阅读说明：本技术 一种超声辅热处理提升肉类品质的方法及基于量化指标的肉品评价方法 (Method for improving meat quality through ultrasonic-assisted heat treatment and meat evaluation method based on quantitative indexes ) 是由 李鹏鹏 卞欢 徐为民 王道营 闫征 邹烨 诸永志 于 2020-05-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种超声辅热处理提升肉类品质的方法,包括如下步骤：A、取新鲜肉品切割成块；B、步骤A所得物料进行超声辅助热处理；C、超声辅热处理完成后对物料进行速冻处理。本发明还提供了用于量化鉴定超声辅热处理后肉类品质的方法,通过如下测定方法综合量化鉴定肉类在超声辅热处理后的品质指标：内源酶活性测定、质构TPA测定、菌落总数的测定、TBARS值测定、羰基含量测定、肌原纤维碎片化指数MFI测定、TCA-溶解肽含量测定。本发明研发得到了适合传统中式炖煮烹饪的黄羽鸡肉原料,既能提升炖煮后鸡肉的口感,又能改善黄羽肉鸡的外观并延长保质期。(The invention discloses a method for improving meat quality by ultrasonic-assisted heat treatment, which comprises the following steps: A. cutting fresh meat into blocks; B. carrying out ultrasonic auxiliary heat treatment on the material obtained in the step A; C. and (5) carrying out quick-freezing treatment on the material after the ultrasonic auxiliary heat treatment is finished. The invention also provides a method for quantitatively identifying the quality of the meat subjected to ultrasonic-assisted heat treatment, which comprehensively quantitatively identifies the quality index of the meat subjected to ultrasonic-assisted heat treatment by the following determination method: endogenous enzyme activity determination, texture TPA determination, determination of colony total number, TBARS value determination, carbonyl content determination, myofibril fragmentation index MFI determination, and TCA-soluble peptide content determination. The invention develops the raw material of the yellow-feather chicken suitable for traditional Chinese stewing and cooking, which not only can improve the taste of the stewed chicken, but also can improve the appearance of the yellow-feather broiler and prolong the shelf life.)

一种超声辅热处理提升肉类品质的方法及基于量化指标的肉 品评价方法

技术领域

本发明涉及一种肉类处理方法，尤其是一种钝化黄羽肉鸡内源酶活性的方 法及应用。

背景技术

肉类包含动物的皮下组织及肌肉等可食用部位，其富含大量的蛋白质和脂 肪，是人类最重要的食物来源之一。按其肉色可分为红肉(猪肉、牛肉、羊肉、 鹿肉、兔肉等)和白肉(鱼肉、禽肉及部分海产品)，其中以禽肉为代表的白肉 肌肉纤维细腻，脂肪含量较低，脂肪中不饱和脂肪酸含量较高，能有效降低心 脑血管疾病的发病率，减轻癌症的威胁，其健康属性已经得到越来越多的消费 者认可，年消费量逐年增加。然而禽肉肉质细嫩，营养丰富，水分含量高，内 源蛋白酶活跃，容易腐败变质和品质劣化，因而低温保鲜技术是目前禽肉保鲜 最常用也是最有效的方法，也是国内外重点研究方向。但是目前禽肉在低温保 鲜过程中仍常出现不同程度的质构劣化，表现为硬度下降、失去弹性，使得禽 肉货架期缩短，影响产品的食用品质和商品价值。

蛋白质是禽肉的重要组成部分，蛋白降解被认为是引起禽肉质构软化的重 要原因。国内外研究者普遍认为家禽死后蛋白质的变化与内源性蛋白酶的降解 作用密切相关，家禽被宰杀放血后，肌肉细胞别无选择地进入细胞凋亡阶段， 半胱天冬氨酸酶、钙蛋白酶、组织蛋白酶等内源蛋白酶迅速激活并诱导产生一 系列的级联系统反应，在水解蛋白的同时也能降解许多其他的细胞基质，导致 细胞骨架崩解，从而出现质构劣化的现象。

目前钝化或杀灭蛋白酶的方法主要分为两种，添加酶抑制剂和热处理。中 国专利文献201510773276.8公开了一种海参保鲜剂及用途，该发明在10℃以下 环境下，将海参浸泡在添加有丝氨酸蛋白酶的高效抑制剂——绿豆胰蛋白酶抑 制剂和基质金属蛋白酶类的高效抑制剂——乙二胺四乙酸二钠的浸泡液中浸泡 1.5h，控制海参的自溶作用。该发明虽然延长了海参自融的发生时间，但是并 未明确内源酶的实际抑制效果，而且仅仅依靠抑制剂也无法达到钝化或者杀灭 内源酶的目的。中国专利文献201210547008.0公开了一种纯鸡肉粉及其制备方 法和应用，以鸡胸脯肉为原料，分两批添加蛋白酶进行酶解，第一批蛋白酶为 风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶中任意一种，第二批蛋白 酶为胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶中任意一种，酶解结束后灭酶条件为80～95℃保 持10～30min。该发明需要杀灭的蛋白酶均为外源蛋白酶，其酶学特性与内源蛋 白酶存在很大差异；而且其最终产品为鸡肉粉，所以在参数选择时无需考虑鸡 肉的熟化程度，灭酶条件剧烈。

中国专利文献201811303042.7公开了适合中餐烹饪方式的黄羽肉鸡原料生 产方法及产品，将黄羽肉鸡整形后放入50～60℃温水中水浴烫漂20～30min， 以达到灭酶的目的。虽然该发明采用热处理灭酶，但是同样没有明确内源蛋白 酶的实际杀灭效果；而且处理时间长，鸡肉容易变暗发白，失去鸡肉原料其鲜 亮的外观，影响产品的商业价值。

超声波是一种频率高于20KHz的声波，它的方向性好，反射能力强，易于 获得较集中的声能，在水中传播距离比空气中远，目前在医学、军事、工业、 农业上可用于测距、测速、清洗、焊接、碎石、杀菌消毒等。中国专利文献 201410405982.2公开了一种超声灭酶装置、灭酶杀菌系统及方法，利用28KHz 超声波对果蔬类液体进行灭酶处理。该发明仅涉及一种用于果蔬类液体的超声 灭酶装置及灭酶杀菌系统，并未涉及具体超声灭酶方法和工艺；而且仅针对果 蔬类液体，适用范围很窄。

质构是肉类最重要的品质指标之一，内源蛋白酶引发的质构劣化极大影响 着肉制品的商业价值。如何利用超声波技术解决此问题，成为肉制品行业持续 健康发展的关键。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种超声辅热处理提升肉类品质的方法及 基于量化指标的肉品评价方法。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。

一种超声辅热处理提升肉类品质的方法，包括如下步骤：A、取新鲜肉品切 割成块，装袋或装盒后封口包装；B、步骤A所得物料在如下条件下进行超声辅 助热处理：温度40-70℃，超声强度0.15-0.30W/cm²，超声频率25-200KHz， 处理时长为5-40min；C、超声辅热处理完成后对物料进行迅速冷藏或速冻处理。

作为本发明的一种优选技术方案，所述肉品为禽肉。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤A中，所述肉品在切割之前首先去 除可见脂肪；切割后清洗干净并沥干水分；包装方式采用真空包装或者真空贴 体包装。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤A中，切割后的肉块分装到真空包 装袋中，并使用真空封口机进行真空包装。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤A中，切割后的肉块分装到微波物 料盒当中。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤B中，超声辅助热处理条件为：温 度45-50℃，超声强度0.20-0.25W/cm²，超声频率为30-100KHz，处理时长为 10-20min。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤B中，超声辅助热处理条件为：温 度48℃，超声强度0.22W/cm²，处理时间为18min。

一种能够量化鉴定超声辅热处理后肉类品质的方法，该方法通过至少如下 测定方法综合量化鉴定肉类在超声辅热处理后的品质指标：内源酶活性测定、 质构TPA测定、菌落总数的测定、TBARS值测定、羰基含量测定、肌原纤维碎片 化指数MFI测定、TCA-溶解肽含量测定。

作为本发明的一种优选技术方案，所述内源酶活性测定包括蛋白酶活性测 定、脂氧酶活性测定。

作为本发明的一种优选技术方案，所述质构TPA测定包含如下三个指标： 硬度值、内聚性、咀嚼性。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：

本发明利用超声波技术的空化作用辅以热处理，对禽肉中的内源蛋白酶进 行了钝化，抑制甚至根除了内源蛋白酶在屠宰加工及储运保鲜过程中对禽肉质 构劣化的影响，保持了禽肉质构稳定，为肉制品加工提供了优质的禽肉原料。 本发明提供的超声波结合温和热处理加工在有效杀灭有害、致病菌和钝化内源 酶的同时，降低了处理温度和时间，能够很大程度地保存食品的新鲜度、营养 价值及风味品质等，从而使货架期得以延长。本发明通过探究超声波辅助热加 工条件，实现了控制储藏过程中的脂肪氧化和蛋白降解。本发明研发得到了适 合传统中式炖煮烹饪的黄羽鸡肉原料，既能提升炖煮后鸡肉的口感，又能改善 黄羽肉鸡的外观并延长保质期，本研究从钝化黄羽肉鸡的内源酶入手，采用超 声波辅助加热处理方式及真空包装工艺，得到了一种超声波辅助加热钝化黄羽 肉鸡内源酶的最佳工艺。

本发明的工艺方法当中，超声波通过一系列压缩波和稀疏波在水中传播， 分别对应形成正负压，并产生正压和负压交替变化的周期，对水分子产生交替 的压缩和拉伸作用。当声波能量足够高时，稀疏波对应产生足够大的负压，如 果负压对气体分子的作用力超过液体分子对气体分子的作用力，原先存在于液 体中的气核从液体中脱离，形成空穴气泡。随着超声波的传播，空穴气泡的体 积迅速增加上千倍，达到临界半径后发生猛烈的内爆，然后立刻恢复至原来的 状态。空穴气泡崩塌时释放出巨大能量，导致局部温度和压力迅速升高，高压 和高温协同效应产生强烈的冲击波和400km/h的微射流。在此超声波的空化作 用下禽肉中的内源蛋白酶活性、底物组成及酶促反应速率均发生改变，抑制内 源蛋白酶对肌肉组织的作用，从而达到保持禽肉质构稳定的目的。

本发明的包装方式采用真空包装或者真空贴体包装。将禽肉真空包装或者 真空贴体包装，抽空包装材料内的空气，使超声波空化作用产生的高压和高温 协同效应能够有效传递给禽肉，在达到钝酶效果的同时，最大限度地降低超声 辅热强度，以维持禽肉的新鲜外观。

根据单因素实验结果，选用Box-Behnken进行试验设计，确定选取过超声 温度A、超声时间B、超声频率C、超声强度D作为变量，以总蛋白酶相对活力 为响应值。利用Design-Expert对各因素回归拟合可分别得到肌肉总蛋白酶相 对活力对自变量超声温度A、超声时间B、超声频率C、超声强度D的回归方程， 即：Y＝36.19-3.34×A-16.26×B-13.64×C-13.08×D-0.01×A×B+0.46×A× C+0.29×A×D+0.94×B×C+1.09×B×D+1.80×C×D-1.88×A²-0.12×B²+1.40 ×C²-5.00×D²。结果发现四个自变量对肌肉总蛋白酶相对活力均有极显著影响 (P＜0.01)，考虑到实际应用，将工艺条件确定为超声温度为45～50℃，超声 时间为10～20min，超声频率为30～100KHz，超声强度为0.20～0.25W/cm²，在 此工艺条件下，肌肉总蛋白酶相对活力均在30％以下，达到较好的钝化效果。所 以选择超声温度为45～50℃，超声时间为10～20min，超声频率为30～100KHz， 超声强度为0.20～0.25W/cm²。

本发明的超声温度为45～50℃；在选择超声温度时，首先要考虑到内源蛋 白酶的最适温度，钙蛋白酶的最适温度为25℃，组织蛋白酶的最适温度为37℃， 所以超声温度必须大于37℃。其次，禽肉在超声辅热过程中其表皮和肌肉组织 的外观不能发生变化，经过前期试验发现，当超声温度低于60℃，短时间内禽 肉的新鲜外观几乎不受任何影响。所以选择超声温度为40～60℃。

本发明的超声时间为10～20min；内源酶钝化过程需要一定时间，常规60℃ 热处理15min后，总蛋白酶残存活力为原来的17.1％。超声辅助热处理能够高效 钝化总蛋白酶活力，60℃超声辅热10min后总蛋白酶已完全失活。但是超声辅 热处理时间也不能过长，禽肉在长时间的热处理过程中，肌肉组织会慢慢变性 凝固，从而影响禽肉新鲜外观。所以选择超声时间为10～40min。

本发明的超声频率为30～100KHz；超声波在水中产生空化作用，空化泡闭 合时会产生基频谐波和分频谐波，这些谐波叠加在一起就组成了空化噪声；其 中分频谐波的频率较低，有可能进入人耳所能听见的频率范围之内，成为噪声 的主要来源。超声频率越高，其分频谐波就能少一些进入人耳，噪声也会相应 减少。但是随着超声频率的增高，空化过程会变得难以发生。当频率增高，则 声波膨胀时间变短，空化核来不及增长到可产生一定空化效应的空化泡，即使 空化泡形成、声波的压缩时间亦短，空化泡可能来不及发生崩溃。所以选择超 声频率为25～200KHz。

本发明的超声强度为0.20～0.25W/cm²；空化作用的强弱是由超声波在液体 介质中消散的强度所决定，因此超声强度越高，造成的空化搅动越强烈，对酶 蛋白结构的破坏性也就越大。然而，噪声的大小是与超声强度成正比的，所以 选择如上超声强度。

另外，本发明以黄羽肉鸡冷藏过程中的质构，蛋白质降解程度，蛋白质及 脂质氧化程度，微生物含量等为指标，实现了对于鸡肉品质的精准量化指标评 价，使得灭活内源酶终止嫩化过程更为精准可控，品控合格的产品更适合中餐 烹饪对口感“有嚼劲”的特殊要求。

附图说明

图1为不同热处理方式下总蛋白酶的失活速率曲线

图2为不同热处理方式下组织蛋白酶B的失活速率曲线

图3为不同热处理方式下钙蛋白酶的失活速率曲线

图4为不同预处理方式下总蛋白酶的失活速率曲线

图5为不同包装方式下中心温度变化曲线

图6显示实施例4中超声辅助热处理对4℃保藏期间鸡肉脂氧酶活性的影 响。

图7显示实施例7中超声辅助热对4℃保藏内鸡肉TBARS值(mg/kg)的影 响。

图8显示实施例8中声辅助热处理对储藏期间鸡肉羰基值的影响。

图9显示实施例10中冷藏过程中鸡肉TCA-溶解肽的变化。

具体实施方式

以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为 常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。

应当理解，当在本申请说明书和所附权利要求书中使用时，术语“包括” 指示所描述特征、整体、步骤、操作、元素和/或组件的存在，但并不排除一个 或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素、组件和/或其集合的存在或添加。

还应当理解，在本申请说明书和所附权利要求书中使用的术语“和/或”是 指相关联列出的项中的一个或多个的任何组合以及所有可能组合，并且包括这 些组合。

另外，在本申请说明书和所附权利要求书的描述中，术语“第一”、“第二”、 “第三”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

在本申请说明书中描述的参考“一个实施例”或“一些实施例”等意味着 在本申请的一个或多个实施例中包括结合该实施例描述的特定特征、结构或特 点。由此，在本说明书中的不同之处出现的语句“在一个实施例中”、“在一些 实施例中”、“在其他一些实施例中”、“在另外一些实施例中”等不是必然都参 考相同的实施例，而是意味着“一个或多个但不是所有的实施例”，除非是以其 他方式另外特别强调。术语“包括”、“包含”、“具有”及它们的变形都意味着 “包括但不限于”，除非是以其他方式另外特别强调。

本发明涉及到的材料&试剂&仪器设备主要试剂：亚油酸购自Sigma公司， 柠檬酸、柠檬酸三钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾等均为分析纯。仪器与设备， 如下表所示：

实施例1

检验检疫合格后的黄羽肉鸡，经宰杀沥血、褪毛、开膛去脏，清洗干净后 沥干水分，装盒后真空贴体包装，进行超声处理(温度为50℃、时间为10min、 频率为45KHz，强度为0.25W/cm²)，超声处理后迅速降温，使其中心温度达到 10℃以下。

实施例2

检验检疫合格后的麻鸭，经宰杀沥血、褪毛、开膛去脏、切块，清洗干净 后沥干水分，装袋后真空包装，进行超声处理(温度为45℃、时间为20min、 频率为100KHz，强度为0.20W/cm²)，超声处理后迅速降温，使其中心温度达到 10℃以下。

实施例3

检验检疫合格后的老鹅，经宰杀沥血、褪毛、开膛去脏、切块，清洗干净 后沥干水分，装袋后真空包装，进行超声处理(温度为50℃、时间为15min、 频率为30KHz，强度为0.25W/cm²)，超声处理后迅速降温，使其中心温度达到 10℃以下。

实施例4

选用品种和大小一致的黄羽肉鸡，屠宰完成后取其胸肉，切成2cm×2cm小 块，真空包装后分别在45℃、50℃、55℃下超声处理(频率为45KHz，强度为 0.22W/cm²)30min，超声处理后迅速降温，使其中心温度达到10℃以下。以未 超声组为对照。测定肌肉中总蛋白酶相对活力、组织蛋白酶B相对活力和钙蛋 白酶相对活力。

结果分析：

1、水浴加热和超声辅助加热对肌肉总蛋白酶活力的影响

热处理和超声辅助热处理后总蛋白酶相对酶活力的变化如图1所示。经过 热处理和超声辅助热处理后，总蛋白酶活力均随处理时间的延长而显著降低。 由图中可以看出从45℃至55℃，同一处理方式下，温度升高，相对酶活力下降。 45℃热处理25min，总蛋白酶活力为初始酶活的16.4％，而55℃下处理15min 后，残存活力就变为原来的17.1％。超声辅助热处理能够高效钝化总蛋白酶活力， 处理时间为10min时，55℃超声联合热处理总蛋白酶已完全失活，50℃超声酶 活力仅剩17.6％，45℃下超声相对酶活为26.1％。相同处理时间下各处理组之间 相对酶活力差异明显(p<0.05)，处理组内部间差异也十分明显。

2、水浴加热和超声辅助加热对组织蛋白酶B活力的影响

采用不同方式对组织蛋白酶B处理30min活力的变化如图2所示。图中显 示了组织蛋白酶B相对活力总体变化趋势相同，相对酶活随时间持续降低，各 处理组均在30min内灭活完全。不同处理间差异明显，45℃热处理下酶活变化 相对缓和，于25min时完全丧失活力，显著滞后于超声辅助热处理各组。45℃ 超声5min，组织蛋白酶B活力下降了89.7％，而热处理组下降率分别为26.5％、 64.6％、83.6％。处理时间为10min时，45℃超声组相对酶活百分率为3.7％，低 于45℃和50℃热处理组，分别为44.8％、7.0％。45℃、50℃和55℃超声辅助下 组织蛋白酶B活力分别于15min、4min、1.25min达到0％，对应温度下用时低于 热处理组，分别为25min、15min、10min。实验条件下两种处理方式相对比，超 声辅助热处理能够在较低温度下短时间内取得较好的钝酶效果。

3、水浴加热和超声辅助加热对钙蛋白酶活力的影响

不同处理方式对钙蛋白酶活力的影响如图3所示。随着处理时间的延长， 热处理组和超声辅助热处理组的钙蛋白酶活力均显著降低。50℃和55℃超声辅 助处理分别在5min、1.75min内酶活钝化完全，与热处理组差异明显。当处理 时间为15min，45℃、50℃和55℃热处理后钙蛋白酶相对活力分别降至34.2％、 28.2％、5.8％，而45℃超声下活力为25.4％，钝化效果与55℃加热、50℃和55℃ 超声相比明显滞后。处理30min后钙蛋白酶几乎完全失活，45℃热处理钝化率 达到98.4％。相比较而言，50℃和55℃超声辅助热处理对钝化钙蛋白酶活力具 有明显优势。

实施例5

选用品种和大小一致的黄羽肉鸡，屠宰完成后劈半，真空贴体包装后超声 处理(温度为50℃、时间为20min、频率为100KHz，强度为0.25W/cm²)，超声 处理后迅速降温，使其中心温度达到10℃以下，放置在0～4℃保藏。以新鲜未 加热为对照，测定其总蛋白酶、组织蛋白酶B、钙蛋白酶及质构特性(硬度和咀 嚼性)。

结果分析：冷藏期间鸡肉总蛋白酶、组织蛋白酶B和钙蛋白酶的活力如表1 所示。对照组鸡肉的三种蛋白酶活性在冷藏期间均不断下降，变化显著。其中 总蛋白酶和钙蛋白酶在第5天活力降至初始酶活的50％以下。处理组在冷藏期间 均未检测到蛋白酶活性，经处理后，内源蛋白酶的灭活率达到100％。表明超声 热处理能够使鸡肉的内源蛋白酶完全失活且不可逆。表2显示了鸡肉在冷藏过 程中的硬度、咀嚼性的质构参数变化。对照组鸡肉在冷藏过程中***，硬度和 咀嚼性下降。超声辅热处理显著改善了鸡肉的质构特性，提高了硬度使质感更 加紧实，减少了内源蛋白酶造成的质构劣化，具有维持贮藏期内质构稳定性的 良好效果。

表1冷藏过程中鸡肉内源蛋白酶的活力变化规律

注：ND代表未检出。

表2冷藏过程中鸡肉质构的变化规律

注：不同字母代表同列差异显著(P<0.05)，*代表U+H处理组与CK对照组差异 显著(P<0.05)。

实施例6

选用品种和大小一致的黄羽肉鸡，屠宰完成后取其胸肉，真空包装后分别 在50℃、50℃+超声、超声处理(超声条件频率为45KHz，强度为0.22W/cm²) 30min，超声处理后迅速降温，使其中心温度达到10℃以下。测定肌肉中总蛋白 酶相对活力。

结果分析：3种方式处理后总蛋白酶相对酶活力的变化如图4所示，总蛋白 酶活力均随处理时间的延长而显著降低。其中50℃+超声处理组在20min后，内 源蛋白酶的灭活率达到100％。而50℃处理组在20min后，总蛋白酶活力为初始 酶活的17.2％；超声处理为初始酶活的40.2％。

实施例7

选用品种和大小一致的黄羽肉鸡，屠宰完成后取其胸肉，切成5cm×5cm小 块，分别真空贴体包装和普通封口包装，进行超声处理(温度为50℃、时间为 15min、频率为30KHz，强度为0.25W/cm²)，超声处理后迅速降温，使其中心温 度达到10℃以下。测定肌肉中心温度。

结果分析：2种方式处理后中心温度的变化如图5所示，中心温度均随处理 时间的延长而显著上升。其中真空贴体包装组在5min后，中心温度达到44℃。 而普通封口包装组在7.5min后中心温度才达到45℃。处理时间缩短33％。

实施例8、酶活性测定试验例

鸡肉内源酶粗提液的制备：称取5g样品至50ml磷酸盐缓冲液(50mmol/L pH7.4)，在冰水浴中10000r/min匀浆2次，每次40s，中间停顿20s，将 匀浆液用四层纱布过滤后，4℃、10000g下离心20min，取上清液经PVDF0.22 μm注射器式过滤器过滤，收集滤液作为粗酶提取液，用BCA法测定蛋白浓度。 每组设置4个平行。

LOX的酶活测定方法；总蛋白酶活检测使用Thermo scientific蛋白酶分析 试剂盒。组织蛋白酶B和钙蛋白酶活测定参照Yang和Fang的方法并。反应液 的配制：组织蛋白酶B缓冲溶液：50mM PB，4mmol/L Na2EDTA(pH6.0)配 制成混合溶液，使用前加入8mmol/L DTT(二硫代苏糖醇)，混匀。钙蛋白酶缓 冲液：150mmol/L Tris-HCl，7.5mmol/L CaCl2，pH6.0。底物溶液：组织蛋 白酶B的特异性荧光底物采用Z-Arg-Arg-AMC，钙蛋白酶采用 N-succinyl-Leu-Tyr-AMC，分别使用DMSO稀释至10mmol/L，保存于-20℃， 临用前稀释为20μmol/L。终止液：50mmol/LTris-HCl，1％SDS，pH7.0。

酶反应实验步骤；取酶液50μL，加入50μL反应缓冲液在30℃下预热 10min，加入50μL20μmol/L的底物溶液，并在30℃下反应15min。加 入1.5mL终止液，之后放入冰浴。空白组在加入终止液后添加酶液。离心取上 清液，在λex＝360nm，λem＝460nm的测定条件下，使用多功能酶标仪对荧光 产物AMC的释放量进行测定。每个酶活单位(U)定义为在反应温度(30℃) 及反应pH下，1min内水解底物并释放1nmol AMC所需的酶量。

实施例9、超声波协同热失活内源酶特性分析试验例

内源酶的失活反应可用一级反应动力学模型分析，公式如下：Ln(At/A0) ＝k·t。式中：A0是初始酶活力，At是在处理时间t(min)时的残存酶活力， k为酶失活速率常数(min-1)。Arrhenius方程常用于评价酶催化反应中温度对 催化过程的影响，具体表现为Ea(反应活化能，kJ/mol)。方程如下：Ln(kT)＝ Ln(C)-Ea/(RT)。式中：T为温度(K)，R为摩尔气体常数(8.314J/(mol·K))， kT是反应速率常数，C是阿伦尼乌斯常数。将速率常数的自然对数Ln(kT)与 温度的倒数1/T作图，从所得线性拟合的斜率中即可求出Ea。DT值是指将初始 酶活力降低90％所用的时间，公式如下：Log(A/A0)＝-(t/DT)。

①鸡肉冷藏过程中蛋白酶活性的变化如下所示。

为了研究超声辅助热处理对鸡肉内源酶的灭活效果，以及酶活性的变化情 况，我们检测了冷藏期间鸡肉总蛋白酶、组织蛋白酶B和钙蛋白酶的活力如表 4-2所示。直接冷藏组的鸡肉，三种蛋白酶活性在冷藏期间均不断下降，变化显 著。其中总蛋白酶和钙蛋白酶在第5天活力降至初始酶活的50％以下。钙蛋白 酶是一种半胱氨酸蛋白酶，能够水解肌原纤维蛋白质，影响鸡肉的质构。干腌 火腿研究中发现，钙激活中性蛋白酶非常不稳定，在成熟早期肉的嫩化过程中 起主要作用，在腌制后期几乎完全失去活性不起作用。相比较而言，贮藏期间 组织蛋白酶B活力的下降速率相对较缓，在第7天仍有56.6％的酶活力。多数研究者认为组织蛋白酶B在质构劣化中起重要作用。ParrenoM等研究表明干腌 火腿组织蛋白酶B的活力最为稳定。陆应林的研究显示，南京板鸭在加工过程 中组织蛋白酶B、L和H的活力均呈现下降趋势。这些研究结论与我们的实验结 果保持一致。

处理组在冷藏期间均未检测到蛋白酶活性，经处理后，内源蛋白酶的灭活 率达到100％。表明本实验条件下，超声辅助热处理能够使鸡肉的内源蛋白酶完 全失活且不可逆。杨静将河豚鱼在70℃处理2min后，实现了蛋白酶的完全灭 活。Verhaeghe等研究发现，褐虾的内源蛋白酶活性经过低温热处理后，活性降 为初始值的20％左右。李艳青等发现鲢鱼组织蛋白酶的活性在85℃的热处理 后基本失活。超声波能够通过空化效应产生剪切力，改变肉中内源酶蛋白的分 子结构使酶失活，同时有效地降低了热处理的温度，减少对肉风味品质的影响。

表4-2冷藏过程中鸡肉内源蛋白酶活性的变化(％)

注：ND代表未检出。

②鸡肉冷藏过程中脂氧酶活性的变化

图6显示了冷藏过程中脂肪氧合酶活力的变化。从图中可以看出，在整个 储藏期间，鸡肉脂肪氧合酶活性呈现先升高后降低的趋势。贮藏期内对照组LOX 的酶活波动幅度较大，在第3天达到最高值。超声辅助热处理处理后LOX活力 显著降低，第0天仅为对照组最高活力的15.6％，且前后变化幅度小，反应出 处理后储藏期内酶活力相对稳定并保持在较低水平。周心雅在研究储藏期兔肉 中LOX的活性时同样发现，酶活力先升后降，不同部位肌肉中的LOX酶活在2-4 天达到峰值。刘奇测定贮藏期内鲟鱼不同部位的LOX酶活性，与本研究所表现 出的趋势相同。这可能与冷藏过程中鸡肉pH值的变化相关，上浆鸡肉片在4℃ 冷藏过程中的pH先下降再上升，从第72h的6.0一直升至6.6，而LOX酶最适 pH为6.0，鸡肉pH的波动造成了脂氧酶活力的变化。

实施例10、质构(TPA)的测定试验例

将肉样切割成大小为1×1×1(cm³)的肉块，用质构仪沿垂直肌纤维方向进 行测定。选择加载程序模式250N，测定参数：测前速度2mm/s，测中速度2mm/s， 测后速度2mm/s，形变量50％，以压缩-时间曲线中的感应力最大值表征硬度。 冷藏过程中质构特性的变化试验结果如下。

质构分析是评价食品质量常用的指标，能够较为全面的评估肉的质地特性。 表4-3显示了鸡肉在储藏过程中的硬度、内聚性、咀嚼性的质构参数变化。

表4-3超声辅助热处理对储藏期间鸡肉质构的影响

注：不同字母代表差异显著(P<0.05)，*代表U+H处理组与CK对照组差异 显著(P<0.05)。

①硬度值；硬度反映了样品受力时产生抵抗力的大小，表示鸡肉的紧致程 度。从表中可以看出，随着储藏时间的延长，对照组鸡肉的硬度显著下降 (P<0.05)，而处理组变化不明显。在储藏期间，未经处理的生肉受到内源酶和 微生物的作用，随着时间的延长，鸡肉中的肌原纤维及胶原蛋白等骨架蛋白被 水解，破坏了鸡肉组织结构，导致质构松散软化，第7天硬度仅为初始时的31％。 经超声辅助热处理后，可以看出，第0天时，处理组略高于对照，这是由于加 热会导致水分流失、蛋白变性，致使肉的硬度提高，但本实验采用温和的热处 理条件，并且结合超声波以后起到很好的嫩化作用。Chemat等和康大成的研究 均证实超声波对肉具有明显的嫩化效果。在储藏第0-7天，处理组样品的硬度 很好的维持在初始值范围内，且变化不明显(P＞0.05)。超声辅助热处理灭活了 组织蛋白酶B等内源蛋白酶和微生物，减少了酶和菌对鸡肉的分解软化，很好 的维持了贮藏过程中鸡肉的硬度品质。

②内聚性；内聚性即凝聚性，反映了鸡肉细胞间结合力的大小，是鸡肉纤 维紧密连接保持完整的一种性质。如表所示，对照组的内聚性值在储藏期间波 动，第0天时最低，第3天和第7天较高。处理组的凝聚性在第0-5天升高， 第7天时稍有回落。内聚性随时间的变化可能是因为宰后鸡肉进入僵直期，真 空包装下的缺氧环境加速了僵直复合物和肌动、肌球蛋白的交联，使鸡肉的内 聚性增加。进入成熟期后，对照组生肉由于微生物和内源酶的作用，肌原纤维 被不断降解，使细胞间结合力减弱，以上因素的综合作用下使得鸡肉的内聚性 值波动变化。后期鸡肉的水分流失也可能是导致内聚性下降的原因。

③咀嚼性：咀嚼性是指固体样品对持续咀嚼的抵抗力，表示鸡肉的柔软度， 数值上约为硬度、内聚力和弹性三者的乘积。如表中所示，贮藏过程中，对照 组咀嚼性呈逐渐减小的趋势，与硬度的变化趋势相同。经显著性分析，对照组 在储藏后期的咀嚼性值明显下降(P<0.05)，第5天和第7天分别降至初始值的 71.6％、58.8％。研究表明，冷藏初期肌肉蛋白的降解主要靠内源性蛋白酶， 后期则是微生物蛋白酶发挥作用。而胶原蛋白等因其形成的交联结构，影响着 鸡肉的组织结构和质地，它的分解导致了肉质结构的疏散。根据4.3.1中的结 果，第5天以后菌落总数明显上升，蛋白降解作用增强，与肉质软化咀嚼性降 低的表现同步。鸡肉咀嚼性的变化是硬度、弹性和凝聚性的综合体现。孙天利 研究贮藏过程中牛肉的咀嚼性发现，随贮藏时间逐渐减小。处理组在0-7天变 化不显著，第3天显示咀嚼性升高可能是由于僵直期肌肉ATP的含量大幅下降， 影响肌肉纤维的紧张程度，增加了鸡肉的咀嚼性。

总的来说，对照组肉在储存过程中***，硬度和咀嚼性下降。超声辅助热 处理显著改善了鸡肉的质构特性，提高了硬度使质感更加紧实，同时减少了微 生物和内源酶造成的质构劣化，具有维持贮藏期内质构稳定性的良好效果。还 可以看出，处理后鸡肉更具内聚性和耐嚼性，黄羽鸡正是因其耐嚼且富有弹性 的质地而备受青睐，这显示出超声辅助热处理方式的优越性。

实施例11、菌落总数的测定试验例

参照GB4789.2-2010《食品卫生微生物学检验菌落总数测定》。在无菌操 作台称取2.00g鸡肉剪碎，并加入18ml灭菌生理盐水，37℃下充分震荡30min， 得到样品悬浊液。根据鸡肉的贮藏时间和新鲜程度，制成适宜的10倍梯度稀释 液。采用平板涂布法，取200μL稀释液均匀涂布PCA平板，待吸收完全，于 37℃倒置培养2d，进行菌落计数。根据对应稀释倍数来确定相应的菌落总数。 超声辅助热处理对鸡肉杀菌效果的研究结果如下。

表4-1冷藏过程中鸡肉菌落总数的变化

注：ND代表未检出。

菌落总数反映了肉制品储藏过程中微生物的生长情况，是肉制品安全评估 的重要标准。根据中国食品安全国家标准(GB/T 9959.2–2008)，食用肉中 微生物总数不应超过6log CFU/g。表4-1为冷藏期内超声辅助热处理和对照组 的菌落总数变化情况。从表中可以看出，处理后鸡肉在整个储藏过程中未检出 微生物的繁殖，表明其货架期至少有9d。而直接冷藏的鸡肉，在第0天初始菌 落总数为2.39log CFU/g，随着储藏时间的延长，微生物总数不断增加。对照 组储藏第5天时，菌落总数达到4.67log CFU/g，升高了2个数量级。第9天 达到6.69log CFU/g超过上限值。张建军对托盘包装鸡肉片冷藏中品质变化的 研究发现，冷藏84h后，鸡肉片菌落总数急剧增加，第96h，达到4.32log CFU/g。 Musavian等的研究表明，超声波结合热蒸汽处理可显著降低鸡肉表面已污染的 弯曲杆菌的活菌数，其数量可较处理前显著下降3log CFU/cm2。本研究显示， 超声辅助热处理具有良好的杀菌效果，可将鸡肉冷藏期限延长2天。

冷藏前进行超声辅助温和热处理可有效杀灭食品中的致病菌，很大程度上 保持食品的新鲜度，同时采用真空包装，可有效减少热处理过程中营养成分的 流失，保持食品的色香味，防止二次污染，是有效又经济的加工保藏方式。

实施例12、TBARS值的测定试验例

参照GB 5009.181-2016《食品安全国家标准食品中丙二醛的测定》。将样 品剔除肌膜和***后制成的肉糜，称取2.00g，准确加入20mL7.5％三氯 乙酸(含0.1％Na2EDTA)，10000rpm匀浆30s后，双层滤纸过滤。向5mL 滤液中加入5mL0.02mol/L硫代巴比妥酸溶液，另取5mL三氯乙酸混合液加 TBA水溶液作为空白，混匀后90℃水浴30min，取出待冷却至室温，以空白样 品调零，于532nm处测定其吸光度。以1,1,3,3-四乙氧基丙烷为标准品绘制标 曲。冷藏过程中TBARS的变化表现如下。

硫代巴比妥酸值(TBARS)反映了以丙二醛(MDA)为代表的次级氧化产物 的含量，与脂质氧化具有较好的相关性，是评价肉制品脂质氧化程度的重要指 标。图7反映了超声辅助热处理对冷藏过程中鸡肉脂质氧化程度的影响。从图 中可以看出，随着储藏时间的延长，TBARS值逐渐增大。处理后鸡肉的TBARS值 升高，但在储藏期间增速缓慢，7天内增幅为33％。未处理组的TBARS值持续 显著升高(P<0.05)，在第3天时，与处理组脂质氧化程度基本一致，之后高于 超声加热组，第7天比处理组高出了23.7％，且与第一天时相比增加了67.8％， 储藏期内对照组增长率为处理组的一倍。Sun等研究发现广式香肠的加工及贮藏中TBARS不断增大。贮藏期内不同部位的兔肉TBARS值也呈现显著上升趋势。 康大成在超声波辅助腌制对牛肉品质的研究中发现，超声波强度、处理时间及 其交互作用对牛肉TBARS值均有极显著的影响。与静止腌制相比，高强度下的 超声波处理(6.23W/cm2)可显著提高TBARS值。本实验选择的超声强度较低 (0.22W/cm2)，故处理后第0天与对照组间的差异不显著，由此对肉制品本身 造成的影响较小。王帮国发现超声处理的白鲢鱼在4℃贮藏5天后，TBARS值 相较对照组降低了24.8％。结合前面的研究结果，超声辅助热处理对鸡肉LOX活性有明显抑制作用，因此可以得出在鸡肉体系中，超声辅助热处理可以有效 抑制脂氧酶引发的脂质氧化，控制储藏过程中鸡肉的脂质氧化进程，有利于鸡 肉的营养成分和风味的保留。

实施例13、羰基含量测定试验例

采用羰基试剂盒检测样品。结果如下所示。

羰基含量的测定能够反映鸡肉中蛋白氧化的程度。超声辅助热处理和对照 组在储藏期间羰基含量的变化如图8所示。由图可知，贮藏过程中鸡肉的羰基 含量呈持续上升趋势，储藏一天内处理组和对照组间差异不显著，但在随后几 天内，羰基含量急剧变化，对照与处理组间差异亦显著(P<0.05)。在第7天时， 对照组羰基含量达到6.87nmol/mg，高出处理组24％。研究显示，超声波作用 下会导致肉品中羰基含量的增加。康大成在探究超声处理对牛肉羰基值的影响 中得出，在相同处理时间下，牛肉羰基值随超声波强度的增大而升高，2.39W/cm²超声波处理30min可显著提高牛肉肌原纤维蛋白羰基值。本试验采用低强度条 件下的超声处理，表现为处理后(第0天)羰基较对照组略微升高，差异不显 著(P＞0.05)。张建梅的研究也表明低强度超声波的处理条件下(<2.39W/cm²)， 鸡胸肉表面羰基含量变化不显著，与本实验中现象一致。

与对照组相比，超声辅助热处理后鸡肉羰基值在储藏期内表现为增速变缓， 表明该处理条件下能够减缓鸡肉中蛋白氧化的程度。在内源蛋白酶的作用下， 鸡肉中肌原纤维蛋白不断分解，造成肉质结构松散化。除此以外，鸡肉中存在 的微生物也能够分泌蛋白酶，参与蛋白水解作用，造成质构劣化。超声辅助热 处理后内源微生物及蛋白酶被有效灭活，可以解释羰基含量变化较之对照组更 小。

实施例14、肌原纤维碎片化指数(MFI)测定试验例

参考Culler等的方法并稍作修改测定样品的MFI：将样品去除肌膜和结缔 组织后切碎，称取2.00g肉糜，加入20mlMFI提取缓冲液(0.1mol/L KCl， 11.2mmol/L KH₂PO₄，8.8mmol/L K₂HPO₄，1mmol/L MgCl₂，1mmol/L EGTA，pH 7.0，4℃)，冰浴匀浆(12000r/min，30s，2次)，冷冻离心(12000g，15min， 4℃)，沉淀加20mlMFI提取缓冲液再次匀浆后离心(12000g，15min，4℃)， 沉淀加25mlMFI提取缓冲液，匀浆，经2层纱布过滤，滤液即为肌原纤维蛋 白(Myofibrillar protein，MP)溶液。MP溶液用考马斯亮蓝试剂盒测定蛋白 质浓度，调整MP浓度为0.5±0.05mg/ml，立即用多功能酶标仪测定其在540nm 处吸光值。公式为MFI＝OD₅₄₀×200。结果如下。

肌原纤维蛋白小片化指数(MFI)指示了宰后肌肉肌原纤维及其骨架蛋白的 完整程度，反映肉制品的质量品质。通过分析鸡肉MFI值能够从宏观上获知贮 藏过程中的蛋白降解情况。

对照组在冷藏7天内，MFI呈不断显著上升趋势(P<0.05)。处理组在前3 天稍有下降(P＞0.05)之后恢复到第0天初始水平，在储藏期间变化不明显。 与4.3.9贮藏过程中TCA可溶性肽含量的变化趋势一致的是，冷藏的前3天处 理组的MFI值高于对照组。这是因为处理时超声波的空化效应和强穿透力将肌 原纤维撕裂为肌节小片，随产生的浸出液流出。第0天仍有部分残留在鸡肉表 面，随贮藏时间的延长鸡肉水分流失，造成处理组冷藏前期的MFI值下降。在 第5天、第7天，对照组的MFI值比处理组分别高出了15％、24％。许多研究 证实，MFI值与肉嫩度显著相关。徐舶等研究表明，MFI越大，肌原纤维内部结 构的破坏程度越大。而MFI值过高对应剪切力下降，在冷鲜肉贮藏过程中表现 为肉质松散、质构劣化，通常与肉中蛋白酶和微生物的分解作用有关。根据4.3.1 和4.3.2的研究，超声辅助热处理的杀菌灭酶效果良好，故能抑制蛋白水解带 来的MFI值升高。Wheeler和Koohmaraie认为宰后肌肉中释放出的内源酶，水 解了肌肉中起稳定肌原纤维结构作用的蛋白质，进而促使了质构变化。Kolczak 等的研究则认为，在成熟过程中，Z线降解，僵直期所形成的结构断裂成由不同 肌节组成的小片。本文在4.3.6冷藏期间质构的研究中发现，对照组的硬度值 在贮藏期内显著下降，后期表现出质构劣化，与MFI所反映的蛋白降解碎片化 指数显著升高相符合。试验结果显示，超声辅助热处理后鸡肉MFI在贮藏期间 的变化较为稳定，在贮藏后期显著低于未处理鸡肉的碎片化指数，表现出较低 的蛋白降解情况，能够显著延缓肌原纤维蛋白结构破坏程度，维持鸡肉组织结 构的稳定。

实施例14、TCA-溶解肽含量的测定

将样品去除肌膜、***后切碎，称量2.00g肉糜，与18mL预冷的5％ 三氯乙酸溶液混合，冰水浴10000r/min匀浆40s，12000r/min离心5min 后取上清液，采用BCA法测定小肽含量。结果如下。

TCA-溶解肽是常用的蛋白水解参数，表征肉制品中肌肉蛋白质的降解情况， 能够体现SDS-PAGE难以分析的低分子肽含量的变化。图9反映了超声辅助热处 理对于贮藏期间鸡肉TCA-溶解肽含量变化的影响。

直接冷藏组的TCA可溶性肽含量在储藏期内持续上升，第7天显著增至初 始值的3倍，含量达到最大值为1.34mgTyr/ml。在储存的前3天，对照样品 所含的TCA可溶性肽含量低于处理组，之后变化幅度增强，显著超过处理组 (P<0.05)。这表明，对照样品含有较高的蛋白酶活性。闫春子研究发现，贮藏 期内草鱼片的TCA可溶性肽含量逐渐上升。等人报道了内源蛋白酶促进了草鱼 香肠中TCA可溶性肽的释放。大量研究表明，在冷藏初期，肌肉蛋白的降解主 要归因于内源性蛋白酶，其催化降解产生的肽段为其他内源酶和微生物提供物质基础，而微生物分泌的蛋白酶也能够加速肌肉蛋白的水解作用。前面4.3.1 的研究中，第3天以后微生物数目显著增加。因此在储藏后期蛋白的降解作用 增强，TCA-溶解肽含量的变化速率高于前期。

处理组在冷藏7天内的TCA可溶性肽含量略有下降，总体变化较小，趋于 稳定，后三天的TCA-溶解肽含量无明显变化(P＞0.05)。这表明，超声辅助热处 理处理的样品在储存过程中蛋白质降解程度较低。热处理会造成汁液流失，而 超声波作用下会诱导产生较高水平的TCA可溶性肽，随渗出液流出。在第0天， 部分渗出液仍残留在鸡肉中。随着保藏时间的延长，渗出液离开鸡肉，导致冷 藏前3天TCA可溶性肽减少。此外，处理组的TCA可溶性肽在储存的前3天中 高于对照组，说明超声辅助热在一定程度上引发了鸡肉蛋白质的降解。Chaijan 发现加热处理过后的鱼糜TCA-溶解肽的含量比未处理的更高。同时超声波引发的机械作用也可能破坏蛋白质分子之间的键并诱导肌原纤维蛋白水解。结果表 明，经过超声辅助加热处理，鸡肉在储藏期间TCA-溶解肽含量的变化显著小于 未处理组，贮藏后期平稳且保持在较低水平。虽然在处理中引起了部分蛋白水 解，但超声辅助热能够灭活蛋白酶和微生物，进一步抑制鸡肉蛋白质在储存期 间的降解，使处理组保持了更好的肉质并延长货架期。与前述实施例的研究结 论相符。

以上所述实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照 前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其 依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特 征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发 明各实施例技术方案的精神和范围，均应包含在本发明的保护范围之内。