阅读说明：本技术 抑制肺腺癌的靶标crtac1及其应用 (Target CRTAC1 for inhibiting lung adenocarcinoma and application thereof ) 是由 黄海山 常园园 李海英 金红蕾 于 2020-06-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种CRTAC1作为靶点在制备诊断和治疗肺腺癌的药物中的应用,可作为肺腺癌细胞生长增殖和侵袭迁移的靶点。本发明具有如下作用：过表达CRTAC1抑制肺腺癌细胞增殖；过表达CRTAC1抑制裸鼠皮下成瘤能力；过表达CRTAC1抑制肺腺癌细胞迁移和侵袭；过表达CRTAC1抑制裸鼠肺转移灶的形成。(The invention discloses application of CRTAC1 as a target point in preparation of a medicine for diagnosing and treating lung adenocarcinoma, and the CRTAC1 can be used as a target point for growth, proliferation, invasion and migration of lung adenocarcinoma cells. The invention has the following functions: overexpression of CRTAC1 inhibits lung adenocarcinoma cell proliferation; the capability of over-expressing CRTAC1 for inhibiting subcutaneous tumor formation of nude mice; overexpression of CRTAC1 inhibits migration and invasion of lung adenocarcinoma cells; overexpression of CRTAC1 inhibited the formation of lung metastases in nude mice.)

抑制肺腺癌的靶标CRTAC1及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及肺腺癌细胞生长增殖和转移研究的新靶点及其应用，检测CRTAC1的mRNA或者蛋白表达水平，进一步可以作为肺腺癌进行诊断和预后标志物，以及期望其成为新的肺腺癌治疗新靶点。

背景技术

肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一，据《The Lancet》最新公布的CONCORD-3(全球癌症生存分析第三轮)的调研结果显示：大多数国家肺癌患者五年生存率在10-19％之间，中国为19.4-20.2％。据我国癌症中心最新统计数据显示：肺癌位居全国发病首位，每年发病约78.1万，占各类型癌症的比重达到20.55％。在中国及全球范围内，肺癌都是发病率及死亡率最高的癌症。

根据肺癌组织病理类型及特征可分为：小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，其中约80％-85％的肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)，NSCLC在组织学上可进一步分为四类：(1)肺腺癌；(2)鳞状细胞癌；(3)大细胞癌；(4)其他。肺腺癌又是相对常见的类型。相对于小细胞肺癌恶性程度高，易侵犯、易转移，病程短、进展快，生存期短的特点，非小细胞肺癌生长***缓慢，扩散转移晚，恶性程度相对低，病程较长，五年生存率高。虽然近年来肿瘤免疫与分子靶向治疗研究在肺癌研究中有一定突破性的进展，也有大量肺癌的研究成果用于指导临床治疗，但是由于靶点耐受、脱靶效应、表观遗传耐受、肿瘤微环境的变化等因素的影响，目前缺少有效的诊断与治疗方法，而据文献报道高达69％的晚期非小细胞肺癌患者可能具有潜在的、可行的分子靶点，所以，鉴定出一种天然分子能特异性的抑制肺癌发生发展对于该疾病的临床治疗将具有重大意义，而目前对于广大科研者来说，对肺癌新机制新靶点的研究仍然任重而道远。

CRTAC1基因，定位于人体第10号染色体，该基因可编码糖基化的细胞外基质蛋白即软骨酸性蛋白1，由软骨细胞分泌，该基因的表达具有组织特异性：在关节深区软骨的区域间基质中表达。已有研究表明：(1)该蛋白质可作为一种新的人类标记物，可用来从培养物中的成骨细胞和间充质干细胞中区分人软骨细胞。(2)该蛋白可能参与细胞与细胞或细胞与基质间的相互作用。据NCBI数据库资料显示，该基因编码的同种型1和同种型2在脑中表达，在肺和软骨细胞中均可检测到同种型1。目前对CRTAC1基因的研究主要集中在基因组学分析，而在基础医学方面，仅在白内障治疗和神经纤维瘤病1型(NF1)发病机制方面有少数有报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供调控肺腺癌进展的靶点CRTAC1及其应用，即，提供CRTAC1作为肺腺癌细胞生长增殖和侵袭迁移的靶点及其应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供CRTAC1作为靶点(特异性标志物)在制备诊断和治疗肺腺癌的药物中的应用。

作为本发明应用的改进：作为肺腺癌细胞生长增殖和侵袭迁移的靶点。

作为本发明应用的进一步改进：检测CRTAC1的mRNA或者CRTAC1的蛋白表达水平。

作为本发明应用的进一步改进：用于扩增CRTAC1基因片段的引物(即，特异性扩增CRTAC1 mRNA的引物)为：

Forward 5'-GGTGTCGCCCTGGCTGACTT-3'

Reverse 5'-GAGAACTTGGGTGAGGCGATGTC-3'。

作为本发明应用的进一步改进：包括与CRTAC1蛋白特异性结合的抗体。

说明：图1C，1E，3A，3D，5A，5D，7D中均使用与CRTAC1蛋白特异性结合的抗体。

作为本发明应用的进一步改进：CRTAC1基因表达的增强剂用于制备治疗肺腺癌的药物。

作为本发明应用的进一步改进：药物包含CRTAC1基因表达的增强剂和药物学可接受的载体。

作为本发明应用的进一步改进：所述增强剂为CRTAC1基因过表达质粒，具体为：制备过表达CRTAC1的药物，用于治疗肺腺癌。

作为本发明应用的进一步改进，至少为以下任一：

过表达CRTAC1抑制肺腺癌细胞增殖；过表达CRTAC1抑制裸鼠皮下成瘤能力；过表达CRTAC1抑制肺腺癌细胞迁移和侵袭；过表达CRTAC1抑制裸鼠肺转移灶的形成。

本发明首次公开CRTAC1在肺腺癌中的作用，可以在体内外促进肺腺癌细胞的增殖和转移。同时，TCGA和临床标本的一致表明CRTAC1在肺腺癌和肺鳞癌表达增高，但其表达上调仅在肺腺癌中与病人的生存期成正相关，进一步功能实验结果也发现CRTAC1仅在肺腺癌中发挥其生物学功能。由此可见CRTAC1可以作为肺腺癌特异性预后及治疗靶标。

本发明所采取的技术方案如下：通过生物信息学分析TCGA数据库(Cancer GenomeAtlas)中的肺腺癌数据，筛查到CRTAC1在肺腺癌中的表达上调，进一步采用Real-time PCR和免疫组织化学染色(IHC)技术检测CRTAC1在人肺腺癌组织与癌旁组织中的表达情况。体外软琼脂集落形成实验(soft agar assay)检测CRTAC1对肺腺癌细胞生长增殖能力的影响,同时体外Transwell实验证明CRTAC1可在体外抑制肺腺癌细胞迁移和浸润。

进一步过表达CRTAC1可在体外显著抑制肺腺癌细胞增殖以及迁移和侵袭能力，在体内显著抑制癌细胞肺转移。

本发明有益效果如下：本发明以肺腺癌H1299、A549和HCC827细胞为模型，过表达CRTAC1可在体内外抑制肺腺癌细胞生长增殖和侵袭迁移。可见，可以通过增加外源性CRTAC1水平来治疗肺腺癌。利用实时荧光定量PCR技术，生物信息学分析TCGA数据库等方法检测临床大部分肺腺癌组织中CRTAC1表达均呈显著下调趋势。可见，通过检测CRTAC1的表达，可以辅助诊断肺腺癌。

综上所述，本发明公开了一个肺腺癌细胞生长增殖和侵袭迁移相关的靶点CRTAC1及其应用。具体而言，本发明在细胞水平并结合动物模型及临床组织标本，发现CRTAC1可能具有抑制肺腺癌细胞增殖和转移的作用。本发明首次发现CRTAC1作为肺腺癌细胞生长增殖和侵袭迁移的靶点，可在临床肺癌防治方面发挥重要作用。

附图说明

下面结合附图对本发明的

具体实施方式

作进一步详细说明。

图1为CRTAC1在人正常肺上皮细胞及肺正常组织中呈显著高表达；

图1中，

A为生物信息学分析TCGA数据库中CRTAC1在肺腺癌组织对比正常肺组织的实时荧光定量PCR结果；

B为用36对临床肺腺癌标本做real-time PCR分析，对比正常肺组织中CRTAC1的表达水平；

C-D为利用免疫组化技术在临床肺腺癌组织及正常组织中检测CRTAC1的蛋白表达水平；

E为对比人正常肺上皮细胞与肺腺癌细胞系中CRTAC1蛋白表达情况；

Normal代表人肺腺癌癌旁组织，Tumor代表人肺腺癌组织。

图2为肺腺癌患者DFS无病生存期分析。

图3为过表达CRTAC1在体外显著抑制肺腺癌细胞增殖能力；

图3中，

A为已在H1299细胞中成功构建过表达CRTAC1稳转细胞系；B、C为在H1299上过表达CRTAC1后，进行软琼脂克隆形成实验及数据分析；

D为已在A549细胞中成功构建过表达CRTAC1稳转细胞系；E、F为在A549上过表达CRTAC1后，进行软琼脂克隆形成实验及数据分析。

图4为过表达CRTAC1显著抑制肺腺癌细胞裸鼠皮下成瘤的能力；

图4中，A-C为过表达CRTAC1对肺腺癌H1299细胞裸鼠皮下成瘤的影响；D-F为过表达CRTAC1对肺腺癌A549细胞裸鼠皮下成瘤的影响；

具体如下：

A：将2.5×10⁶个H1299(CRTAC1)肿瘤细胞或其相对应的对照细胞注射至裸鼠右背部的成瘤情况；

B：处死注射2.5×10⁶个H1299(CRTAC1)肿瘤细胞或其相对应的对照细胞的小鼠，并取出肿瘤，拍摄肿瘤照片；

C：记录小鼠皮下肿瘤重量，并进行统计分析；

D：将2.5×10⁶个A549(CRTAC1)肿瘤细胞或其相对应的对照细胞注射至裸鼠右背部的成瘤情况；

E：处死注射2.5×10⁶个A549(CRTAC1)肿瘤细胞或其相对应的对照细胞的小鼠，并取出肿瘤，拍摄肿瘤照片；

F：记录小鼠皮下肿瘤重量，并进行统计分析。

图5为CRTAC1在体外抑制肺腺癌细胞的迁移和侵袭；

图5中，

A为在肺腺癌HCC827上已成功构建过表达CRTAC1稳转细胞系；

B和C为HCC827过表达CRTAC1细胞较其对照细胞的侵袭小室实验及定量数据分析；

D为在肺腺癌H1299上已成功构建过表达CRTAC1稳转细胞系；

E和F为H1299过表达CRTAC1细胞较其对照细胞的侵袭小室实验及定量数据分析。

图6为过表达CRTAC1显著抑制肺腺癌细胞裸鼠肺转移能力；

图6中，

A为尾静脉注射稳转细胞系HCC827(Vector)、HCC827(CRTAC1)构建裸鼠肺转移模型、以及取肺转移模型的裸鼠肺组织固定包埋做石蜡切片并进行H&E染色分析。

B为裸鼠肺转移灶数量统计。

图7为CRTAC1可能不参与肺鳞癌细胞的进展，且其表达量与肺鳞癌患者预后无显著相关；

图7中，

A生物信息学分析TCGA数据库中CRTAC1在肺腺癌组织对比正常肺组织的实时荧光定量PCR结果；

B为利用实时荧光定量PCR技术，检测了18对临床肺鳞癌组织中CRTAC1的mRNA表达情况；

C为肺腺癌患者DFS无病生存期分析；

D在肺鳞癌H226中已成功构建过表达CRTAC1稳转细胞系；

E-F在H226上过表达CRTAC1后，进行软琼脂克隆形成实验及数据分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1、CRTAC1在肺腺癌组织及细胞系中表达一致下调

1)利用GraphPad Prism软件对TCGA数据库中58对肺腺癌患者CRTAC1 mRNA的表达进行t-test结果分析，P<0.05表明相比较的两组数据有显著性差异(图1A)。

2)组织样本

本发明中所用的肺腺癌临床样本为合作医院提供，且组织经病理相关医师诊断为肺腺癌。标本采集时选取肺腺癌组织周围3cm左右位置为癌旁组织对照，组织均取一部分用4％PFA固定处理，剩余冻于-80度备用。所有患者均有姓名、病理信息等详细资料。实验操作经伦理审查批准。

3)组织/细胞总RNA提取

1.从-80℃冰箱中取出收集的肺癌组织样本，剪取30-50g样本加入去酶EP管中，置于冰上；细胞2×10⁶个以内。加入1mL的Trizol后用组织匀浆器匀浆组织以尽量研磨完全或吹打细胞直至完全溶解。

2.涡旋振荡器震荡后，室温平衡5-10min。

3.加入200μl氯仿(chloroform)，剧烈震荡1min，室温静置2-3min。

4.样品12000g，4℃离心15min，离心后尽量多吸取上清至新的去酶EP管。

5.加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀数次，冰上静置10min。12000g，4℃离心10min后弃上清。

6.EP管中加1mL 75％无水乙醇将沉淀轻轻吹起，7500g，4℃离心5min后弃上清。

7.重复步骤6一次。

8.空气中干燥RNA沉淀5-10min后用10-20μL无酶水溶解RNA。

9.使用BioDrop仪器检测样本的浓度及纯度。

4)mRNA逆转录

将所需组织，细胞按照先前介绍的方法处理并提取RNA后，使用美国Invitrogen公司所购SuperScript^TM IV逆转录酶进行逆转录，配制RT反应体系如下：

振荡混匀后，快速离心PCR管，将其置于PCR仪中，设置PCR仪65℃反应5min后放置冰上3min；加入如下配制的RT反应体系：

即，上述体系混匀后，快速离心然后加入已进行第一步的PCR管中，混匀后放入PCR仪中，设置程序：56℃13min→80℃10min得cDNA，密封后-80℃保存。

5)荧光定量PCR检测mRNA

荧光定量PCR检测mRNA的表达，将所需的上述组织、细胞获得的cDNA，使用美国Qiagen公司所购Kit进行PCR，步骤如下：配制PCR反应体系如下，冰上操作。

充分混匀以上反应体系，然后加入384孔板中，每个样本3个复孔，短暂离心以便试剂混匀，置于Q6荧光定量PCR仪中检测。q-PCR反应，预变性95℃，30s，循环条件如下：扩增40个循环，95℃，变性5秒，退火58℃，30秒，72℃延伸，30s。如图1B所示，对36对临床肺腺癌标本做Real-time PCR分析，发现对比正常肺组织中CRTAC1在肺腺癌组织中表达水平显著降低。

引物序列如下：

1.CRTAC1 q-PCR检测引物

Forward 5'-GGTGTCGCCCTGGCTGACTT-3'

Reverse 5'-GAGAACTTGGGTGAGGCGATGTC-3'

2.GAPDH q-PCR检测引物

Forward 5'-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3'

Reverse 5'-CAGGTCAGGTCCACCACTGA-3'

6)利用免疫组织化学实验(Immunochemistry)探索CRTAC1在肺腺癌组织中的表达。通过对24对临床肺腺癌组织样本进行免疫组织化学实验并且使用a DS-Ri2 EclipseNi microsystem软件进行拍照留档(图1C)。随后利用Image-Pro Plus软件统计，且将统计的结果使用GraphPad Prism软件进行统计结果分析(图1D)，结果表CRTAC1在肺腺癌组织中表达下调。

7)利用蛋白免疫印迹实验探索CRTAC1在肺正常支气管上皮细胞及肺腺癌细胞系中蛋白的表达，发现肺腺癌细胞系H1299，A549，HCC827中CRTAC1蛋白表达显著下调(图1E)。

实施例2、

利用GraphPad Prism软件对TCGA数据库中401例肺腺癌患者CRTAC1的生存信息进行Kaplan-Meier生存分析，高表达CRTAC1(>median；n＝109)和低表达CRTAC1(<median；n＝292)分类的肺腺癌样本的总体生存率结果显示P<0.05，表明相比较的两组数据有显著性差异，随着肺腺癌患者癌组织中CRTAC1表达量升高，肺腺癌病人的生存期也随之延长(图2A)。即，CRTAC1表达量与肺腺癌病人的生存期显著正相关(图2A)。

实施例3、过表达CRTAC1显著抑制肺腺癌细胞增殖能力

1)选用H1299和A549细胞作为研究对象，在H1299和A549细胞中感染GFP-CRTAC1质粒及GFP空载质粒病毒上清，并用Puromycin药物筛选，建立稳定细胞株H1299(CRTAC1)，A549(CRTAC1)及其对照细胞株H1299(Vector)，A549(Vector)。采用Western Blot检测过表达效果，以β-Actin作为内参，如图3A和3D所示。

2)采用软琼脂克隆形成实验，室温环境下，在超净工作台中配置medium，并取12.6ml(1.8ml×7)于45-46℃预热10min以上。微波加热煮沸agar 3次，冷却至45-46℃后取8.4ml(1.2ml×7)agar于medium预热管中快速混匀，吸取3ml/孔铺下层agar胶，自然凝固大于3h。室温环境下，在超净工作台中吸弃细胞所在的旧培养基，加入适量PBS轻轻清洗并吸弃，再加入适量胰酶，显微镜下观察细胞消化直至轮廓变圆(一般1-2min)后立即吸弃胰酶。随后加入适量细胞培养基终止胰酶的消化，用1ml移液枪枪轻轻吹下细胞，将细胞悬液吸至相应的离心管或EP管中。细胞悬液1500r/min，离心5分钟，室温。吸弃旧培养基，加入相应的新鲜培养基轻轻混匀。提前准备好干净无污的牛鲍计数板，吸取10ul细胞悬液充池计数。计数换算每孔需要加入的细胞量。当medium与细胞混匀后，快速加入agar轻轻混匀，勿产生气泡，快速加入到六孔板中静止凝固。自然冷却凝固大于3h，用封口膜封闭，放置37℃，5％CO₂培养箱培养。1-2w后观察克隆形成情况，实时观察克隆形成情况。一般以统计的克隆中每个克隆的细胞数大于等于32个细胞为准，选取恰当时间进行克隆拍摄。如图3B-C，3E-F所示，其差异具有统计学意义。

根据图3B-C，3E-F，可得知：过表达CRTAC1后，肺腺癌细胞增殖能力显著减弱。

实施例4、过表达CRTAC1显著抑制裸鼠皮下成瘤的能力

裸鼠皮下成瘤实验

1)本发明中所用实验动物为BALB/C-nu雌性裸鼠，3-4周龄，体重15±0.5g，由江苏集萃药康生物科技有限公司供应，于温州医科大学实验动物中心SPF级实验区域饲养，所有动物实验均依据温州医科大学实验动物伦理委员会批准的实验方案进行。

2)裸鼠皮下成瘤实验

进行肺腺癌细胞培养，当达到所需的细胞量，且细胞处于对数生长期，弃去培养基，PBS洗一遍；0.25％胰酶消化后1min，培养基终止，离心后用PBS重悬，检测细胞活力并计数细胞总数，将细胞浓度调整至2.5×10⁷/mL，将稳定转染细胞系A549/H1299(Vector)，A549/H1299(CRTAC1)皮下接种0.1mL于4周龄的裸鼠，每组5只。

接种后的第45天左右，利用统计软件进行分析可得知：过表达CRTAC1能显著抑制肺腺癌细胞的裸鼠体内异位移植瘤的生长。

实施例5、过表达CRTAC1显著抑制肺腺癌细胞迁移和侵袭的能力

在肺腺癌HCC827及H1299上已成功构建过表达CRTAC1稳转细胞系(图5A和5D)；在肺腺癌细胞HCC827中感染GFP-CRTAC1质粒及GFP空载质粒病毒，并用Puromycin药物筛选，建立稳定细胞株HCC827(CRTAC1)及其对照细胞株HCC827(Vector)。

通过侵袭小室实验来检测过表达CRTAC1对人肺腺癌H1299及HCC827细胞迁移和侵袭能力的影响。使用BD BioCoat^TM Matrigel^TM Invasion Chamber检测过表达CRTAC1细胞以及对照细胞的迁移和侵袭能力。经统计学分析，星号表示在H1299和HCC827细胞间有显著差异(P<0.05)。图5B-C和5E-F表明过表达CRTAC1细胞较其对照细胞的迁移和侵袭能力均显著被抑制。

实施例6、过表达CRTAC1可显著抑制肺腺癌细胞的裸鼠体内肺转移能力

裸鼠尾静脉注射实验：

裸鼠注射部位尾部用75％酒精消毒。接种前充分混匀细胞悬液(分别为2×10⁷/mLHCC827(CRTAC1)以及其对照细胞)，1mL无菌注射器吸取100μL细胞悬液，将细胞悬液注射于小鼠尾静脉，每种细胞注射5只裸鼠。5周后将裸鼠拍照后处死，肿瘤取出称重，并拍照记录大小。如图6A-B所示,与对照组相比，过表达CRTAC1的实验组的肺转移肿瘤数量偏少且体积明显偏小；因此，根据图6，可得知：过表达CRTAC1可显著抑制肺腺癌细胞的体内肺转移能力。

实施例7、CRTAC1在肺鳞癌组织中表达上调但不影响肺鳞癌细胞的功能

1)利用GraphPad Prism软件对TCGA数据库中4对肺鳞癌患者CRTAC1 mRNA的表达进行t-test结果分析，P<0.05表明相比较的两组数据有显著性差异(图7A)。

另外还检测了18对临床肺鳞癌标本中CRTAC1的mRNA水平，相比于正常肺组织肺鳞癌组织中CRTAC1表达显著降低(图7B)。利用GraphPad Prism软件对TCGA数据库中374例肺腺癌患者CRTAC1的生存信息进行Kaplan-Meier生存分析，发现肺鳞癌中CRTAC1的表达与病人的生存期无明显相关(图7C)。

2)在肺鳞癌细胞H226中构建过表达CRTAC1稳转细胞系，并用蛋白免疫印迹进行鉴定(图7D)。进行软琼脂集落形成实验，将细胞铺于软琼脂中，37℃、5％CO 2培养箱培养3-4周拍摄特征性图像并分析。通过细胞克隆计数发现，过表达CRTAC1并不影响肺鳞癌细胞的增殖能力(图7E-F)。

因此，可以证明：CRTAC1可能在肺腺癌的增殖方向发挥着与肺鳞癌不同的特异调节作用，表明CRTAC1特异性抑制肺腺癌的生物学特性。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 温州医科大学

<120> 抑制肺腺癌的靶标CRTAC1及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggtgtcgccc tggctgactt 20

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gagaacttgg gtgaggcgat gtc 23