阅读说明：本技术 黄牛mogat1基因snp标记辅助选择生长性状的方法及应用 (Method for auxiliary selection of growth traits of cattle by using MOGAT1 gene SNP marker and application ) 是由 刘贤 黄永震 吕世杰 杨鹏 刘燕蓉 宋天 王二耀 蔡雯雯 贺花 张子敬 王建钦 于 2020-08-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种黄牛MOGAT1基因SNP标记辅助选择生长性状的方法及应用：以黄牛全基因组DNA为模板,使用特异性引物扩增MOGAT1基因部分片段,使用限制性内切酶TaqⅠ消化PCR产物,对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛MOGAT1基因突变位点g.25940T>C的基因型；本发明利用PCR-RFLP法进行DNA水平的分型检测,发现了与黄牛体重等生长性状密切相关的SNP标记,可以用于生长性状的标记辅助选择,快速建立遗传资源优良的黄牛专门化肉用种群。(The invention discloses a method for selecting growth traits of cattle under the assistance of a cattle MOGAT1 gene SNP marker and application thereof: using cattle whole genome DNA as a template, amplifying partial fragments of MOGAT1 gene by using specific primers, digesting PCR products by using restriction enzyme Taq I, and carrying out agarose gel electrophoresis on the fragments after enzyme digestion; identifying the genotype of the cattle MOGAT1 gene mutation site g.25940T > C according to the agarose gel electrophoresis result; the invention utilizes the PCR-RFLP method to carry out DNA level typing detection, discovers SNP markers closely related to growth traits such as cattle weight and the like, can be used for marker-assisted selection of the growth traits, and quickly establishes cattle specialized meat populations with excellent genetic resources.)

黄牛MOGAT1基因SNP标记辅助选择生长性状的方法及应用

技术领域

本发明属于分子遗传育种领域，涉及黄牛MOGAT1基因突变位点g.25940T>C的单核苷酸多态性(SNP)的检测方法。

背景技术

当前已有多种分子标记得到了大量使用，包括单核苷酸多态性(SNP)等。SNP技术具有以下几个优点：(1)SNP数量巨大，在全基因组上都有分布；(2)SNP的遗传具有稳定性，发生突变的概率低，这也使SNP具有在分子标记辅助选择方面的研究意义和应用价值；(3)大多数SNP属于二等位基因，利于大规模确定群体中个体的基因型。

PCR-RFLP是在SNPs检测中较为常用的一种方法。此方法的原理是利用限制性内切酶的酶切位点的特异性，作用于同一DNA片段，然后对酶切后的产物进行核酸电泳检测，以判断是否为SNP位点以及碱基替换的类型(石磊等2007)。

单酰基甘油-O-酰基转移酶1(MOGAT1)属于高等生物单酰甘油酰基转移酶(MGAT)家族成员之一。MOGAT1在体外具有MOGAT活性，但其在三酰甘油(Tag)代谢中的生理功能尚不清楚，研究表明，MOGAT1对肝脏中三酰甘油的合成起到的作用很小，下调MOGAT1可改善糖代谢和肝脏胰岛素信号转导(Agarwal A K 2016)。MOGAT1基因mRNA在动物脂肪组织、胃、肾脏中均有表达，而在小肠中无表达。MOGAT2基因和MOGAT3基因在肠道中均有高表达，可能通过从脂肪酸和单酰甘油中重新合成甘油三酯，在肠道膳食脂肪吸收中发挥重要作用。而体外实验表明MOGAT3也具有显著的DGAT(二酯酰甘油酰基转移酶)活性。初期、持续性解除MOGAT1的调控可能与有利于MOGAT1表达的组蛋白修饰相关(Marta et al.2018.)。目前关于黄牛MOGAT1基因SNP及其对生长性状的影响尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种黄牛MOGAT1基因SNP标记辅助选择生长性状的方法及应用，从而加快良种选育速度。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种检测黄牛MOGAT1基因单核苷酸多态性的方法，包括以下步骤：

以黄牛(秦川牛、夏南牛、皮南牛和云岭牛四个品种)个体全基因组DNA为模板，以特异性引物对P1为引物，通过PCR扩增黄牛个体MOGAT1基因部分片段；用限制性内切酶TaqⅠ酶切PCR扩增产物，对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定黄牛个体MOGAT1基因第25940位单核苷酸多态性位点的基因型；

所述引物对P1为：

上游引物F：5′-TCAATGTATGTGGGCATGTTTGA-3′；

下游引物R：5′-TTAAATGCAACTGTTCTGGGTGG-3′。

优选的，所述PCR的扩增反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，59.1℃退火40s，72℃延伸30s，共36个循环；72℃延伸10min。

优选的，所述琼脂糖凝胶电泳采用质量浓度为2.0％的琼脂糖凝胶。

优选的，根据MOGAT1基因第25940位的单核苷酸多态性，TT基因型表现为461bp的一个条带；CC基因型表现为260和201bp的两个条带；TC基因型表现为461、201和260bp的三个条带。

上述检测黄牛MOGAT1基因单核苷酸多态性的方法在黄牛分子标记辅助选择育种中的应用，所述单核苷酸多态性位点是用于黄牛肉用生长性状(例如，体重等)早期选育的分子标记位点。

一种检测黄牛MOGAT1基因单核苷酸多态性的试剂盒，该试剂盒包括上述引物对P1。

本发明的有益效果体现在：

本发明根据所发现的分布于黄牛种群(秦川牛、夏南牛、皮南牛和云岭牛)中的MOGAT1基因第25940位T到C的突变(g.25940T>C)，并利用该突变所形成的限制性内切酶酶切位点，提出了基于PCR-RFLP法的黄牛MOGAT1基因单核苷酸多态性检测方法；该方法通过电泳检测，可以准确、快速、方便的对MOGAT1基因第25940位进行单核苷酸多态性分型鉴定。本发明通过将黄牛MOGAT1基因单核苷酸多态性与体重等生长性状进行关联分析，发现上述突变位点具有可用于黄牛分子育种中辅助选择的SNP标记，从而可以通过生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的黄牛专门化肉用种群。

附图说明

图1为黄牛MOGAT1基因现出多态性的25940位突变g.25940T>C的测序图；

图2为黄牛MOGAT1基因PCR扩增产物TaqI酶切条带电泳图；其中M表示Marker。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。所述实施例是对本发明的解释，而不是对本发明保护范围的限制。

本发明利用PCR-RFLP法对对四个黄牛品种(秦川牛、夏南牛、皮南牛和云岭牛)MOGAT1基因第25940位突变位点(g.25940T>C)进行单核苷酸多态性(SNP)检测，并将该位点不同基因型与黄牛生长性状进行关联分析，筛选到与黄牛体重等生长性状密切相关的SNP标记，可根据SNP类型进行生长性状优异的黄牛种群的选育，具体过程如下。

1、黄牛血液样本采集

秦川牛：共计102头成年基础母牛，年龄2岁，采自陕西省宝鸡市扶风县秦川肉牛良种繁育中心，采集时间：2013年1月。

夏南牛：共计60年基础母牛，年龄2岁，采集自河南省驻马店市泌阳县夏南牛科技有限公司，采集时间：2016年1月。

皮南牛：共计100头成年基础母牛，年龄2岁，采自河南省南阳市新野县，采集时间：2016年2月。

云岭牛：共计130头成年基础母牛，年龄2岁，采自云南省昆明市官渡区小哨乡草地动物科学研究院，采集时间：2018年9月。

针对进行了血样采集的各品种黄牛，收集了相应黄牛的体尺数据。

2、血样基因组DNA的提取

①冷冻血样(主要为血细胞)室温解冻，吸取500μL血液于1.5mL离心管中，加入等体积的磷酸缓冲液(PBS)混匀，温和摇动，4℃、12000r/min离心5min，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明。

②在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，轻轻吹打，使血细胞沉淀脱离离心管壁，37℃水浴1h。

③加蛋白酶K至5μL(20mg/mL)，并混匀，55℃水浴中消化过夜(16h左右)至絮状沉淀不见，溶液澄清，尚未澄清的，可补加10μL蛋白酶K混匀，继续消化直至澄清。

④将反应液冷却至室温，加入500μL Tris饱和酚，温和摇动15min，使其充分混匀，4℃、12000r/min离心10min，将上层水相转入另一灭菌离心管，重复本步骤1次。

⑤加入氯仿500μL，温和摇动20min，充分混匀，4℃、12000r/min离心15min，将上层水相转入另一灭菌的1.5mL离心管。

⑥加入氯仿:异戊醇混合液(24:1)500μL，充分混合20min，4℃、12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中。

⑦加入0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷无水乙醇，混合转动离心管直至白色的絮状沉淀析出。

⑧4℃、12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。

⑨4℃、12000r/min离心10min，弃上清液，室温下使乙醇挥发干净。

⑩干燥后的DNA中加入80～100μL的TE，4℃保存直至DNA完全溶解，利用紫外分光光度仪泳检测其质量，-80℃保存。

3、黄牛MOGAT1基因突变位点PCR扩增引物的设计

以NCBI数据库公布的MOGAT1基因序列(NC_037329.1)为参考序列，并根据筛选出突变位点g.25940T>C，利于Primer5软件进行上、下游引物设计，引物序列(表1)由上海生工公司合成。

表1.突变位点扩增引物设计

利用以上引物对P1可以扩增黄牛MOGAT1基因第五内含子区域的基因片段，对扩增片段进行测序鉴定(图1)后，发现在第25940位存在的T到C的突变，可形成TaqI的酶切位点。

4、黄牛MOGAT1基因突变位点扩增的反应体系及程序

利用PCR程序进行扩增，反应体系为10μL(表2)，使用血样基因组DNA做模板，反应程序如表3所示；

表2.PCR反应体系

表3.PCR反应的程序

扩增结束后，用10μL移液枪取3μL PCR产物样品进行2％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为：120V、30min(室温)。利用凝胶电泳成像系统进行扩增结果的检测，扩增条带清晰且大小准确，可进行酶切。

5、PCR产物酶切和电泳

酶切反应体系成分组成及用量见表4：

表4.限制性内切酶酶切反应体系

注：酶切条件为37℃消化5～10h。

酶切后采用2.0％琼脂糖凝胶电泳进行检测并记录结果。结果参见图2，TT基因型表现为461bp的一个条带；CC基因型表现为260和201bp的两个条带；TC基因型表现为461、201和260bp的三个条带。

6、黄牛MOGAT1基因SNP位点的统计分析

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率，计算的公式可以写成：

P_SS＝N_SS/N

其中，P_SS代表某一位点的SS基因型频率；N_SS表示群体中具有SS基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率，计算的公式可以写成：

P_S＝(2N_SS+N_Ss1+N_Ss2+N_Ss3+N_Ss4+……+N_Ssn)/2N

其中，P_S表示等位基因S频率，N_SS表示群体中具有SS基因型的个体数量，N_Ssi表示群体中具有Ssi基因型的个体数量，s1－sn为等位基因S的n个互不相同的复等位基因。

在不同品种黄牛(秦川牛、夏南牛、皮南牛和云岭牛)中，MOGAT1基因SNP位点的基因及基因型频率见表5。

表5.黄牛MOGAT1基因g.25940T>C的群体遗传学分析

由表5可知，MOGAT1基因在夏南牛和皮南牛中处于较低多态性，在云岭牛和秦川牛中处于中度多态性；在四个品种黄牛群体中，野生纯合基因型TT均为优势基因型，等位基因T的频率也高于C的频率；MOGAT1基因在云岭牛、秦川牛和皮南牛中处于哈代温伯格平衡，在夏南牛群体中这种平衡状态被打破。

7、SNP位点基因效应的关联分析

以黄牛MOGAT1基因g.25940T>C为候选位点，通过PCR-RFLP方法检测该位点在不同黄牛品种中的单核苷酸多态性突变情况，并与对应个体的生长性状进行关联分析。

基因型数据：TaqI酶切、电泳后识别的基因型(TT、CC和TC)。

体尺数据：体高、十字部高、胸宽、尻长、腰角宽、胸深、坐骨端宽、胸围、体重、体斜长等。

关联分析模型：

先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，应用SPSS(20.0)软件的GLM过程分析基因型和品种对各性状效应。在对基因型效应进行分析时采用了简化模型：

Y_ik＝μ+G_k+e_ik

其中，Y_ik为性状观察值，μ为总体均值，G_k为第k个单SNP标记基因型的固定效应，e_ik为随机误差。

不同品种黄牛的关联分析具体结果参见表6至表9。

表6.MOGAT1基因SNP与秦川牛生长性状关联分析

注：*表示差异显著，P<0.05；平均值肩上字母不同表示存在显著差异；括号中数字表示个体数。

表7.MOGAT1基因SNP与夏南牛生长性状关联分析

注：*表示差异显著，P<0.05；平均值肩上字母不同表示存在显著差异；括号中数字表示个体数。

表8.MOGAT1基因SNP与皮南牛生长性状关联分析

注：括号中数字表示个体数。

表9.MOGAT1基因SNP与云岭牛生长性状关联分析

注：*表示差异显著，P<0.05；平均值肩上字母不同表示存在显著差异；括号中数字表示个体数。

结果表明(见表6至表9)：针对MOGAT1基因g.25940T>C这一SNP位点，在秦川牛群体中，基因型为突变纯合型CC的个体在体重性状上较优(P<0.05)；在夏南牛群体当中，基因型为突变纯合型CC的个体在体重性状上较优(P<0.05)；在云岭牛群体中，野生纯合型TT和杂合型TC的个体在胸深性状上较优(P<0.05)；上述SNP位点的基因型与皮南牛的生长性状并无显著关联性。

8、SNP标记在牛选育中的应用

上述SNP位点的基因型可作为候选分子遗传标记，寻找与其相关或紧密连锁的影响黄牛生长性状的数量性状基因座，以对秦川牛、夏南牛、皮南牛和云岭牛等品种的黄牛进行分子标记辅助选择，从而加快黄牛专门化肉用品种改良的选育进程。

<110> 河南省畜牧总站

<120> 黄牛MOGAT1基因SNP标记辅助选择生长性状的方法及应用

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<212> DNA

<213>人工合成

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