一种双链rna复合物auk及其在疫苗制备中的应用
阅读说明：本技术 一种双链rna复合物auk及其在疫苗制备中的应用 (Double-stranded RNA compound AUK and application thereof in vaccine preparation ) 是由 郭芳芳 徐福洲 曹晓亚 章振华 史爱华 崔一芳 于 2020-07-03 设计创作，主要内容包括：本发明涉及疫苗制备,具体涉及一种双链RNA复合物AUK及其在疫苗制备中的应用。本发明提供的双链RNA复合物,包含0.5-20mg/ml Poly A、0.5-20mg/ml Poly U和0.2-80mg/ml卡那霉素。该复合物能够有效激活鸡的免疫系统,增强抗原的免疫效力,有望作为禽类特异性TLR3激动剂用于制备疫苗佐剂。(The invention relates to vaccine preparation, in particular to a double-stranded RNA compound AUK and application thereof in vaccine preparation. The double-stranded RNA compound provided by the invention comprises 0.5-20mg/ml of Poly A, 0.5-20mg/ml of Poly U and 0.2-80mg/ml of kanamycin. The compound can effectively activate the immune system of chicken and enhance the immune efficacy of antigen, and is expected to be used as a poultry specific TLR3 agonist for preparing vaccine adjuvants.)
技术领域
本发明涉及疫苗制备，具体涉及一种双链RNA复合物AUK及其在疫苗制备中的应用。
背景技术
1925年法国免疫学家Gaston Ramon发现，在疫苗中加入某些与疫苗有效成分无关的物质能够特异性的增强机体对相应病原的免疫应答反应。先于抗原或与抗原混合同时免疫动物，能增强机体对该抗原的特异型免疫应答的物质被称为佐剂或免疫增强剂。性能优良的佐剂和免疫增强剂能够显著提高传统疫苗和基因工程疫苗的免疫活性、降低接种成本、改善疫苗应答水平。佐剂可以通过激活先天免疫应答，增加抗原提呈效率，因此使用佐剂提高疫苗效力是一种经济可靠的方法，对疫苗的生产研究具有重大的社会效益。在畜牧业的发展中，各种动物传染病的流行给畜牧业带来严重的经济损失，兽用疫苗的使用，有效防止了畜禽传染病对养殖业造成的损失，而免疫佐剂也广泛应用于兽用疫苗中，例如目前严重危害家禽养殖业的禽流感，在研制的灭活疫苗中均使用免疫佐剂。
我国自主研发的商品化佐剂较少，很多动物疫苗研发和生产一部分依赖进口佐剂；另一部分使用传统的白油佐剂。白油佐剂的免疫增强功能较好但是毒性强，易破坏动物的肉质；传统的白油乳化法工艺繁琐，设备要求高，增加了企业能耗，延长了疫苗的生产周期和增加了成分。一部分效果较好的新型疫苗佐剂如CpG佐剂、微囊化ISCOM和脂质体等佐剂对设备及工艺要求较高。因此，需要开发一种安全性高、免疫性强、低成本、环保性好的新型动物疫苗佐剂。
在病原体感染早期，先天免疫首先被激活，由模式识别受体(Pattern-recognition receptors,PRR)识别病原体相关分子模式(Pathogen associatedmolecular patterns,PAMP)，激活树突状细胞分泌大量I型干扰素(IFNα/β)；激活专职性抗原提呈细胞(如树突状细胞DC、单核/巨噬细胞、B细胞等)呈递抗原给T细胞激活适应性免疫应答等。胞质区PRR Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)是脊椎动物中一个保守的PRR家族，可以识别病原，在启动先天免疫反应中起着至关重要的作用。由TLRs介导的PAMP识别可诱导快速炎症反应。TLR3是细胞内受体，又被称之为抗病毒TLRs，识别细胞内外源双链RNA。TLR3表达于多种细胞类型，如髓样树突状细胞(DC)、巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、神经细胞、成纤维细胞、内皮细胞、肥大细胞和上皮细胞。TLR3激动剂主要是双链RNA(dsRNA)，已经被证明能有效增强DC介导的免疫反应。
Poly I:C作为病毒dsRNA的类似物，具有强大的抗病毒和抗癌潜力。Poly I:C是多种识别受体(PRR)的配体，其中包括蛋白激酶R、视黄酸诱导基因-I(RIG-I)、黑色素瘤分化相关基因5(MDA5)和Toll样受体(TLR3)。然而，Poly I:C诱导的细胞因子风暴在一些肿瘤治疗患者中引起了严重的毒性副作用，包括休克、肾功能衰竭、凝血疾病和超敏反应，因而限制了Poly I:C在临床的应用。Poly I:C的化学结构并不稳定，容易被含有RNase酶的体液降解，其半衰期仅为几分钟，低剂量使用时无法有效激活免疫系统，这进一步限制了其在疫苗佐剂中的应用。
发明内容
为弥补上述领域存在的不足，本发明提供一种双链RNA复合物，该复合物能够有效激活实验鸡的免疫系统，增强抗原的免疫效力。
本发明提供的双链RNA复合物，其特征在于，包含0.5-20mg/ml Poly A、0.5-20mg/ml Poly U和0.2-80mg/ml卡那霉素。
在本发明的优选实施例中，所述双链RNA复合物由1.02mg/ml Poly A、0.98mg/mlPoly U和1.6mg/ml硫酸卡那霉素组成。
本发明还提供所述双链RNA复合物的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)使用磷酸盐缓冲液分别配制Poly A溶液、Poly U溶液和卡那霉素溶液，并水浴加热至40-60℃；
(2)然后混合Poly A溶液、Poly U溶液和卡那霉素溶液，并将混合物置于40-60℃水浴中孵育30min；
(3)取出混合物并置于0℃孵育1小时，过滤除菌，即得。
在本发明的优选实施例中，所述步骤(1)中，称取Poly A 0.1132g，加入49mlpH7.2 10mM PBS中，溶解后得Poly A溶液；称取Poly U 0.1152g，加入49ml pH7.2 10mMPBS中，溶解后得Poly U溶液；用pH7.2 10mM PBS配制80mg/ml硫酸卡那霉素溶液；所述步骤(2)中，将Poly A溶液、Poly U溶液和硫酸卡那霉素溶液按照0.49：0.49：0.02的体积比混合。
本发明还提供一种免疫佐剂，其特征在于，包含本发明所述的双链RNA复合物。
在本发明的优选实施例中，所述免疫佐剂含有1mg/ml本发明所述的双链RNA复合物、2.25mg/mlα-生育酚、10mg/ml吐温80和10mg/ml司盘80。
所述双链RNA复合物或所述免疫佐剂在疫苗制备中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还提供一种疫苗，其特征在于，包含抗原以及所述免疫佐剂。
在本发明的一些实施例中，所述抗原为灭活病毒。
在本发明的优选实施例中，每300μl疫苗中含有100μl所述双链RNA复合物，100μl毒价为107.5EID50/0.1ml的灭活病毒，0.45mgα-生育酚，2mg吐温80和2mg司盘80，体积不足部分使用无菌的磷酸盐缓冲液补齐。
本发明还提供所述疫苗的制备方法，其特征在于，将抗原与所述免疫佐剂按照1:2的体积比混合后，强力搅拌均匀即可。
本发明根据TLR3激动剂的结构特点，在Poly A和Poly U退火合成过程中加入卡那霉素，混合后在40-60℃水浴中孵育30分钟，促使三种化合物形成了一种结构稳定的复合物，命名为AUK。
血清稳定性实验结果表明，在鸡血清中，AUK可稳定存在4天，Poly A:U和Poly I:C只能稳定存在1天。血清中含有RNase，能够降解dsRNA。不同物种血清中的RNase活性不同，在已知常见畜牧动物中鸡血清中的RNase的活性最强。AUK同Poly A:U和Poly I:C相比，在鸡血清中的稳定性大幅增强。这表明卡那霉素能有效地增加Poly A:U的稳定性，两者的复合物AUK适用于禽类疫苗佐剂的开发。
CCK-8细胞毒性试验结果显示，使用20μg/ml AUK对CEF细胞进行不同时间的处理后，各处理时间的细胞活力同PBS对照组相比均无明显差异。这表明AUK对CEF细胞无明显毒性。
本发明使用H9N2作为抗原来评估复合物AUK在鸡免疫实验中的效果。结果表明，AUK能有效激活实验鸡的免疫系统，增强H9N2灭活病毒的免疫效力，同α-生育酚、吐温80和司盘80制成的水包油佐剂疫苗对实验鸡的攻毒保护率高于传统油佐剂灭活疫苗。因此，本发明的复合物AUK有望作为禽类特异性TLR3激动剂用于制备疫苗佐剂和免疫调剂。
附图说明
图1.复合物AUK的琼脂糖凝胶电泳图；图中，M为DNA Marker，从上到下条带大小分别是2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；1为Poly I:C，2为Poly A:U，3为AUK。
图2.复合物AUK的紫外吸收光谱图；图中，横坐标为紫外光波长(nm)，纵坐标为紫外光吸收值。复合物AUK的紫外吸收峰值在260nm处。
图3.复合物的血清稳定性实验结果；
AUK-鸡血清、AUK-鼠血清、AUK-猪血清分别是复合物AUK在鸡血清、鼠血清、猪血清中的稳定性实验结果；其中C代表未经聚合处理的Poly A和Poly U的单体混合物；0为阴性对照，即未经过血清处理的复合物AUK；1-7分别为复合物AUK加入血清后1-7天定时取样的样品；
AU-鸡血清、AU-鼠血清、AU-猪血清分别是Poly A:U在鸡血清、鼠血清、猪血清中的稳定性实验结果；其中C代表未经聚合处理的Poly A和Poly U的单体混合物；0为阴性对照，即未经过血清处理的Poly A:U；1-7分别为Poly A:U加入血清后1-7天定时取样的样品；
IC-鸡血清、IC-鼠血清、IC-猪血清分别是Poly I:C在鸡血清、鼠血清、猪血清中的稳定性实验结果；其中C代表未经聚合处理的Poly I和Poly C的单体混合物；0为阴性对照，即未经过血清处理的Poly I:C；1-7分别为Poly I:C加入血清后1-7天定时取样的样品。
图4.复合物的细胞毒性试验结果；横坐标表示处理时间(小时)，纵坐标表示细胞在450nm处的吸光度(OD450)；比较了AUK(20μg/ml)、Poly A:U(20μg/ml)、Poly I:C(20μg/ml)、PBS对鸡胚成纤维细胞(CEF)增殖的影响。
图5.复合物AUK作为免疫佐剂对H9N2灭活病毒的免疫效力的影响；图中，横坐标是使用疫苗对实验鸡进行一次免疫后的时间(周)，纵坐标是实验鸡血清中的抗体含量；比较了Poly A:U组、AUK组、AUK+Ve组、抗原组、白油组、PBS组的疫苗在免疫实验鸡后8周内实验鸡血清中的抗体含量变化。
图6.复合物AUK作为免疫佐剂对细胞因子IL-1β水平的影响；图中，横坐标表示处理组，纵坐标表示实验鸡血清中IL-1β的含量(ng/L)；比较了Poly A:U组、AUK组、AUK+Ve组、抗原组、PBS组、白油组的疫苗在免疫实验鸡后第2周实验鸡血清中的IL-1β水平。
图7.复合物AUK作为免疫佐剂对细胞因子IFN-β水平的影响；图中，横坐标表示处理组，纵坐标表示实验鸡血清中IFN-β的含量(ng/L)；比较了Poly A:U组、AUK组、AUK+Ve组、抗原组、PBS组、白油组的疫苗在免疫实验鸡后第2周实验鸡血清中的IFN-β水平。
图8.复合物AUK作为免疫佐剂对细胞因子IFN-γ水平的影响；图中，横坐标表示处理组，纵坐标表示实验鸡血清中IFN-γ的含量(ng/L)；比较了Poly A:U组、AUK组、AUK+Ve组、抗原组、PBS组、白油组的疫苗在免疫实验鸡后第2周实验鸡血清中的IFN-γ水平。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步描述本发明，需要声明的是，下述实施例仅作为对本发明的解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。
生物材料
H9N2亚型禽流感病毒：已知病毒，记载在公知文献Homme and Easterday,1970P.J.Homme,B.C.Easterday Avian influenza virusinfections.I.Characteristics of influenza A-Turkey-Wisconsin-1966virus AvianDis,14(1970),pp.66-74中。
以下实验中使用的H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)由北京市农林科学院章振华课题组保存和赠予。禽流感H9亚型病毒WD株，由章振华课题组在1998年从河北省保定望都肉种鸡场发病鸡的肝、脾、肺、气管等组织中用SPF鸡胚分离获得；原始毒株经过鸡胚终点稀释法结合ND抗血清中和，得到纯化的WD株毒种。对禽流感H9亚型WD株毒种进行了系统鉴定结果表明，该毒种的HA价为1：29-1：210，毒价为107.0-108.3EID50/0.1ml，用该毒种接种3周龄的SPF鸡，不能引起鸡只出现可见临床症状，对6周龄SPF鸡的IVPI为0，属低致病力AIV。该毒种的血凝活性可被AIV(H9)阳性血清所抑制，而不能被AIV H5、AIVH7、ND及EDS阳性血清所抑制，该毒株具有良好的免疫原性，该毒株纯净，无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染，用电镜观察，病毒粒子大多为圆形或卵圆形，直径100um左右，还可见丝状、勺状、不规则形状的病毒粒子。将分离物送国家流感中心鉴定为H9N2亚型AIV。该病毒材料本实验室亦有保存，申请人声明，可自申请日起二十年内向公众发放用于必要的验证试验。
实验中使用的SPF鸡和鸡胚(无特定病原体，Gallus gallus)购自Merial公司(梅里亚有限责任公司)，SPF鸡为4周龄，鸡胚为9～11日龄鸡胚。鸡胚成纤维细胞(CEF)采用标准程序(Beug,Hartmut,et al."Chicken hematopoietic cells transformed by sevenstrains of defective avian leukemia viruses display three distinct phenotypesof differentiation."Cell 18.2(1979):375-390.)制备得到。使用DMEM培养基(GibcoThermo Fisher，CA)培养CEF细胞，添加10％热灭活胎牛血清(FBS；Gibco Thermo Fisher，CA)、4mM L-谷氨酰胺(Thermo Fisher，CA)。
本研究中SPF鸡和鸡胚的实验使用严格按照2015年9月8日在北京市农林科学院畜牧兽医研究所批准的动物护理和实验伦理委员会的要求进行。
主要试剂
Poly A：聚腺苷酸，别名多聚腺苷酸，购自上海源叶生物，货号：S18189-1g。
Poly U：聚尿苷酸，别名多聚尿苷酸，购自上海源叶生物，货号：S18190-1g。
Poly I：聚肌苷酸，别名多聚肌苷酸，CAS号：30918-54-8，购自上海源叶生物，货号：S18187-1g。
Poly C：聚胞苷酸，CAS号：30811-80-4，购自上海源叶生物，货号：S64345-1g。
Poly I:C，中文名：双链聚肌胞苷酸，别名：聚肌苷酸-聚胞苷酸，CAS号：24939-03-5，分子式：C19H27N7O16P2，购自上海源叶生物，S18188-1g。
硫酸卡那霉素：别名卡那霉素硫酸酯，CAS号：25389-94-0，经验分子式：C18H36N4O11·H2O4S，购自Sigma-Aldrich，货号：K1377，来源于卡那霉素链霉菌。
α-生育酚，CAS号：10191-41-0，购自Sigma-Aldrich，货号258024-5G。
吐温80，CAS号：9005-65-6，购自Sigma-Aldrich，货号59924-100G-F。
司盘80：又名斯盘80，英文名Span 80，CAS号：1338-43-8，购自Sigma-Aldrich，货号85548-250ML。
溶液制备
Poly A储液：称取Poly A 0.1132g，加入49ml PBS(10mM，pH7.2)中，溶解后作为Poly A储液。
Poly U储液：称取Poly U 0.1152g，加入49ml PBS(10mM，pH7.2)中，溶解后作为Poly U储液。
Poly I储液：称取Poly I 0.1152g，加入49ml PBS(10mM，pH7.2)中，溶解后作为Poly I储液。
Poly C储液：称取Poly C 0.1132g，加入49ml PBS(10mM，pH7.2)中，溶解后作为Poly C储液。
Poly A:U溶液：由本实验室使用Poly A(聚腺苷酸，上海源叶生物，货号：S18189-1g)和Poly U(聚尿苷酸，上海源叶生物，货号：S18190-1g)制备而得。制备方法如下：将PolyA储液和Poly U储液水浴加热至50℃后，按照1：1的体积比混合，将混合物置于50℃水浴孵育30分钟，然后置于0℃孵育1小时，最后使用0.22μm的无菌过滤器过滤除菌。所得Poly A:U溶液的浓度为2mg/ml。
Poly I:C溶液：用PBS(10mM，pH7.2)配制2mg/ml的Poly I:C溶液。
磷酸盐缓冲液(10mM PBS，pH7.2)：分别称取8g NaCl、0.2g KH2PO4、2.9gNa2HPO4·12H2O、0.2g KCl，加蒸馏水溶解后，定容至1000mL，121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却至室温后使用。
若未特别说明，以下实施例所使用的试剂均为本领域常规试剂，可商购获得或按照本领域常规方法配制而得，规格为实验室纯级即可。若未特别说明，以下实施例所使用的实验方法和实验条件均为本领域常规的实验方法和实验条件，可参考相关实验手册、公知文献或厂商说明书。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
实施例1.复合物AUK的制备
称取Poly A 0.1132g，加入49ml PBS(10mM，pH7.2)中，溶解后作为Poly A储液；称取Poly U 0.1152g，加入49ml PBS(10mM，pH7.2)中，溶解后作为Poly U储液；用PBS(10mM，pH7.2)配制80mg/ml硫酸卡那霉素储液。将配好的Poly A储液、Poly U储液和硫酸卡那霉素储液水浴加热至50℃后，混合三种储液，使混合物中Poly A：Poly U：硫酸卡那霉素的储液体积占比为0.49：0.49：0.02，得到的每1ml制剂中含有Poly A(1.02mg)，Poly U(0.98mg)，硫酸卡那霉素(1.6mg)。将混合物置于50℃水浴孵育30分钟，然后置于0℃孵育1小时，最后使用0.22μm的无菌过滤器过滤除菌，即得复合物，命名为AUK。所得AUK溶液的浓度为2mg/ml(硫酸卡那霉素为稳定剂，未纳入浓度计算)。
实施例2.复合物AUK的性质检测
1、分子量检测
使用1.5％琼脂糖凝胶电泳分析化合物的分子量大小。RNA加载缓冲液(RNAloading buffer)(Thermo Fisher)，DL2000分子标记(DL2000 Marker)(0.2-2KB，Takara)用于估算样品大小分布范围。琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，1为Poly I:C溶液(2mg/ml)，2为Poly A:U溶液(2mg/ml)，3为AUK溶液(2mg/ml)。复合物AUK的长度分布在500-1200bp之间，分子量范围在340-816KDa之间。Poly A:U和Poly I:C的长度和分子量同AUK接近。
2、紫外吸收光谱检测
使用酶标仪(Biotek SynergyTMH1)对复合物AUK进行230nm-300nm范围的光谱扫描，检测其紫外吸收光谱。结果如图2所示，复合物AUK的紫外吸收峰值在260nm处。
3、血清稳定性实验
取鸡血清(从购买自Merial公司的SPF鸡中自行采集分离)、小鼠血清(索来宝，货号：C1201)和猪血清(Thermo Fisher，货号：26250084)，检测复合物AUK在血清中的稳定性。
检测方法如下：
AUK组：向实施例1制备的AUK溶液(2mg/ml)中加入20％终浓度的血清(血清占总体积的20％)，放置于37℃孵育，每天定时取样，连续7天，最后将收集的所有样品进行1％琼脂糖凝胶电泳分析，对复合物的完整性进行评估。未经过血清处理的AUK溶液(2mg/ml)作为阴性对照。未经聚合处理的Poly A和Poly U的单体混合物(将Poly A储液与Poly U储液按照1:1的体积比混合)作为对照。
Poly A:U组：向Poly A:U溶液(2mg/ml)中加入20％终浓度的血清(血清占总体积的20％)，放置于37℃孵育，每天定时取样，连续7天，最后将收集的所有样品进行1％琼脂糖凝胶电泳分析，对复合物的完整性进行评估。未经过血清处理的Poly A:U溶液(2mg/ml)作为阴性对照。未经聚合处理的Poly A和Poly U的单体混合物(将Poly A储液与Poly U储液按照1:1的体积比混合)作为对照。
Poly I:C组：向Poly I:C溶液(2mg/ml)中加入20％终浓度的血清(血清占总体积的20％)，放置于37℃孵育，每天定时取样，连续7天，最后将收集的所有样品进行1％琼脂糖凝胶电泳分析，对复合物的完整性进行评估。未经过血清处理的Poly I:C溶液(2mg/ml)作为阴性对照。未经聚合处理的Poly I和Poly C的单体混合物(将Poly I储液与Poly C储液按照1:1的体积比混合)作为对照。
结果如图3所示，在鸡血清中，AUK可稳定存在4天，Poly A:U和Poly I:C只能稳定存在1天；在小鼠血清中，AUK和Poly I:C可稳定存在7天，Poly A:U只能稳定存在2天；在猪血清中，AUK可稳定存在4天，Poly I:C可稳定存在7天，Poly A:U只能稳定存在1天。
4、细胞毒性试验
鸡胚成纤维细胞(CEF)是从鸡胚中制备的原代细胞并可表达TLR3受体，因此本实验中使用CEF细胞评估复合物AUK的细胞毒性，利用CKK-8比色法检测复合物AUK对CEF细胞增殖的影响。
(1)按照下列方法制备CEF细胞
a.用照蛋器照鸡胚(购买自Merial公司)，观察鸡胚是否是活的；
b.将鸡蛋气室部蛋壳用酒精棉消毒后放在50mL离心管架上，用大镊子无钳端敲碎气室部蛋壳，并用有钳端将气室端剩余蛋壳撕掉；
c.用小镊子取出鸡胚(夹黑色部位)，放入装有PBS(10mM，pH 7.2)的平皿中。用小镊子配合小剪刀剪去鸡胚头部、四肢，除去内脏，放入另一个装有PBS(10mM，pH 7.2)的平皿中；
d.将胚体用小镊子在PBS(10mM，pH 7.2)中涮一下，夹入小烧杯中，用大剪刀将胚体剪大约50下至呈细小组织块；
e.用37℃预热的PBS(10mM，pH 7.2)洗三遍，每次洗完后静置使组织块沉淀下来，沿烧杯壁倾倒液体，最后一次尽量倒尽PBS(10mM，pH 7.2)，然后倒入锥形烧杯中，倒入胰酶，无须吹打，放入37℃消化约10-25min(组织块毛边明显产生，如果毛边产生好，原来红色的组织块会整体变白。轻拿轻放，防止组织块散开)，将含有胰酶的上清倒入有细胞筛的50mL离心管中，将锥形烧瓶放在台面上使劲水平旋转摇晃至内容物呈鼻涕状；
f.往瓶内倒入约40mL的37℃预热的含10％胎牛血清(Gibco Thermo Fisher，CA)的DMEM培养基(Gibco Thermo Fisher，CA)，水平旋转摇晃混匀后静置，待尚未消化完的组织块沉淀，将上清液体轻轻倒入新的有细胞筛的离心管中，重复该步骤3-4遍至锥形烧瓶中液体与培养基液体的澄清度一样。
g.弃掉细胞筛，把装有细胞液体的离心管放入台式离心机中，24℃，1500rpm离心5min；此时可去晾计数板和盖玻片；
h.弃掉离心后的上清，每管用37℃预热的10-25mL含10％胎牛血清(Gibco ThermoFisher，CA)的DMEM培养基(Gibco Thermo Fisher，CA)重悬细胞，每两管重悬液混合后加入新的锥形烧瓶中，用1ml移液管吸取200μL细胞入1.5mL离心管中；
i.取一新的1.5mL离心管，吸取100μL细胞和300μL胎盘蓝(Trypan blue)混匀，用10μL移液枪吸取10μL混合液垂直地从细胞计数板孔滴入；
j.使用细胞计数仪Countess II进行细胞计数；
k.六孔板800万cell/板，12mL/板，2mL/孔；十二孔板800万cell/板，12mL/板，1mL/孔；T75细胞培养瓶1200万cell/个，20mL/个；
l.根据需求加入37℃预热的含10％胎牛血清(Gibco Thermo Fisher，CA)的DMEM培养基(Gibco Thermo Fisher，CA)稀释CEF，然后将CEF细胞置于37℃、5％CO2培养箱中培养18-24小时。
m.清理台面，倒垃圾，清洗用具。
(2)CCK-8细胞毒性试验
细胞毒性试验使用CCK-8试剂盒(上海生工Biotech，北京，货号：E606335)，根据试剂盒使用说明进行下述实验步骤。将新鲜制备的CEF细胞进行计数并调整细胞数为1×105/μl，接种于96孔板中，每孔100μl，培养16h后，分别向各孔中加入AUK溶液至终浓度为20μg/ml、加入Poly A:U溶液至终浓度为20μg/ml、加入Poly I:C溶液至终浓度为20μg/ml，混匀各孔，每种溶液设5个复孔，培养3、6、12、24、36h后每孔加入10μl CCK8溶液，混匀后继续培养1h，用自动酶标仪(Biotek SynergyTMH1)在吸收光450nm处检测吸收值。测定未处理的CEF细胞在450nm处的吸光度以排除背景值。使用10mM PBS(pH7.2)代替复合物对CEF细胞进行相同处理，作为PBS对照组。
结果如图4所示，使用AUK(20μg/ml)对CEF细胞进行不同时间的处理，各处理时间的细胞活力同PBS对照组相比均无明显差异，这表明AUK对CEF细胞无明显毒性，可以进行后续的疫苗佐剂实验。以同样浓度(20μg/ml)的Poly A:U和Poly I:C分别对细胞进行不同时间的处理，各处理时间的细胞活力无影响。
实施例3.疫苗制备和免疫
1、病毒液的制备
使用H9N2病毒作为抗原来评估复合物AUK在鸡免疫实验中的效果。按照如下方法制备H9N2病毒液：
(1)取H9N2亚型禽流感病毒，用灭菌生理盐水作适当稀释(如10-4或10-5稀释)，每胚尿囊腔内接种0.1ml，密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻蛋。
(2)接种后48小时内，每日照蛋1次，将48小时内死亡的鸡胚弃去。此后，每4～6小时照1次，将死亡的鸡胚随时取出，直至96小时。96小时后鸡胚不论死亡与否，将全部鸡胚取出，气室向上直立，置2～8℃冷却4～24小时。
(3)将冷却的鸡胚取出，消毒气室部位卵壳，然后以无菌手术剥除气室部卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜，吸取胚液，对每个鸡胚在吸取胚液前均应注意检查，凡胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者，弃去不用。死胚和活胚分别收获，每若干个鸡胚分为一组，吸取胚液放于同一灭菌的容器内，分别取样进行检验，-25℃以下保存备用。
(4)收获的病毒液，应逐瓶作无菌检验及红细胞凝集试验，并抽样一份测定病毒含量(EID50，鸡胚半数感染量)，应无菌生长，对1％鸡红细胞悬液凝集价应≥1:256，每0.1ml病毒含量应≥107.0EID50。
2、疫苗制备
向毒价107.5EID50/0.1ml的H9N2病毒中加入终浓度为0.1％的甲醛，并放置于37℃灭活24h，得到灭活病毒。配制下列疫苗：
AUK+Ve组：每300μl疫苗中含有AUK溶液100μl(含200μg AUK)，毒价为107.5EID50/0.1ml的H9N2灭活病毒100μl，α-生育酚0.45mg，吐温80 2mg，司盘80 2mg，体积不足部分使用无菌PBS缓冲液(10mM，pH7.2)补齐，所有成分强力搅拌均匀后使用。
AUK组：每300μl疫苗中含有AUK溶液100μl(含200μg AUK)，毒价为107.5EID50/0.1ml的H9N2灭活病毒100μl，体积不足部分使用无菌PBS缓冲液(10mM，pH7.2)补齐，搅拌均匀后使用。
Poly A:U组：每300μl疫苗中含有Poly A:U溶液100μl(含Poly A:U 200μg)，毒价为107.5EID50/0.1ml的H9N2灭活病毒100μl，体积不足部分使用无菌PBS缓冲液(10mM，pH7.2)补齐，搅拌均匀后使用。
抗原组：每300μl疫苗中含有毒价为107.5EID50/0.1ml的H9N2灭活病毒100μl，体积不足部分使用无菌PBS缓冲液(10mM，pH7.2)补齐，搅拌均匀后使用。
PBS组：无菌PBS缓冲液(10mM，pH7.2)。
白油组：油包水剂型，每300μl疫苗中含有毒价为107.5EID50/0.1ml的H9N2灭活病毒100μl，体积不足部分由白油(韩国瑞振化学，PARACOS KF-50)补齐并强力搅拌均匀。
3、免疫和攻毒试验
免疫试验：将120只4周龄的SPF鸡随机分为6组，每组20只，分别用上述AUK+Ve组、AUK组、Poly A:U组、抗原组、PBS组、白油组的疫苗进行免疫。方法如下：每只鸡(4周龄)腿部肌肉免疫0.3ml疫苗，一次免疫后，连续采血8周，用于抗体和细胞因子检测。血清中的抗体使用HI法测定(测定方法参照GBT 18936-2003高致病性禽流感诊断技术)。IFN-γ，IL-1β和IFN-β三种细胞因子在鸡血清中的含量分别采用鸡γ干扰素(IFN-γ)ELISA检测试剂盒(上海酶联生物，ml042758)、鸡白细胞介素1β(IL-1β)ELISA试剂盒(上海酶联生物，ml059835)和鸡β干扰素(IFN-β)ELISA试剂盒(上海酶联生物，ml059828)按照试剂盒说明书的步骤进行检测。
攻毒试验：第四周采血结束后，每组中隔离10只鸡，每只鸡用0.5ml毒价为107.5EID50/0.1ml的H9N2病毒经翅静脉注射攻毒。攻毒后第3日，分别采集每只鸡的泄殖腔及气管拭子，将同一只鸡的泄殖腔及气管拭子分别同1ml PBS无菌缓冲液(10mM，pH7.2)混合，再合并后作为1个样品，每个样品经尿囊腔接种9～11日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.2ml，孵育观察5日，逐胚测定鸡胚液的HA效价(测定方法参照GBT 18936-2003高致病性禽流感诊断技术)。每个样品接种的5枚鸡胚中只要有1枚鸡胚的鸡胚液HA效价不低于1：16(微量法)，即可判为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，应盲传1次后再进行判定。
所有实验至少重复三次。试验数据用Excel 2016初步整理后，采用SPSS19.0软件中的One-way ANOVA方差分析对数据进行统计分析，方差齐时用Tukey法进行多重比较。以*表示P<0.05,**表示P<0.01。数据表示为means±SEM。使用GraphPad Prism 5软件对数据进行作图。
如图5所示，白油组的HI效价在各免疫组中最高；AUK+Ve组同白油组的抗体效价无明显差异；AUK组的抗体效价略低于AUK+Ve组。如图6-8所示，含AUK的疫苗提高了实验鸡血清中IL-1β、IFN-β和IFN-γ三种细胞因子的水平。攻毒试验结果表明，AUK+Ve组的攻毒保护率高达90％，比传统的油佐剂灭活疫苗(白油组)高出10％(表1)。因此，复合物AUK能有效激活实验鸡的免疫系统，增强H9N2灭活病毒的免疫效力。
表1.SPF鸡免疫后H9N2病毒攻毒及排毒检测结果
组别
攻毒后病毒分离率(阳性数/总数)
保护率
Poly A:U
9/10
10％
AUK
9/10
10％
AUK+Ve
1/10
90％
抗原
10/10
0％
白油
2/10
80％
PBS
10/10
0％