttactgcct tgatgatatt ttcaaaggct tctttgatta tgacgcgctg 660
aatgcctatt caatgaagat gacccgcgat gccgaatacg atttagtgca tgagatggaa 720
gccagcctga tggagttgat gtcttccagt ctcaagcagc gtttaactgc tgagccggtg 780
cgttttgttt atcagcgcga tatgcccaat gcgctggttg aagtgttacg cgaaaaactg 840
actatttccc gctacgactc catcgtcccc ggcggtcgtt atcataattt taaagacttt 900
attaatttcc ccaatgtcgg caaagccaat ctggtgaaca aaccactgcc gcgtttacgc 960
catatttggt ttgataaagc ccagttccgc aatggttttg atgccattcg cgaacgcgat 1020
gtgttgctct attatcctta tcacaccttt gagcatgtgc tggaactgct gcgtcaggct 1080
tcgttcgacc cgagcgtact ggcgattaaa attaacattt accgcgtggc gaaagattca 1140
cgcatcatcg actcgatgat ccacgccgca cataacggta agaaagtcac cgtggtggtt 1200
gagttacagg cgcgtttcga cgaagaagcc aacattcact gggcgaagcg cctgaccgaa 1260
gcaggcgtgc acgttatctt ctctgcgccg gggctgaaaa ttcacgccaa actgttcctg 1320
atttcacgta aagaaaacgg tgaagtggtg cgttatgcac acatcgggac cgggaacttt 1380
aacgaaaaaa ccgcgcgtct ttatactgac tattcgttgc tgaccgccga tgcgcgcatc 1440
accaacgaag tacggcgggt atttaacttt attgaaaacc cataccgtcc ggtgacattt 1500
gattatttaa tggtatcgcc gcaaaactcc cgccgcctat tgtatgaaat ggtggaccgc 1560
gagatcgcca acgcgcagca agggctgccc agtggtatca ccctgaagct aaataacctt 1620
gtcgataaag gcctggttga tcgtctgtat gcggcctcca gctccggcgt accggttaat 1680
ctgctggttc gcggaatgtg ttcgctgatc cccaatctgg aaggcattag cgacaacatt 1740
cgtgccatca gtattgttga ccgttacctt gaacatgacc gggtttatat ttttgaaaat 1800
ggcggcgata aaaaggtcta cctttcttcc gccgactgga tgacgcgcaa tattgattat 1860
cgtattgaag tggcgacgcc gctgctcgat ccgcgcctga agcagcgggt actggacatc 1920
atcgacatat tgttcagcga tacggtcaaa gcacgttata tcgataaaga actcagtaat 1980
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atccgccgct tgcagcggga cacccaggaa cggggccggt caatcgactg gatcatctcc 480
cagtacttgg ctacggttaa accaagctac aaccagttcg ttgagccaag caagaagtat 540
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ccgctcgagt tagccgttga ta 22