阅读说明：本技术 一种褪黑素组合物在制备减重降脂药物中的应用 (Application of melatonin composition in preparation of weight-losing and lipid-lowering medicines ) 是由 赵广山 于 2020-08-24 设计创作，主要内容包括：本发明涉及减重降脂技术领域,尤其是涉及一种褪黑素组合物在制备减重降脂药物中的应用,褪黑素组合物包括褪黑素和EGCG,所述褪黑素和EGCG的质量比为(2～6):(30～45)。本发明首次将褪黑素联合EGCG使用,发现褪黑素组合物可以降低2型糖尿病小鼠体重和腹脂重量,并且可以显著抑制2型糖尿病小鼠腹脂中的脂肪酸合成酶蛋白表达和肝脏中的脂肪酸合成酶蛋白表达,说明褪黑素组合物可以通过抑制脂肪合成,减少脂肪积累,达到减少体重增长或减肥降脂效果,并且本发明还意外加入了水苏糖,发现可以显著抑制醌化蛋白水平,有助于提高EGCG的活力。(The invention relates to the technical field of weight loss and lipid reduction, in particular to application of a melatonin composition in preparation of weight loss and lipid reduction medicines, wherein the melatonin composition comprises melatonin and EGCG, and the mass ratio of the melatonin to the EGCG is (2-6): 30-45. The melatonin is combined with the EGCG for the first time, and the melatonin composition can reduce the weight and the abdominal fat weight of a type 2 diabetes mouse, and can obviously inhibit the expression of fatty acid synthetase protein in abdominal fat and the expression of fatty acid synthetase protein in liver of the type 2 diabetes mouse, so that the melatonin composition can reduce fat accumulation by inhibiting fat synthesis, and achieve the effects of reducing weight gain or losing weight and reducing fat.)

一种褪黑素组合物在制备减重降脂药物中的应用

技术领域

本发明涉及减重降脂技术领域，尤其是涉及一种褪黑素组合物在制备减重降脂药物中的应用。

背景技术

营养过剩和长期的静态生活方式，导致超重、肥胖、甚至2型糖尿病。WHO和相关机构调查显示，截至2014年，全球肥胖人群已超过15亿，2型糖尿病患者超过4.2亿；并预测，截至2035年，全球糖尿病患者人数将超过6.0亿。糖尿病属全球性重大健康卫生问题，除HIV/AIDS外，糖尿病是降低全球健康调整期望寿命(HALE0)的首要疾病。长期以来，减少脂肪积累从而控制体重增长，是预防肥胖和2型糖尿病的有效手段。

褪黑素由机体松果体腺分泌，具有调节生物钟、辅助睡眠、抗氧化、预防和改善代谢功能紊乱等多种功能。褪黑素的生成主要通过L-色氨酸在松果体细胞中转化为5-羟色胺，然后在N-乙酰转移酶(AA-NAT)作用下生成N-乙酰5-羟色胺，最后再5-羟吲哚氧甲基转移酶(HIOMT)作用下生成褪黑素。

儿茶素在植物广泛分布，具有广泛的生物活性，如抗氧化、抗炎、抗病毒、抗菌等活性。儿茶素包含对种化合物，如表儿茶素、表没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)，EGCG在众多儿茶素中活性最强，含量最高，约占儿茶素总量的50％；在大量体内外实验证明，EGCG在肺癌、食管癌、皮肤癌、肝癌等十几种癌症中都有明确的抑制效果。

中国专利CN104784172B公开了一种含有褪黑素和儿茶素的组合物及其应用，其中褪黑素能够降低儿茶素的毒副作用，降低儿茶素致死性毒性，降低儿茶素引起的儿茶素引起的急性肝毒性以及亚急性肝损伤；此外，中国专利申请CN108926554A公开儿茶素在制备治疗中枢神经系统疾病药物中的应用，其中，儿茶素或其药用盐及其药物组合物作为褪黑素受体激动剂，可以治疗或预防与褪黑素受体相关的中枢神经系统疾病，也可以治疗或预防抑郁症。目前，还未有报道将EGCG联合褪黑素在制备减重降脂药物中的应用。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种褪黑素组合物在制备减重降脂药物中的应用，本发明首次将褪黑素联合EGCG使用，发现组合物可以通过抑制脂肪合成，减少脂肪积累，达到减少体重增长或减肥降脂效果。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种褪黑素组合物在制备减重降脂药物中的应用，所述褪黑素组合物包括褪黑素和表没食子儿茶素没食子酸酯。

优选地，所述褪黑素和表没食子儿茶素没食子酸酯的质量比为(2～6):(30～45)。

优选地，所述褪黑素和表没食子儿茶素没食子酸酯的质量比为(2～5):(30～40)。

优选地，所述褪黑素和表没食子儿茶素没食子酸酯的质量比为4:35。

更优选地，所述褪黑素组合物还包括水苏糖。

优选地，所述褪黑素与水苏糖的质量比为1:(0.8～2)。

优选地，所述褪黑素与水苏糖的质量比为1:1.5。

优选地，所述组合物和药学上可接受的赋形剂制成口服制剂，药学上可接受的赋形剂。

优选地，所述口服制剂包括片剂、丸剂或颗粒剂。

一种褪黑素组合物在减重降脂药物中的应用。

在本发明的技术方案中，本发明将褪黑素和表没食子儿茶素没食子酸酯以特定的质量比复配，发现可以降低2型糖尿病小鼠体重和腹脂重量，并且可以显著抑制2型糖尿病小鼠腹脂中的脂肪酸合成酶蛋白表达和肝脏中的脂肪酸合成酶蛋白表达，因此，说明组合物通过抑制脂肪合成，达到减少体重增长或减肥降脂的效果，但单独使用表没食子儿茶素没食子酸酯并不能达到减重降脂作用，说明单独存在的褪黑素也可以抑制脂肪的合成，达到减少体重增长或减肥降脂的效果；

此外，由于表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)易氧化形成半醌自由基，之后再B环或D环形成邻醌结构，在此过程中积累超氧阴离子和过氧化氢等自由基，缺电子的邻醌结构会与细胞内的蛋白质半胱氨酸残基的游离巯基结合形成醌化蛋白，被醌修饰的蛋白即醌化蛋白将会丢失活力，因此，本发明经过大量实验，意外发现加入水苏糖可以抑制醌化蛋白水平，有助于提高表没食子儿茶素没食子酸酯的活力，由醌化蛋白测定试验也可明显得知，实施例1～5制备的褪黑素组合物的OD值显著下降，显著抑制了表没食子儿茶素没食子酸酯中醌化蛋白水平。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.本发明提供了一种褪黑素组合物在减重降脂药物中的应用，采用特定质量比的褪黑素和表没食子儿茶素没食子酸酯复配，发现可以降低2型糖尿病小鼠体重和腹脂重量，并且可以显著抑制2型糖尿病小鼠腹脂中的脂肪酸合成酶蛋白表达和肝脏中的脂肪酸合成酶蛋白表达，说明组合物可以通过抑制脂肪合成，达到减少体重增长或减肥降脂的效果；

2.本发明提供了一种褪黑素组合物在减重降脂药物中的应用，加入水苏糖可以显著抑制醌化蛋白水平，有助于提高表没食子儿茶素没食子酸酯的活力；

3.本发明提供了一种褪黑素组合物在减重降脂药物中的应用，该组合物和药学上可接受的赋形剂制成片剂、丸剂或颗粒剂等口服制剂，药用范围广，无依从性。

附图说明

图1为本发明实施例5中EGCG或EGCG与褪黑素联合使用(E+M)对2型糖尿病小鼠体重和腹脂的影响示意图；

图2为本发明实施例5中EGCG或EGCG与褪黑素联合使用(E+M)对2型糖尿病小鼠腹脂中脂肪酸合成酶蛋白表达水平的影响示意图；

图3为本发明实施例5中EGCG或EGCG与褪黑素联合使用(E+M)对2型糖尿病小鼠肝脏中脂肪酸合成酶蛋白表达水平的影响示意图。

具体实施方式

以下结合附图及实施例，对本发明作进一步详细说明。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

以下实施例中，EGCG(CAS号989-51-5)购买自杭州怡倍嘉茶叶科技有限公司；褪黑素(CAS号73-31-4)购买自美国sigma公司。

实施例1～6、一种褪黑素组合物

褪黑素组合物配方，如表1所示：

组别	EGCG	褪黑素	水苏糖
				实施例1	3.0mg/mL	0.2mg/mL	0.16mg/mL
实施例2	3.5mg/mL	0.3mg/mL	0.45mg/mL
				实施例3	4.0mg/mL	0.5mg/mL	0.5mg/mL
实施例4	4.5mg/mL	0.6mg/mL	1.2mg/mL
				实施例5	3.5mg/mL	0.4mg/mL	0.6mg/mL
实施例6	3.5mg/mL	0.4mg/mL	/

试验例一、2型糖尿病小鼠减重降脂试验

实验动物：取48只8周龄的2型糖尿病小鼠db/db小鼠，db/db小鼠购买于上海斯莱克实验动物有限责任公司，按血糖随机分为八组，分别为对比组(Ctrl)、EGCG组(EGCG水溶液，3.5mg/mL)和实施例1～6组水溶液(E+M)，对照组饮用纯水，干预组饮用相同体积的EGCG或E+M组的水溶液，每天更换，每周记录一次体重，实验周期三周。干预三周后结束实验，收集肝脏和腹脂，使用Western Blot方法检测蛋白表达。

结果：

由于实施例1～4及实施例6与实施例5组水溶液效果相似，且以实施例5组水溶液为最佳实施例。

由图1A和图1B显示，饮用单独的EGCG具有抑制2型糖尿病小鼠体重增加的趋势，但并无统计学差异；实施例5组的褪黑素组合物可显著减少2型糖尿病小鼠体重的增加。

图1C显示，单独的EGCG不减少2型糖尿病小鼠腹脂的重量，实施例5的褪黑素组合物可显著减少2型糖尿病小鼠腹脂的重量。(图1中，**，p<0.01，与对照组比。#，p<0.05，##，p<0.01，与EGCG组比。)

图2显示，饮用单独的EGCG不影响2型糖尿病小鼠腹脂中脂肪酸合成酶蛋白的表达水平，实施例5组的褪黑素组合物可显著抑制2型糖尿病小鼠腹脂中脂肪酸合成酶蛋白的表达水平。(图2中，#，p<0.05，与EGCG组比)

图3显示，饮用单独的EGCG不影响2型糖尿病小鼠肝脏中脂肪酸合成酶蛋白的表达水平，实施例5组的褪黑素组合物可显著抑制2型糖尿病小鼠腹脂中脂肪酸合成酶蛋白的表达水平。(图3中，*，p<0.05，与对照组比；##，p<0.01，与EGCG组比)

这些结果表明本发明的褪黑素组合物可通过抑制2型糖尿病小鼠脂肪合成，减少脂肪积累，达到减重降脂的效果，单独的EGCG并无减重降脂效果，说明褪黑素也可以抑制脂肪合成，减少脂肪积累，达到辅助减重降脂的效果。

试验例二、醌化蛋白测定试验

试验方法：将实施例1～6制备的褪黑素组合物分别添加至完全培养基(500ml1640培养基+55.6ml胎牛血清+5.6ml青链霉素双抗)中，选择人舌鳞癌细胞(Tca8113)由上海交通大学口腔医学重点实验室提供。将Tca8113细胞分别用添加实施例1～6制备的褪黑素组合物的完全培养基进行培养、传代。

全细胞蛋白裂解液提取：细胞用褪黑素组合物处理完毕后将培养皿中的培养基收集，用胰酶将附着在培养皿底部的细胞消化下来后对应的加入收集起来的培养基中，2500rpm/min离心2min，弃去上清，加入PBS悬浮细胞，离心，PBS冲洗3遍后加入一定体积含1％PMSF(0.0174+1ml无水乙醇配制)的RIPA裂解液，超声破碎，4℃15000g离心10min，取上清液。

取提取好的全细胞蛋白裂解液，经BCA法测出蛋白浓度后，取总蛋白量0.5mg的蛋白裂解液进行以下步骤：

1.10％三氯乙酸与样品等体积混合，室温静置20min；

2.1000g离心10min，弃去上清，1ml乙醇洗2次(4000g，5min)，弃上清；

3.加入1ml氯仿和0.5ml甲醇，充分涡旋，5000g，10min离心，弃上清(去除脂类)；

4.去脂蛋白用PH10的2MGly-K溶液重悬，孵育1h；

5.12000g，15min离心，取上清；

6.取5中的200μl上清液于96孔板中，加入4μlNBT，空白取200μlGly-K溶液加4μlNBT，反应180min后，用酶标仪测定OD_530nm值，见表2。

表2

组别	OD<sub>530nm</sub>/mg pro
		Control	0.056
EGCG组	1.726
		实施例1	1.235
实施例2	1.098
		实施例3	1.176
实施例4	0.967
		实施例5	0.894
实施例6	1.721

从表2的数据知，与EGCG组相比，使用实施例1～5制备的褪黑素组合物处理的全细胞蛋白裂解液经测定OD值显著下降，显著抑制了EGCG中醌化蛋白水平，其中以实施例5最佳实施例，抑制醌化蛋白水平最佳。

实施例6制备的褪黑素组合物缺少水苏糖，其测定的OD值与EGCG组OD值相似，说明水苏糖可以显著抑制EGCG中醌化蛋白水平，提高了EGCG的活力。

本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。