去泛素化酶usp28在制备预防或治疗胰腺癌的药物中的用途
阅读说明：本技术 去泛素化酶usp28在制备预防或治疗胰腺癌的药物中的用途 (Application of deubiquitinating enzyme USP28 in preparation of medicine for preventing or treating pancreatic cancer ) 是由 彭小刚 陈磊峰 徐正 邹叶青 邵俊 于 2021-07-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种去泛素化酶USP28在制备预防或治疗胰腺癌的药物中的用途,本发明研究发现,胰腺癌肿瘤组织中USP28表达高于正常胰腺组织,且USP28高表达与胰腺癌患者恶性表型及生存期缩短显著相关；过表达USP28可加速胰腺癌细胞的生长,而下调USP28可抑制胰腺癌细胞在体外和体内的生长；USP28通过加速细胞周期进程和抑制细胞凋亡进而促进胰腺癌细胞生长。从机制上讲,USP28去泛素化并稳定转录因子FOXM1,这是Wnt/β-catenin信号传导的关键介质,USP28介导的FOXM1稳定显著促进β-catenin的入核,进而导致Wnt/β-catenin通路的激活,而FOXM1表达的恢复可减轻USP28下调导致的抗肿瘤作用。去泛素化酶USP28通过增强FOXM1介导的Wnt/β-catenin信号通路活化促进胰腺癌进展的结果,为今后胰腺癌患者的潜在靶向治疗和预防提供强有力的手段。(The invention discloses an application of deubiquitinase USP28 in preparing a medicament for preventing or treating pancreatic cancer, and researches show that USP28 expression in pancreatic cancer tumor tissues is higher than that of normal pancreatic tissues, and USP28 high expression is obviously related to malignant phenotype and shortened survival time of pancreatic cancer patients; overexpression of USP28 accelerates the growth of pancreatic cancer cells, while downregulation of USP28 inhibits the growth of pancreatic cancer cells in vitro and in vivo; USP28 promotes pancreatic cancer cell growth by accelerating cell cycle progression and inhibiting apoptosis. From the mechanism, USP28 de-ubiquitinates and stabilizes the transcription factor FOXM1, which is a key medium for Wnt/beta-catenin signaling, USP 28-mediated FOXM1 stabilization remarkably promotes the nuclear entry of beta-catenin, so that the Wnt/beta-catenin pathway is activated, and the restoration of FOXM1 expression can reduce the anti-tumor effect caused by USP28 down-regulation. The deubiquitinating enzyme USP28 promotes the pancreatic cancer development by enhancing the activation of the Wnt/beta-catenin signal channel mediated by FOXM1, and provides a powerful means for potential targeted treatment and prevention of pancreatic cancer patients in the future.)
技术领域
本发明涉及胰腺癌发病机制的研究领域，具体涉及一种去泛素化酶USP28 在制备预防或治疗胰腺癌的药物中的用途，更具体地涉及一种去泛素化酶 USP28通过稳定FOXM1激活Wntβ-catenin途径促进胰腺癌生长的机制及其在预防或治疗胰腺癌中的应用。
背景技术
胰腺癌(pancreatic cancer,PC)是全球癌症相关死亡的第七大原因。其预后不良主要体现在5年生存率约8％左右，这主要是由于诊断较晚和缺乏有效的治疗方法。因此，更好地理解参与胰腺癌进展的分子机制是确定新靶点和开发治疗胰腺癌新治疗策略的迫切需要。
蛋白质泛素化的改变通常与肿瘤相关。DUBs可抵消E3连接酶的活性，并被认为是调节泛素化的重要分子。因此，它们已经成为肿瘤潜在的治疗靶点。 USP28是DUBs家族的成员，参与细胞增殖、分化、凋亡、DNA损伤修复和应激反应的生理过程。最近的研究表明，USP28表达上调与多种癌症的不良临床预后相关，如结肠癌、非小细胞肺癌和膀胱癌。由于其去泛素化酶活性，USP28 与Myc相互作用，催化Myc去泛素化，从而促进其稳定并促进结肠癌和乳腺癌中的肿瘤细胞生长。然而，USP28在胰腺癌中的生物学功能和表达模式尚不清楚。
FOXM1(叉头盒蛋白M1)作为一种关键的增殖相关转录因子，通过在转录水平激活靶基因的表达来促进肿瘤进展。在多种人类癌症中观察到FOXM1表达升高，抑制FOXM1可显著抑制癌细胞的恶性表型。重要的是，FOXM1是细胞周期进程的关键调节因子，多项研究表明它在胰腺癌生长中也起着关键作用。因此，揭示FOXM1的调节机制将为胰腺癌的发病机制提供新的见解，并为这种致命肿瘤提供新的治疗策略。
发明内容
本发明目的在于确定USP28和FOXM1在胰腺癌进展中的作用，并通过 USP28/FOXM1/β-catenin轴研究胰腺癌的进展，从而为开发针对胰腺癌的生物靶向治疗和预防的药物提供支持，本发明所要解决的技术问题之一是提供一种去泛素化酶USP28在制备预防或治疗胰腺癌的药物中的用途。
本发明提供了一种去泛素化酶USP28在制备预防或治疗胰腺癌的药物中的用途。
所述去泛素化酶USP28通过稳定FOXM1激活Wntβ-catenin途径促进胰腺癌生长。
胰腺癌肿瘤组织中USP28表达高于正常胰腺组织，且USP28高表达与胰腺癌患者恶性表型及生存期缩短显著相关。
过表达USP28可加速胰腺癌细胞的生长，而下调USP28可抑制胰腺癌细胞在体外和体内的生长。
USP28通过促进细胞周期进程和抑制细胞凋亡来促进胰腺癌细胞生长。
USP28去泛素化并稳定FOXM1，这是Wnt/β-catenin信号传导的关键介质，USP28介导的FOXM1稳定显著促进细胞核β-catenin反式激活，进而导致Wnt/β-catenin通路的激活，FOXM1表达的恢复可减轻USP28下调导致的抗肿瘤作用。
本研究确定USP28是胰腺癌中FOXM1的去泛素酶。USP28与FOXM1相互作用，减少FOXM1的多聚泛素化，从而稳定FOXM1，导致Wnt/β-catenin通路的激活。此外，较高的USP28水平与胰腺癌患者的进展和不良预后密切相关。此外，下调USP28表达在体内外均能抑制胰腺癌细胞的生长。这些结果表明USP28 通过增强FOXM1介导的Wnt/β-catenin信号通路活化参与胰腺癌的发病机制。
有益效果
不论在体内还是体外，USP28在胰腺癌细胞的发生和进展过程中都发挥着重要的作用，并且依据USP28在胰腺癌组织中的高表达结果，为今后胰腺癌患者的潜在靶向治疗和预防提供强有力的手段。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1：在胰腺癌患者中，USP28的过表达与预后不良相关。
A，胰腺癌组织和配对正常组织中USP28的代表性H&E和IHC染色(放大×100，插入放大倍数×400).比例尺，50μm。B、102例胰腺癌肿瘤及配对正常组织中USP28 mRNA表达的qRT-PCR分析,**P<0.01。C和D，用蛋白免疫印迹测定胰腺癌组织和配对正常组织中的USP28蛋白水平。以GAPDH作为上样对照。**P<0.01。E和F，Kaplan-Meier图，根据USP28的表达水平，代表102例胰腺癌患者无进展生存率和总生存率的概率。统计分析采用student t检验和Log-Rank检验。
图2：USP28对胰腺癌细胞生长的影响
A和B，胰腺癌细胞株和人正常胰腺导管上皮细胞细胞(H6c7)中USP28 的mRNA和蛋白水平。C-F,CCK-8实验显示过表达(C和D)或下调(E和F)USP28 后胰腺癌细胞增殖情形。*P<0.05,**P<0.01。G-J，转染USP28过表达质粒 -P-USP28(G和H)或干扰质粒-shUSP28(I和J)的胰腺癌细胞集落形成的代表性图像(左)和定量分析(右)。*P<0.05,**P<0.01。K，BxPC-3/shUSP28细胞皮下注射到裸鼠体内，并在指定的时间内测量肿瘤体积；在实验终点，对肿瘤进行解剖、拍照和称重。n＝6，*P<0.05,**P<0.01。L，从USP28表达下调和对照裸鼠分离的肿瘤组织中进行代表性的H&E染色。通过Ki67染色检测USP28表达下调裸鼠肿瘤组织中细胞的增殖情况。计数核ki67阳性细胞比例，定量细胞增殖指数(放大倍数×100，插入放大倍数×400)。**P<0.01。比例尺，50μm。
图3：USP28加速细胞周期进程，抑制细胞凋亡
A-D，分别检测过表达或下调USP28表达后的PC细胞周期。结果用峰值图 (A、C)表示，并计算出G0/G1、S、G2/M期细胞分布(B、D)。*P<0.05。E和F,蛋白免疫印迹显示USP28过表达的AsPC-1细胞(E)或下调USP28表达的BxPC-3 细胞(F)中USP28、PCNA、cyclin D1和CDK4蛋白的表达情形。以GAPDH作为上样对照。结果用散点图表示为凋亡细胞(G)和计算过表达USP28细胞中Annexin-V阳性细胞群百分比(H)。*P<0.05,**P<0.01。结果用散点图表示为凋亡细胞(I)和Annexin-V阳性细胞群(J)在USP28表达下调的细胞中的计算百分比。*P<0.05。K和L,蛋白免疫印记检测USP28过表达AsPC-1细胞(K)或USP28 表达下调的BxPC-3细胞(L)中caspase 3和PARP的总蛋白和其活性形式的表达情形。GAPDH作为上样对照。
图4：USP28激活胰腺癌细胞中的Wnt/β-catenin信号通路
(A),GSEA比较了USP28高表达胰腺癌患者中Wnt靶点的基因集。数据来源于TCGA数据库。NES表示标准化浓缩评分。B和C，经150ng/ml重组人Wnt3a 处理后，在USP28过表达的AsPC-1细胞(B)或USP28表达下调的BxPC-3细胞 (C)中，转染TOP-flash和FOP-flash载体的细胞的相对荧光素酶活性水平显示。*P<0.05。D和E，通过蛋白质免疫印迹检测过表达USP28的AsPC-1细胞(D) 或USP28表达下调的BxPC-3细胞(E)中β-catenin的总蛋白和核蛋白水平。 GAPDH和Histone 3分别作为上样对照。F和G,IF分析用USP28过表达质粒 -P-USP28(G和H)或干扰质粒-shUSP28转导的胰腺癌细胞中β-catenin核水平。绿色信号为对应蛋白染色，蓝色信号为DAPI核DNA染色。H和I,蛋白免疫印迹显示USP28过表达AsPC-1细胞(H)或USP28表达下调的BxPC-3细胞(I) 中USP28、cyclin D1、c-Myc、VEGF和Survivin蛋白的表达情形。GAPDH作为上样对照。J和K,β-catenin抑制剂(XAV-939)处理后，CCK8技术(J)或集落形成分析(K)USP28过表达AsPC-1细胞的生长情况。*P<0.05。
图5：USP28正向调控胰腺癌细胞中的FOXM1蛋白水平
A,USP28表达下调后差异表达基因的热图。B和C,蛋白质免疫印记检测 USP28过表达的AsPC-1细胞(B)或USP28表达下调的BxPC-3细胞(C)中USP28 和FOXM1的表达情形。GAPDH作为上样对照。用FOXM1抑制剂(RCM-1)(D)处理USP28过表达的AsPC-1细胞，用shFOXM1(E)处理USP28过表达的PANC-1 细胞，通过蛋白质免疫印迹检测β-catenin的总蛋白和核蛋白水平。GAPDH 和Histone 3分别作为上样对照。F和G,蛋白质免疫印迹法测定(F)和定量(G) 胰腺癌组织和配对正常组织中的FOXM1蛋白水平。GAPDH作为上样对照。*P<0.05。H，散点图显示，在胰腺癌蛋白水平上USP28与FOXM1呈正相关。I,胰腺癌组织和配对正常组织中USP28和FOXM1代表性IHC染色(放大倍数×100，插入放大倍数×400)。比例尺，50μm。
图6：在胰腺癌细胞中USP28干扰或过度表达的效率。
A和B，蛋白免疫印迹分析BxPC-3和SW1990细胞中转染shNC或shUSP28 后USP28的蛋白质表达水平。GAPDH作为上样对照。C和D，蛋白免疫印迹检测在AsPC-1和PANC-1细胞中转染p-USP28质粒后USP28的蛋白表达水平。GAPDH 作为上样对照。
图7：过表达USP28对胰腺癌细胞生长的影响。
A和B，将AsPC-1/p-USP28细胞皮下注射到裸鼠体内，并在指定的日期测量肿瘤体积；并在实验终点，对肿瘤进行解剖、拍照和称重。n＝6，*P<0.05，**P<0.01。
图8：双荧光素酶报告基因分析过表达USP28或干扰USP28胰腺癌细胞中 的荧光素酶报告基因的活性。
A和B，用TOP/FOP-Flash报告质粒转染干扰USP28/BxPC-3细胞(A)或过表达USP28/AsPC-1细胞(B)，转染后48h通过荧光素酶分析检测报告基因的活性。*P<0.05。
图9：免疫荧光实验检测胰腺癌细胞中USP28干扰或过度表达的效率。
A和B，用p-USP28或shUSP28质粒转染胰腺癌细胞中，免疫荧光检测USP28 的入核水平。红色信号代表相应蛋白质的染色，蓝色信号代表DAPI对细胞核 DNA的染色。
图10：利用XAV-939处理过表达USP28AsPC-1细胞，蛋白免疫印迹显示 USP28、β-连环蛋白、c-Myc和细胞周期蛋白D1的蛋白表达情形。GAPDH作为 上样对照。
图11：蛋白免疫印迹显示FOXM1和β-连环蛋白的表达情形。
A和B，在用RCM-1(A)或shFOXM1(B)处理后，通过蛋白质印迹法检测USP28 过表达的胰腺癌细胞中β-连环蛋白的总蛋白和核蛋白水平。GAPDH和组蛋白3 分别用作上样参照。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
材料和方法
患者和肿瘤标本
匹配的胰腺癌组织和正常胰腺组织标本取自2015-2019年南昌大学第二附属医院普外科收治的102例胰腺癌患者。取下的标本立即置于液氮中速冻，并储存在-80℃下进行进一步分析。所有患者均获得书面知情同意，研究程序经南昌大学第二附属医院伦理与研究委员会批准。表1总结所有患者的临床特征。
细胞系和细胞培养
正常胰腺导管上皮细胞系(H6C7作为对照)和胰腺癌细胞系(AsPC-1、 PANC-1、BxPC-3和SW1990)从美国典型培养物保藏中心(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)购买。细胞系在添加10％胎牛血清和100单位/mL青霉素-链霉素的培养基(Gibco,USA)中，37℃、5％CO2条件下培养。
定量实时聚合酶链反应
用Trizol试剂(美国Invitrogen)从细胞中提取总RNA。实时荧光定量实验采用SYBR Green试剂盒(Clontech Laboratories,USA)和Applied 7900HT快速实时荧光定量仪(Thermo Fisher Scientific,USA) 进行。所用引物如下:
USP28：Forward 5'-ACTCAGACTATTGAACAGATGTACTGC-3'
Reverse 5'-CTGCATGCAAGCGATAAGG-3'；
FOXM1：Forward 5'-ACCGCTACTTGACATGGAC-3'
Reverse 5'-GGGAGGTTCGGTTTTGATGGTC-3'；
GAPDH：Forward 5'-CATACAGGAATGACTTGAC-3'
Reverse 5'-AACAGCGACACCCACTCCTC-3'
蛋白质印迹、免疫组织化学(IHC)和免疫荧光(IF)分析
对于蛋白质印迹分析，等量的细胞裂解物通过SDS/PAGE凝胶电泳分离，电转移到PVDF(Millipore,USA)膜上，并在5％脱脂牛奶中封闭。用指定的一级抗体免疫印迹膜，然后用适当的辣根过氧化物酶结合的抗小鼠/兔(KPL)或抗山羊(北京CoWin Biotech，中国)二抗。免疫反应带用化学发光试剂盒化学发光显色(Pierce,USA)。使用了以下抗体:针对USP28(1:1，000，abcam， ab126604)、细胞周期蛋白D1(1:1,000,Cell Signaling,55506)、CDK4 (1:1,000,Cell Signaling,12790)、PCNA(1:1,000,Cell Signaling,13110)、Cleaved Caspase-3(1:1,000,abcam,ab2302)和Caspase-3(1:1，000)的抗体。
对于IHC染色，匹配的癌性和正常胰腺组织样本被固定、包埋、切片和脱蜡。然后，用无血清蛋白封闭缓冲液(DAKO，USA)将切片封闭30分钟，之后将其与抗USP28(1:1，000，abcam，ab126604)、抗FOXM1(1:200,Cell Signaling, 5346)、Cleaved Caspase-3(1:200,abcam,ab2302)和抗Ki67(1:200,Cell Signaling,2586)一起孵育。对于IF分析，在指定的处理后，用4％多聚甲醛 (PFA)固定细胞，并用0.1％TritonX-100孵育，然后β-catenin(1:100，abcam， ab32572)、抗USP28(1:100，abcam，ab126604)和FOXM1(1:100,CellSignaling, 5436)染色。孵育二抗体后，用DAPI复染细胞核。然后，用激光扫描共聚焦显微镜(Zeiss,Germany)观察细胞。
过表达、shRNA质粒构建和细胞转染
由GenePharma(中国上海)合成了编码USP28或FOXM1的真核表达载体，以及编码针对USP28或FOXM1的短发夹RNA(shRNA)的质粒。然后，根据制造商的说明，使用Lipofectamine 3000(Invitrogen，USA)用这些过表达构建体或shRNA质粒转染胰腺癌细胞。最后用G418筛选并建立稳定转染USP28过表达载体或USP28 shRNA质粒的胰腺癌细胞系。
细胞增殖和集落形成分析
对于细胞增殖试验，在96孔板中培养胰腺癌细胞。在指定的时间点，根据制造商的说明，使用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)测试活细胞。对于集落形成试验，在培养4-6天后选择用过表达或shRNA质粒转染的胰腺癌细胞，然后将其置于6孔板中(每孔2000个细胞)。最后，培养2～3周后，用固定缓冲液 (5％乙酸和5％甲醇)孵育细胞，然后用0.5％结晶紫溶液染色。
流式细胞术分析
细胞周期实验:指数生长期收获PC细胞，70％乙醇固定含1×105个细胞的单细胞悬液。然后使用碘化丙锭染色监测细胞周期，并使用FACScan流式细胞仪(美国BDBiosciences)进行检测。对于细胞凋亡检测，根据制造商的说明，通过膜联蛋白-V异硫氰酸荧光素和碘化丙啶凋亡检测试剂盒(BD Biosciences，美国)评估早期和晚期凋亡细胞。最后，用FACScan流式细胞仪分析染色的细胞。
致瘤性测定和生物发光成像
用萤火虫荧光素酶基因稳定地转染于注射的胰腺癌细胞，并能够通过生物发光成像对肿瘤生长进行定期体内监测。为进行体内致瘤性试验，将 (1×106/100ml PBS)皮下注射到裸鼠(雄性BALB/c-nu/nu，6-8周龄)的腹侧。然后，为了进行体内信号检测，将小鼠用异氟醚麻醉，然后在Lumina系列 IVIS(体内成像系统)仪器(PerkinElmer，MA，USA)中成像。该动物工作已通过南昌大学第二附属医院动物实验伦理委员会审批。
荧光素酶报告基因活性分析
胰腺癌细胞(每孔1×105个细胞)与TOPFlash荧光素酶报告质粒(用于评估β-catenin的转录活性)、pRL-CMV载体以及使用Lipofectamine 3000转染试剂进行过表达研究的shUSP28质粒或USP28载体共转染。转染后48小时收获细胞，用双荧光素酶报告物分析系统(Promega，USA)定量荧光素酶活性。
对于外源性Wnt3a处理，重组人Wnt3a(R&D，5036-WN)在含0.1％FBS的无菌PBS中溶解。向细胞培养物中加入含有150ng/ml重组人Wnt3a的培养基。
液相色谱-质谱/质谱分析
按照前面的描述进行LC-MS/MS分析。通过串联质谱标签(TMT)标记和 LC-MS/MS分析了USP28沉默的胰腺癌细胞和对照细胞。使用含1％蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液(Sigma，USA)从这些细胞中提取了全细胞裂解物，并通过双秦乌头酸法进行了定量。来自胰腺癌和对照细胞的等量蛋白质(100μg)被还原、烷基化，然后用丙酮沉淀。然后将沉淀重新悬浮在200mM四乙基溴化铵中，并用胰蛋白酶消化。然后将获得的样本合并，通过高效液相色谱进行分离，并通过LC-MS/MS进行分析。
共免疫沉淀(Co-IP)和体内泛素化分析
对于Co-IP分析，将细胞裂解物与特异性一抗在4℃孵育过夜，然后与蛋白A/G-Sepharose珠孵育(Santa Cruz，USA)。然后，收集共沉淀蛋白，并通过针对特异性抗体的免疫印迹分析进行鉴定。对于体内泛素化分析，将细胞与前面提到的质粒共转染。转染后，用50μg/mL的蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞12h。最后，按照与Co-IP试验相同的方案裂解细胞以进行蛋白质免疫印迹实验和免疫沉淀。
统计分析
使用GraphPad Prism 6(GraphPad软件，美国)将所有数据表示为平均均数的标准误。使用学生t检验和双尾分布分析了显著差异。生存曲线采用 Kaplan-Meier法计算，显著性采用对数秩检验。P<0.05视为显著。
结果
USP28在人胰腺癌标本中过度表达，与预后不良相关
为了探讨USP28在胰腺癌中的作用，我们检测了102例胰腺癌组织标本及其相应的正常组织中USP28的表达。如图1A所示，免疫组织化学(IHC)结果显示USP28在66.7％(68/102)的胰腺癌组织标本中高表达。此外，实时荧光定量实验数据表明，与正常组织相比，胰腺癌组织中USP28 mRNA的表达明显增加。(图1B)。与USP28 mRNA升高一致，多数情况下USP28蛋白水平明显升高 (图1C和D)。这些结果提示USP28在人胰腺癌组织中表达上调。然后，我们评估了102例胰腺癌患者中USP28表达与临床病理因素之间的关系(表1)。结果显示，USP28的表达与年龄、组织学类型、有无淋巴结转移无显著相关性；但与肿瘤大小(P＝0.017)、TNM分期(P<0.001)和分化程度(P<0.001)显著相关。此外，多变量Cox回归分析表明，USP28高表达是胰腺癌患者生存不良的独立预后因素(表2)。为了研究USP28表达预测胰腺癌患者生存率的有效性，我们分析了 USP28表达水平与胰腺癌患者生存率之间的关系。如图1E和1F所示， Kaplan-Meier分析显示，与USP28表达较低的胰腺癌标本相比，USP28表达较高的胰腺癌标本总体生存率和无病生存率显著较差。总之，这些发现表明USP28 可作为人胰腺癌的一个有价值的新预后因素。
表1.去泛素化酶USP28的表达与临床病理特征的关系
USP28促进体外胰腺癌细胞生长和体内肿瘤进展
实时荧光定量和蛋白质免疫印迹分析显示，与对照H6C7细胞相比USP28 在胰腺癌细胞系中(AsPC-1、PANC-1、BxPC-3和SW1990)中均过表达(图2A和 2B)。USP28在胰腺癌组织和细胞系中频繁高表达促使我们探索其在胰腺癌中的 致癌作用。我们利用内源性USP28表达相对较低的AsPC-1和PANC-1细胞中构 建USP28过表达细胞系(图6)。同时，利用以USP28为靶点的shRNA载体和内 源性USP28表达相对较高的BxPC-3和SW1990细胞构建USP28表达稳定下调细 胞系(图6)。如CCK-8实验所证明的，USP28过表达AsPC-1和PANC-1细胞显 著促进细胞增殖(图2C和2D)。相反，USP28表达稳定下调的BxPC-3和SW1990 细胞生长受到抑制(图2E和2F)。与这些实验结果发现一致，平板克隆形成实 验显示USP28过表达增加了AsPC-1和PANC-1细胞的细胞增殖能力(图2G和 2H)，而USP28下调降低了BxPC-3和SW1990细胞的细胞增殖能力。(图2I和J)。
为了评估USP28对体内肿瘤生长的影响，我们使用USP28表达稳定下调的 BxPC-3细胞在裸鼠中进行皮下成瘤试验。生长5周后，观察到肿瘤体积和重量 增长显著减慢(图2K)；这伴随着细胞增殖的减少(Ki67)(图2L)。此外，与它 们各自的对照相比，USP28过表达胰腺癌细胞导致肿瘤体积和重量显著更快(图 7)。总之，这些数据表明USP28在促进胰腺癌细胞生长和致瘤性中起关键的致 癌作用。
USP28通过促进细胞周期进程和抑制细胞凋亡促进胰腺癌细胞生长
为了研究USP28促进胰腺癌细胞生长的机制，我们检测了USP28对细胞周期进程和细胞凋亡的影响。与对照组相比，在AsPC-1细胞中的过表达USP28 可导致G0/G1期细胞的显著减少和S期细胞的增加(图3A和3B)。相反，BxPC-3 细胞中的USP28表达下调对细胞周期进程具有相反的作用(图3C和D)。此外， USP28的过表达增强了增殖细胞核抗原，细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白依赖性激酶4的表达(图3E)，而USP28表达下调抑制了这些关键细胞周期调节因子的表达(图3F)。此外，流式细胞术分析显示USP28过表达降低了AsPC-1 细胞的早期和晚期凋亡(图3G和H)；然而，BxPC-3细胞中的USP28表达下调增加了细胞凋亡诱导(图3I和J)。USP28对细胞凋亡的抑制作用进一步表现为USP28过表达细胞中caspase-3和PARP裂解型蛋白表达的降低(图3K)；然而，USP28表达下调显示出这些凋亡因子的表达增强(图3L)。因此，这些结果表明USP28通过促进细胞周期进程和抑制细胞凋亡来促进胰腺癌细胞生长。
Wnt/β-catenin作为USP28的下游信号通路，参与USP28在胰腺癌细胞中的作用
为了探究USP28介导的胰腺癌发生的潜在机制，我们首先在TCGA数据库 中进行了基因集合富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)，以探索USP28与多种信号通路之间的可能关联。如图4A所示，Hallmark_Wnt_Targets 基因组在USP28高表达的胰腺癌样本中明显富集，说明WNT通路与胰腺癌中 USP28高表达密切相关。然后，我们检测改变USP28表达后Wnt/β-catenin 信号通路的激活情况，如图4B和C所示，经150ng/ml重组人Wnt3a处理后， 我们发现AsPC-1细胞中USP28表达增加显著提高了TOP-Flash报告因子的活 性；而USP28表达下调导致TOP-Flash报告因子的活性降低。此外，在缺乏重 组人Wnt3a的BxPC-3细胞中，USP28表达下调也抑制了TOP-Flash报告基因的 激活(图8)。重要的是，与对照组细胞相比，过表达USP28的胰腺癌细胞中核 β-catenin水平显著增加，在USP28表达下调细胞中减少(图4D和4E)。然而， USP28表达的改变对胰腺癌细胞中总β-catenin的表达水平没有影响(图4D 和4E)。因此，通过免疫荧光实验进一步证实过表达USP28和下调USP28表达 的胰腺癌细胞中核β-catenin表达的变化(图4F和4G)。此外，免疫荧光结果 显示USP28在过表达和下调USP28表达的胰腺癌细胞中表达(图9)。过表达 USP28也增加了Wnt/β-catenin靶基因的表达:cyclind1、c-Myc、VEGF、 survivin(图4H)是，这些基因是细胞增殖和凋亡相关的关键基因。相反，下调 USP28表达导致这些基因表达减少(图4I)。
接下来，我们使用β-catenin的特异性抑制剂XAV-939来抑制USP28过 表达细胞中的Wnt/β-catenin信号通路。有趣的是，XAV-939显著抑制了过表 达USP28导致的胰腺癌细胞增殖能力的增强(图4J和4K)。此外，我们的数据 显示，在过表达USP28的胰腺癌细胞中，表达增加的c-Myc和cyclin-D1被 XAV-939显著消除(图10)。综上所述，这些结果表明Wnt/β-catenin信号通 路对于USP28介导的胰腺癌进展至关重要。
USP28通过调控FOXM1的表达激活Wnt/β-catenin信号通路
为了确定USP28激活胰腺癌细胞中Wnt/β-catenin信号通路的潜在机制，我们在USP28表达下调的胰腺癌细胞中进行了基于TMT的LC-MS/MS分析的大规模蛋白质组学实验。我们发现FOXM1蛋白在USP28表达下调的胰腺癌细胞中表达显著下调(图5A)。进一步的研究发现，FOXM1蛋白水平在USP28过表达的细胞中显著升高，而在USP28表达下调的细胞中明显降低，从而表明USP28正向调控FOXM1蛋白水平(图5B和5C)。重要的是，据报道FOXM1增强了胰腺癌细胞中的β-catenin核定位和转录活性。因此，我们推测USP28通过增强FOXM1 在胰腺癌细胞中的表达来激活Wnt/β-catenin信号通路。
与预期的一样，USP28过表达显著增加了核β-catenin表达水平，而 Robert CostaMemorial药物-1(FOXM1的小分子抑制剂)则降低了核 β-catenin表达水平(图5D)。FOXM1沉默也抑制了USP28过表达胰腺癌细胞核 β-catenin表达水平(图5E)，表明FOXM1可参与USP28介导的Wnt/β-catenin 信号通路的激活。此外，抑制FOXM1可以逆转usp28过表达PC细胞中核 β-catenin强度的增加(图11)。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。