阅读说明：本技术 一种检测分析血液中特定细胞外囊泡的方法及其用途 (Method for detecting and analyzing specific extracellular vesicles in blood and application thereof ) 是由 鞠佃文 范佳君 章旭耀 陈伟 栾静韵 朱泽国 梁嫣煦 叶丽 于 2019-04-22 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物技术领域,涉及检测分析血液中特定细胞外囊泡的方法及其用途。尤其是检测分析血液中特定细胞外囊泡的数量和比例,有助于预测患者动脉粥样硬化病程及其急性心血管事件的发生几率。本发明还提供了根据检测动脉粥样硬化患者外周血中细胞外囊泡数量,CD47<Sup>+</Sup>细胞外囊泡以及Annexin V<Sup>+</Sup>细胞外囊泡的比例结果,用于制备预测患者动脉粥样硬化病程的水平及其发生急性心血管事件的几率的制剂或工具模型；其中尤其是细胞外囊泡、CD47<Sup>+</Sup>细胞外囊泡以及Annexin V<Sup>+</Sup>细胞外囊泡用于制备检测及治疗动脉粥样硬化制剂中的应用。该发明有望成为临床心血管疾病的预测提供新技术支持和检测分析方法。(The invention belongs to the technical field of biology, and relates to a method for detecting and analyzing specific extracellular vesicles in blood and application thereof. Especially, the quantity and the proportion of specific extracellular vesicles in blood are detected and analyzed, which is helpful for predicting the atherosclerotic course and the occurrence probability of acute cardiovascular events of patients. The invention also provides a method for detecting the number of extracellular vesicles, CD47, in peripheral blood of an atherosclerotic patient + Extracellular vesicles and Annexin V + The proportion result of the extracellular vesicles is used for preparing a preparation or a tool model for predicting the level of the atherosclerotic course of the patient and the probability of the patient suffering from an acute cardiovascular event; among these are especially extracellular vesicles, CD47 + Extracellular vesicles and Annexin V + Application of extracellular vesicles in preparation of preparations for detecting and treating atherosclerosis. The invention is expected to provide a new technical support and a detection analysis method for the prediction of clinical cardiovascular diseases.)

一种检测分析血液中特定细胞外囊泡的方法及其用途

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，涉及检测分析血液中特定细胞外囊泡的方法及其用途。尤其是检测分析血液中特定细胞外囊泡的数量和比例；本发明方法有助于预测患者动脉粥样硬化病程及其急性心血管事件的发生几率。

背景技术

研究显示，动脉粥样硬化是与严重健康问题相关的常见心血管疾病之一，同时也是导致发病和死亡的主要原因，动脉粥样硬化的病理学特征是内皮下的脂质细胞的积累和动脉内膜中形成动脉粥样化或脂肪沉积[1]。冠状动脉粥样硬化的过程会阻碍血液流动，导致远端血管堵塞，引起相关的急性心血管事件如急性心肌梗死、不稳定心绞痛等的发生，从而严重威胁到患者的生命。

研究表明，动脉粥样硬化的形成分为三个阶段:首先，冠状动脉动脉血管内皮细胞受到各种有害刺激如，高血压、高血糖、高血脂、氧化应激等时被激活，分泌粘附分子如ICAM-1等，促进白细胞粘附，与此同时，内皮通透性增加和内皮下细胞外基质成分改变，促使氧化修饰的低密度脂蛋白(ox-LDL)在动脉壁上集聚，被清道夫受体识别进入巨噬细胞，形成泡沫细胞；然后，内皮细胞分泌的细胞因子和生长因子，诱导平滑肌细胞增殖和迁移，形成由纤维组织、平滑肌细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞构成的纤维帽；最终，损伤的内皮细胞、泡沫细胞、大量脂质、钙质沉积、病理血管重建构成斑块核心[2]。目前，由于动脉粥样硬化发病的具体分子机制尚不明确，导致临床实践中尚缺乏有非常明确的针对动脉粥样硬化的诊断方法及治疗药物。

急性心血管事件(Acute Cardiovascular Event)是由于血管因长期动脉粥样硬化，并不断进展，进而产生的如急性冠脉综合征(Acute Coronary Syndromes, ACS)等急性缺血性心脏病变。研究显示，发生急性心血管事件的主要原因是由于冠状动脉内不稳定的粥样硬化斑块破裂或糜烂继发新鲜血栓形成所导致的心脏急性缺血综合征。由于缺少必要的诊断及预测方法，急性心血管事件目前是导致动脉粥样硬化患者死亡的最主要原因之一。据统计，每年死于动脉粥样硬化并发的急性心血管的人数达到1500万人，而其中，我国占1/5[3]；故而，进一步研究动脉粥样硬化的机制，并从中发掘能作为该疾病预测和预后的分子至关重要。

细胞外囊泡是指由细胞分泌的大小约在20-10000nm左右的小泡，这些小泡负责细胞与细胞之间的通讯，虽然细胞凋亡时释放凋亡小体早就被报道,但是健康的细胞从细胞膜释放囊泡是最近才被关注，它们主要包括微囊泡 (microvesicles)、凋亡小体(apoptotic body)和外泌体(exosome)等[4]；

外泌体是磷脂双分子层包围的细胞外囊泡,直径为20-200nm,可以由静息细胞释放,或诱导释放，外泌体释放是通过内吞体向内凹陷形成多泡体 (multivesicularbody,MVB),再由多泡体与细胞膜融合而释放的，外泌体不仅可以横向传递mRNA和miRNA、致癌受体(oncogenetic receptor)和艾滋病病毒颗粒 (HIV particle),还具有抗原呈递、免疫激活和免疫抑制活性,表达D63、CD81、 CD9、LAMP1、TSG101等标志物[5]；

微囊泡是内皮细胞或者血小板等细胞表面产生的细胞外囊泡[6]，1946年有研究发现不含血小板但还具有产生凝血酶活性的血浆中有沉淀作用的因子，， 1967年,有研究从新鲜血浆中通过超速离心分离出血小板的尘埃(platelet dust), 定义为微囊泡；微囊泡被认为是由血小板、红细胞或上皮细胞产生的,具有促凝血功能，微囊泡是磷脂双分子层包围的膜结构,直径为200-100nm，微囊泡由细胞膜向外出芽生成，微囊泡的生成是受调控的，细胞表面受体被激活、细胞凋亡或细胞内钙离子浓度增高均可诱发微囊泡的产生[7]；

凋亡小体由Kerr等在1972年提出[8]，Robert Horvitz团队研究线虫中细胞谱系发育中的细胞凋亡是又一个凋亡小体研究的里程碑；。凋亡小体直径在 1000nm以上，是细胞凋亡过程中起泡产生，凋亡小体可水平传递DNA、致癌基因，在被吞噬细胞摄入时呈递T细胞抗原决定簇，具有免疫抑制作用。

有研究报道，冠状动脉粥样硬化病变，从早期病变阶段到晚期病变均含有细胞外囊泡，细胞激活、凋亡、炎症及缺氧状态下均可增加细胞外囊泡的释放，细胞外囊泡可以来自白细胞，红细胞，平滑肌细胞和内皮细胞等，由于它们对炎症、血栓形成、血管生成、细胞存活和内皮稳态的影响，细胞外囊泡可能在冠状动脉粥样硬化病变起始和进展中起作用[9]。

还有研究公开了循环细胞外囊泡水平与各种心血管危险因素相关，包括吸烟、血脂异常、糖尿病和高血压或与亚临床冠状动脉粥样硬化病变有关，细胞外囊泡可以在各种情况下发挥促炎和抗炎作用；大多数体外研究表明，细胞外囊泡增加了来自内皮细胞和白细胞，特别是白细胞介素6和白细胞介素8介导的促炎细胞因子的释放，这将促进单核细胞黏附到内皮并有利于单核细胞向斑块迁移 [9]；内皮起源的细胞外囊泡也可以通过NFKB调节单核细胞的活化；还有研究表明，细胞外囊泡可与血管内皮相互作用并促进细胞功能的障碍，内皮细胞外囊泡可以减少内皮细胞产生的一氧化氮(NO)，其机制可能是通过NO合成酶磷酸化修饰或局部氧化应激，导致血管紧张度改变并损害内皮的冠状动脉粥样硬化保护性[10]；相比之下，从健康个体或正常条件下在体外分离的细胞外囊泡对内皮功能无影响，这表明，细胞外囊泡的效应在很大程度上受其组成的影响，包括细胞来源，局部环境和细胞刺激等；此外，内皮细胞外囊泡和大的血小板细胞外囊泡也可增加内皮通透性，将细胞凋亡蛋白酶-3和Rho-激酶递送至靶细胞而增加局部细胞凋亡；从人冠状动脉粥样硬化斑块分离的细胞外囊泡可以将ICAM-1 直接转移到靶细胞，ICAM-1的表达也可通过存在于细胞外囊泡中的miR-222进行调控[11]；细胞外囊泡携带的花生四烯酸和氧化磷脂也有助于白细胞黏附增加，将原始动脉粥样化的CCL5从血小板细胞外囊泡转移到内皮细胞从而增加白细胞的黏附[12]；上述结果表明，在病理条件下释放的细胞外囊泡可以促进血管内皮中白细胞和低密度脂蛋白(LDL)的浸润，从而有利于动脉粥样硬化病变的发展。

目前，虽然有部分研究提示细胞外囊泡可能参与了动脉粥样硬化病程的调控，然而，尚未有研究明确表示细胞外囊泡与临床动脉粥样硬化进展及其相关急性心血管事件的发生存在显著性联系；同时，由于细胞外囊泡的效应受其来源及其组分的影响，也尚未见显示巨噬细胞来源的细胞外囊泡对于动脉粥样有关的报道。

与本发明相关的参考文献有：

[1]Campbell KA,Lipinski MJ,Doran AC,Skaflen MD,Fuster V,McNamara CA.Lymphocytes and the adventitial immune response in atherosclerosis.Circ Res.2012；110:889-900.

[2]Childs BG,Baker DJ,Wijshake T,Conover CA,Campisi J,van Deursen JM.Senescent intimal foam cells are deleterious at all stages ofatherosclerosis. Science.2016；354:472-7.

[3]Mariscalco G,Wozniak MJ,Dawson AG,Serraino GF,Porter R,Nath M,etal. Body Mass Index and Mortality Among Adults Undergoing Cardiac Surgery:ANationwide Study With a Systematic Review and Meta-Analysis.Circulation.2017；135:850-63.

[4]Sasso L,Hosamuddin H,Emanueli C.Extracellular vesicles at thecross-line between basic science and clinical needs.Microcirculation.2017；24.

[5]Fu M,Gu J,Jiang P,Qian H,Xu W,Zhang X.Exosomes in gastric cancer:roles, mechanisms,and applications.Mol Cancer.2019；18:41.

[6]Agrahari V,Agrahari V,Burnouf PA,Chew CH,Burnouf T.ExtracellularMicrovesicles as New Industrial Therapeutic Frontiers.Trends Biotechnol.2019.pii:S0167-7799(18)30335-4.

[7]Melki I,Tessandier N,Zufferey A,Boilard E.Platelet microvesiclesin health and disease.Platelets.2017；28:214-221.

[8]Hauser P,Wang S,Didenko VV.Apoptotic Bodies:Selective Detection inExtracellular Vesicles.Methods Mol Biol.2017；1554:193-200.

[9]Maas SL,Breakefield XO,Weaver AM.Extracellular Vesicles:UniqueIntercellular Delivery Vehicles.Trends Cell Biol.2017；27:172-188.

[10]Loyer X,Zlatanova I,Devue C,Yin M,Howangyin KY,Klaihmon P,et al.Intra-Cardiac Release of Extracellular Vesicles Shapes Inflammation FollowingMyocardial Infarction.Circ Res.2018；123:100-106.

[11]Chistiakov DA,Orekhov AN,Bobryshev YV.Cardiac ExtracellularVesicles in Normal and Infarcted Heart.Int J Mol Sci.2016；17.pii:E63.

[12]Franciszkiewicz K,Boutet M,Gauthier L,Vergnon I,Peeters K,Duc O,et al. Synaptic release of CCL5 storage vesicles triggers CXCR4 surfaceexpression promoting CTL migration in response to CXCL12.J Immunol. 2014；193:4952-61.。

发明内容

本发明的目的是提供及检测分析血液中特定细胞外囊泡的方法及其用途，尤其是检测分析血液中特定细胞外囊泡的数量和比例的方法，本发明的方法有助于预测患者动脉粥样硬化病程及其急性心血管事件的发生几率。

本发明公开了一种检测分析血液中特定细胞外囊泡的数量和比例的方法，尤其涉及通过检测及分析病人外周及冠脉血中细胞外囊泡以及Annexin V⁺和 CD47⁺细胞外囊泡，进一步用于预测患者动脉粥样硬化病程及其急性心血管事件的发生率。

本发明方法包括步骤：

1)收集健康人及动脉粥样硬化患者病例信息：

通过冠状动脉造影术以及血管内超声检测患者的冠状动脉内的病变情况，计算患者血管内狭窄的面积和所占管腔的比例，确定：健康供试者、早期AS患者、冠心病患者以及易发生心肌梗死的患者；

2)收集及检测外周血中细胞外囊泡，通过流式细胞术对供试品中的细胞外囊泡进行流式细胞分选并进行计数；

3)分析比较动脉粥样硬化患者与健康人外周血中的细胞外囊泡的水平，

4)分析比较动脉粥样硬化患者与健康人外周血中CD47⁺的细胞外囊泡的水平

5)分析比较动脉粥样硬化患者与健康人外周血中Annexin V⁺的细胞外囊泡的水平；

6)分析比较动脉粥样硬化患者与健康人外周血中细胞外囊泡水平及CD47⁺的细胞外囊泡的水平与脂代谢紊乱的程度关系。

本发明中，经检测分析比较表明，细胞外囊泡总数以及CD47⁺的细胞外囊泡数量随患者动脉粥样硬化病程的进展(主要指患者冠脉内狭窄的程度)逐渐增多，其中CD47⁺的细胞外囊泡在正常人外周血中不足8％，而随着动脉粥样病程的发展，在冠心病病人外周血中占比达到15％-20％；此外，Annexin V⁺的细胞外囊泡在正常人外周血中不足10％，在各个阶段的动脉粥样病人的血液中分布一般最多为25％左右，而在发生急性冠脉综合征或即将发生急性冠脉综合征的患者血液中占比能达到50％。

本发明中，所述的细胞外囊泡指的是直径在200nm以下的外泌体以及直径范围在200-2000nm范围的细胞外微囊泡。

本发明中，所述的CD47⁺细胞外囊泡以及Annexin V⁺细胞外囊泡所指的是携带有CD47和Annexin V的细胞外囊泡。其位置包括囊泡外表面，内表面及囊泡内。

本发明中，所述的细胞外囊泡、CD47⁺细胞外囊泡以及Annexin V⁺细胞外囊泡其来源包括但不限于：巨噬细胞来源、血小板来源、内皮细胞来源、单核细胞来源、平滑肌细胞来源。但最主要指的是巨噬细胞来源的细胞外囊泡。

本发明中，所述的囊泡中CD47和Annexin V的位置，主要是指囊泡外表面上CD47和Annexin V的水平。

本发明中，所指的动脉粥样硬化患者包括但不限于：慢性动脉粥样硬化患者、冠心病患者、长期(＞3年)的高血压患者、急性冠脉综合征患者。

本发明中，所述的动脉粥样硬化患者，优选的是慢性动脉粥样硬化患者和冠心病患者。

本发明进一步提供了根据检测动脉粥样硬化患者外周血中细胞外囊泡数量，CD47⁺细胞外囊泡以及Annexin V⁺细胞外囊泡的比例结果，用于制备预测患者动脉粥样硬化病程的水平及其发生急性心血管事件的几率的工具模型；其中尤其是细胞外囊泡、CD47⁺细胞外囊泡以及Annexin V⁺细胞外囊泡用于制备检测及治疗动脉粥样硬化制剂中的应用。

本发明中，所述的的细胞外囊泡，与脂代谢相关指标甘油三酯、总胆固醇及 LDL-C相结合可用于制备预测及诊断动脉粥样硬化的制剂中。

附图说明

图1，病人/健康人冠状动脉血管的造影以及血管内超声分析。

图2，病人/健康人外周血中细胞外囊泡水平的流式细胞检测。

图3，病人/健康人外周血中CD47⁺细胞外囊泡水平的分析。

图4，病人/健康人外周血中Annexin V⁺细胞外囊泡水平的分析。

图5，患者外周血内细胞外囊泡的水平与脂代谢指标的相关性分析。

图6，患者外周血内CD47⁺细胞外囊泡水平与脂代谢指标的相关性分析。

具体实施方式

实施例1

健康人及动脉粥样硬化患者病例的录入，

首先，通过冠状动脉造影术(Coronary Angiography，CAG)以及血管内超声(iVUS)对患者的冠状动脉内的病变情况进行检测，同时通过iVUS精确计算患者血管内狭窄的面积和所占管腔的比例(IS)(如图1所示)，根据其IS数值，将患者分为四组，如附表1所示，分别为健康供试者(HealthyVolunteers；IS＝0％)、早期AS患者(Patients with earlyAS；0％＜IS≤50％)、冠心病患者(Patients with CHD；50％＜IS≤70％)以及容易发生心肌梗死的患者(Patients with MI；IS＞ 70％)。

表1病人/健康人的基本信息

患者外周血中细胞外囊泡的收集及检测，

在采集到患者血液后用EDTA对血液及时采取抗凝处理，并通过离心法在第一时间分别去除血细胞和血小板，获得无血细胞和血小板的患者血浆，通过浓度为0.02M的PBS溶液以1：1的比例对患者血浆进行稀释，并每100μL供试品中加入2μL的countingbeads对供试品中的细胞外囊泡进行分析，随后，通过流式细胞术对供试品中的细胞外囊泡进行了流式细胞分选并进行计数。

动脉粥样硬化患者外周血中的细胞外囊泡的水平显著高于健康人，并随着病程的进展逐步升高，结果如附图2所示，在早期动脉粥样硬化、冠心病以及有心梗风险的病人外周血中的细胞外囊泡的数量分别为766、1424和1773个/μL，与对照组(343个/μL)相比显著上升，并且随着疾病病程的发展逐渐增多，结果表明，细胞外囊泡与动脉粥样硬化的发生与发展关系密切。

动脉粥样硬化患者外周血中CD47⁺的细胞外囊泡的水平显著高于健康人，并随着病程的进展逐步升高，

对分选得到的细胞外囊泡进行进一步的分析及分选，首先对囊泡膜上的 CD47进行了检测，如附图3所示，流式细胞术的结果证实，患者外周血中CD47⁺的细胞外囊泡比例显著升高，其中有心梗风险病人的血液中的最高，约为对照组的2倍，表明，CD47⁺的细胞外囊泡增加与动脉粥样硬化的病程相关。

动脉粥样硬化患者外周血中Annexin V⁺的细胞外囊泡的水平显著高于健康人，并随着病程的进展逐步升高，

使用Annexin V-FITC染色对分选的上述细胞外囊泡进一步进行分析，结果显示，随着AS疾病的进展，患者外周血细胞外囊泡中Annexin V⁺的细胞外囊泡的比例显著高于正常人(如图4所示)；由于细胞外囊泡外膜的主要成分与其母细胞细胞膜的成分类似，故推测在动脉粥样硬化病程的发展中伴随着细胞凋亡，且凋亡细胞的比例随疾病的发展逐步上升；同时，证实了在动脉粥样硬化的病程中，病人血液中CD47⁺细胞外囊泡多来源于凋亡细胞，基于有关报道：动脉粥样硬化斑块中的泡沫细胞常随着疾病的进展逐步凋亡，从而形成不稳定斑块，因此，本发明的结果表明，这些CD47+细胞外囊泡系来源于凋亡的泡沫细胞和不稳定的斑块。

动脉粥样硬化患者外周血中细胞外囊泡水平及CD47⁺的细胞外囊泡的水平与脂代谢紊乱的程度呈正相关，

进一步确证CD47⁺细胞外囊泡与泡沫细胞的关系：通过将CD47⁺细胞外囊泡和细胞外囊泡总数分别与患者的脂代谢指标LDL-C、总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)进行相关性统计分析，分析结果表明病人体内CD47⁺细胞外囊泡及细胞外囊泡总水平与其LDL-C、TC和TG均呈现正相关(如图5、图6所示)；由于泡沫细胞形成的首要原因就是脂代谢的紊乱，因此，实验结论进一步证实了泡沫巨噬细胞分泌的CD47⁺细胞外囊泡是促进动脉粥样硬化病程进展的一个可能的因素，同时提示，细胞外囊泡相关指标与脂代谢指标相结合可用作为一种预测动脉粥样硬化病程的方法中。