一种直肠癌相关的分子标记物及其用途
阅读说明：本技术 一种直肠癌相关的分子标记物及其用途 (Molecular marker related to rectal cancer and application thereof ) 是由 邵阳 章真 鲍海蓉 朱骥 包华 王雅琪 常志力 于 2020-07-17 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种直肠癌相关的分子标记物及其用途,属于医学分子生物学技术领域。本发明进行了两个关键性的设计,一是应用425个癌症相关基因的全外显子大panel而不是少数热点基因的小panel来进行ctDNA检测,这样不仅获得了单个基因突变与nCRT疗效的相关性,还获得多个信号通路的基因变异与nCRT疗效的相关性。二是术前设置多个监测时间点(4个时间点),结合425个基因大panel,同时对ctDNA中突变的清除和获得性突变的动态变化进行监测。展示了ctDNA动态监测在nCRT疗效预测中的价值,并对W&W策略的患者选择提出了新的见解。证明了ctDNA检测在早期预测LARC患者预后中的作用。(The invention relates to a molecular marker related to rectal cancer and application thereof, belonging to the technical field of medical molecular biology. Two key designs are carried out in the invention, namely, the full-exon large panel of 425 cancer-related genes is applied to carry out ctDNA detection instead of the small panel of a few hot spot genes, so that the correlation between single gene mutation and nCRT curative effect is obtained, and the correlation between gene variation of a plurality of signal paths and the nCRT curative effect is also obtained. Secondly, a plurality of monitoring time points (4 time points) are set before the operation, 425 gene large panels are combined, and the elimination of the mutation in the ctDNA and the dynamic change of the acquired mutation are monitored. Demonstrates the value of ctDNA dynamic monitoring in nCRT efficacy prediction and presents new insights into patient selection for W & W strategies. Demonstrating the role of ctDNA detection in early prediction of the prognosis of LARC patients.)
技术领域
本发明涉及一种直肠癌相关的分子标记物及其用途，属于医学分子生物学技术领域。
背景技术
结直肠癌(CRC)是世界范围内第三大常见癌症和第四大癌症相关死亡原因。直肠癌约 占CRC的30％，局部晚期直肠癌(LARC)占所有直肠癌的50％。目前，新辅助放化疗(nCRT) 和全直肠系膜切除(TME)联合辅助化疗是国家综合癌症网络(NCCN)指南推荐的LARC 的标准治疗方法。大约10-35％的nCRT患者在手术时可以获得病理完全缓解(pCR)。pCR 患者预后较好，局部复发和远处转移较少，5年总生存率高。然而，传统的根治性手术可能 会导致严重的并发症和对肠道、***和性功能的长期负面影响。因此，一种被称为“观 察和等待”(W&W)的非手术治疗方法已经被广泛地应用于nCRT治疗后出现临床完全缓解 (cCR)的患者。目前，cCR评估标准包括内镜、MRI和数字化检查未发现残留肿瘤。临床 希望通过cCR来判断pCR，但遗憾的是这两者之间只有30％～50％的符合率。此外最近的一 项研究表明，接受W&W治疗的患者的5年总生存率和无病生存率(DFS)低于TME治疗证 实为pCR的患者。在这种情况下，临床评估之外的pCR预测将有助于更好地选择使用W&W 方法的患者。
循环肿瘤DNA(ctDNA)已被用作转移性结直肠癌化疗疗效的预测因子，然而很少有研 究探讨ctDNA在预测LARC患者nCRT病理反应中的作用。此外，ctDNA在结肠癌患者接受辅助化疗后的早期复发检测中显示了其价值，但ctDNA在LARC患者nCRT治疗后的风险分 层和治疗策略指导中的潜在作用尚未得到充分评价。
发明内容
本发明证实了ctDNA动态监测在局部晚期直肠癌(LARC)新辅助放化疗(nCRT)疗效评估和预后预测中的可行性和有效性。我们对研究进行了两个关键性的设计，第一个是应用 425个癌症相关基因的全外显子大panel而不是少数热点基因的小panel来进行ctDNA检测， 这样不仅获得了单个基因突变与nCRT疗效的相关性，还获得多个信号通路的基因突变与 nCRT疗效的相关性。二是术前设置多个监测时间点(4个时间点)，结合425个基因大panel， 同时对ctDNA中突变的清除和获得性突变的动态变化进行监测。展示了ctDNA动态监测在nCRT疗效预测中的价值，并对W&W策略的患者选择提出了新的见解。我们还证明了ctDNA 检测在早期预测LARC患者预后中的潜在作用。
本发明的第一个方面，提供了：
POLD1和/或FAT1基因的突变检测试剂在用于制备对局部晚期直肠癌病人在治疗后的治 疗效果进行预测试剂中的应用。
在一个实施方式中，所述的治疗是指nCRT治疗。
在一个实施方式中，所述的治疗效果进行预测是指区分为完全病理缓解(pCR)或者未 完全病理缓解(non-pCR)。
在一个实施方式中，所述的突变检测试剂是用于在时间1进行血浆中基因突变频率的检 测；所述的时间1是指nCRT治疗前。
在一个实施方式中，所述的nCRT治疗可以采用卡培他滨联合伊立替康方案。
本发明的第二个方面，提供了：
粘附连接(AJ)、组蛋白甲基转移酶(HM)、DNA损伤修复(DR)和/或破骨细胞分化(OD)信号通路相关基因的突变检测试剂在用于制备对局部晚期直肠癌病人在治疗后的治疗 效果进行预测试剂中的应用。
在一个实施方式中，所述的治疗是指nCRT治疗。
在一个实施方式中，所述的治疗效果进行预测是指区分为完全病理缓解(pCR)或者未 完全病理缓解(non-pCR)。
在一个实施方式中，所述的突变检测试剂是用于在时间1进行血浆中基因突变频率的检 测；所述的时间1是指nCRT治疗前。
在一个实施方式中，所述的nCRT治疗可以采用卡培他滨联合伊立替康方案。
本发明的第三个方面，提供了：
对于血浆中的ctDNA的突变进行检测的试剂在用于制备局部晚期直肠癌病人在治疗后的 治疗效果进行预测试剂中的应用。
在一个实施方式中，所述的治疗效果进行预测是指对肿瘤退缩分级(TRG)预测。
在一个实施方式中，所述的治疗是指nCRT治疗。
在一个实施方式中，所述的预测试剂是用于在时间1、时间2、时间3、时间4进行血浆 中基因突变频率的检测或者最高变异等位基因频率的突变的检测；所述的时间1是指：nCRT 治疗前；所述的时间2是指：nCRT放疗第15次时；所述的时间3是指：nCRT放疗第25次时；所述的时间4是指：TME术前0-1d；所述的时间5是指：TME术后5-12d。
在一个实施方式中，所述的应用中还包括：判定ctDNA的清零率，包括以下两种判定方 法中的任意一种：
(1)判定时间1检测得到的血浆ctDNA中最高变异等位基因频率(VAF)的突变在时间2、3或者4是否清零；
(2)判断时间1检测得到的血浆ctDNA中所有检出突变在时间2、3或者4是否清零。
本发明的第四个方面，提供了：
对TP53、APC或者KRAS基因突变的检测试剂在用于制备局部晚期直肠癌病人在治疗 后的无病生存期(DFS)预测试剂中的应用。
在一个实施方式中，所述的检测试剂是用于在时间1进行血浆中基因突变的检测；所述 的时间1是指nCRT治疗前。
在一个实施方式中，所述的无病生存期是指新辅助放化疗(nCRT)和全直肠系膜切除 (TME)联合辅助化疗的联合治疗后的无病生存期。
本发明的第五个方面，提供了：
用于对血浆ctDNA所有检出突变进行检测的试剂在用于制备局部晚期直肠癌的无病生存 期(DFS)预测试剂中的应用。
在一个实施方式中，所述的对血浆ctDNA所有检出突变进行检测的试剂是分别用于时间 点1、2、3、4和5的检测；所述的应用中还包括：判定时间1血浆ctDNA中所有检出突变在时间2、3、4或者5是否清零；所述的时间1是指：nCRT治疗前；所述的时间2是指：nCRT 放疗第15次时；所述的时间3是指：nCRT放疗第25次时；所述的时间4是指：TME术前 0-1d；所述的时间5是指：TME术后5-12d。
本发明的第六个方面，提供了：
用于对时间1检测到的血浆ctDNA的最高VAF突变进行检测的试剂在用于制备局部晚 期直肠癌的无病生存期(DFS)预测试剂中的应用。
在一个实施方式中，所述的应用中包括：在时间1、2获得血浆ctDNA样本并检测突变， 判定基线血浆ctDNA中最高VAF突变在时间2是否清零；所述的时间1是指：nCRT治疗前；所述的时间2是指：nCRT放疗第15次时；所述的时间3是指：nCRT放疗第25次时；所述 的时间4是指：TME术前0-1d；所述的时间5是指：TME术后5-12d。
本发明的第七个方面，提供了：
一种对局部晚期直肠癌病人的治疗效果进行预测的装置，包括：
血浆ctDNA提取模块，用于对病人血浆的ctDNA进行提取；
测序模块，用于对血浆ctDNA提取模块得到的ctDNA进行测序；
基因突变分析模块，用于对血浆ctDNA提取模块得到的样本中的基因突变进行统计。
在一个实施方式中，还包括：清零率判定模块，用于判定ctDNA的清零率，包括以下两 种判定方法中的任意一种：(1)判定时间1检测得到的血浆ctDNA中最高变异等位基因频率 (VAF)的突变在时间2、3或者4是否清零；(2)判断时间1检测得到的血浆ctDNA中所 有检出突变在时间2、3或者4是否清零；所述的时间1是指：nCRT治疗前；所述的时间2 是指：nCRT放疗第15次时；所述的时间3是指：nCRT放疗第25次时；所述的时间4是指： TME术前0-1d；所述的时间5是指：TME术后5-12d。
本发明的第八个方面，提供了：
一种计算机可读取介质，其记载有对局部晚期直肠癌病人的治疗效果进行预测方法的计 算机程序，所述的程序中包括以下步骤：
获得病人的血浆ctDNA中的基因突变；
根据基因突变判定病人在nCRT治疗后归属于完全病理缓解(pCR)或者未完全病理缓 解(non-pCR)。
在一个实施方式中，所述的获得病人的血浆ctDNA中的基因突变是指获得在时间1、时 间2、时间3、时间4或者时间5中病人血浆中的cfDNA的基因突变。
在一个实施方式中，还包括：对ctDNA的清零率的判定，并根据ctDNA的清零率判定的结果对病人治疗后的肿瘤退缩分级(TRG)预测或者对无病生存期(DFS)预测。
附图说明
图1：基线血浆ctDNA突变检出率与nCRT疗效和预后的相关性分析。(A)pCR和non-pCR 患者基线血浆ctDNA突变检出率对比。(B)不同TRG分级患者基线血浆ctDNA突变检出率对比。(C)基线血浆ctDNA检出与无病生存期(DFS)的相关性分析。
图2：基线分子特征与nCRT疗效(TRG分级)的相关性分析。(A)LARC患者基线血浆中高频体细胞遗传变异的情况。(B)不同TRG分级患者APC、TP53、POLD1和FAT1突变的 比例。Y轴表示携带基因突变的患者占对应TRG组患者总数的比例。(C)不同TRG分级患 者4条KEGG信号通路的基因突变的比例(HD：同源重组；HM：组蛋白甲基转移酶；OD： 破骨细胞分化；AJ：粘附连接)。比例的定义类似于(B)。
图3：基线分子特征与nCRT疗效(pCR/non-pCR)的相关性分析。
图4：ctDNA动态变化与nCRT疗效(TRG分级)之间的相关性分析。(A)时间点2/3/4突变清零状态。Time2_highest_non_clearance：在时间点2基线最高VAF突变未清零。Time234_highest_non_clearance：在2/3/4个时间点中，基线最高VAF突变未清零，即至少在 一个时间点检测到基线最高VAF突变。Time2_all_non_clearance：在时间点2至少有一个基 线检出突变未清零(不限于最高VAF突变)。Time234_all_non_clearance：至少在2/3/4其中 一个时间点检测到一个突变。“highest”指变异等位基因频率最高的突变；“all”指基线检测 到的所有突变。(B)获得性突变在不同TRG分级和pCR/non-pCR分组患者的分布。(C)具 有上述特征的患者在不同TRG分组中的比例。
图5：基线分子突变特征和术前ctDNA动态变化与无病生存期(DFS)的相关性分析。(A-D) 根据pCR状态(pCR或non-pCR)、时间点2基线最高VAF突变清零状态、基线血浆中TP53突变的检出状态(TP53_wt：未检测到TP53突变；TP53_mut：检测到TP53突变)以及术后 病理检查发现***转移(***＝0：***转移阴性；***＝1：***转移阳性)分别 进行Kaplan–Meier无病生存曲线分析。
图6：基线分子突变特征和术前ctDNA动态变化与无病生存期(DFS)的相关性分析。(E-G) 根据pCR状态、基线血浆中TP53突变的检出状态和***转移状态，按时间点2基线最高 VAF突变清零状态分层的Kaplan-Meier无病生存曲线。
图7：基线血浆中APC和KRAS突变与无病生存期(DFS)之间的相关性分析。
图8：术前/术后病理特征与无病生存期(DFS)的相关性分析。“＝0”表示阴性；“＝1”表 示阳性。cMRF：nCRT治疗前直肠系膜筋膜。cEVMI：nCRT治疗前壁外血管侵犯。
图9：动态监测点所有基线检出突变清零与无病生存期(DFS)之间的相关性分析。“All clearance”指基线检出所有突变均清零。“＝0”指未突变清零。“＝1”指突变清零。
具体实施方式
为了证实ctDNA动态监测在局部晚期直肠癌(LARC)新辅助放化疗(nCRT)疗效评估和预后预测中的可行性和有效性。我们对研究进行了两个关键性的设计，第一个是应用425 个癌症相关基因的全外显子大panel而不是少数热点基因的小panel来进行ctDNA检测，这 样不仅获得了单个基因突变与nCRT疗效的相关性，还获得多个信号通路的基因变异与nCRT 疗效的相关性。二是术前设置多个监测时间点(4个时间点)，结合425个基因大panel，同 时对ctDNA中突变的清除和获得性突变的动态变化进行监测。展示了ctDNA动态监测在 nCRT疗效预测中的价值，并对W&W策略的患者选择提出了新的见解。本发明还证明了 ctDNA检测在早期预测LARC患者预后中的潜在作用。
本发明中用于检测的425基因panel由如下所示的基因组成：
ABCB1、ABCB4、ABCC2、ADH1A、ADH1B、ADH1C、AIP、AKT1、AKT2、AKT3、ALDH2、 ALK、AMER1、APC、AR、ARAF、ARID1A、ARID1B、ARID2、ARID5B、ASCL4、ASXL1、 ATF1、ATIC、ATM、ATR、ATRX、AURKA、AURKB、AXIN2、AXL、B2M、BAD、BAI3、 BAK1、BAP1、BARD1、BAX、BCL2、BCL2L11、BCR、BIRC3、BLM、BMPR1A、BRAF、 BRCA1、BRCA2、BRD4、BRIP1、BTG2、BTK、BUB1B、c11orf30、CASP8、CBL、CBLB、 CCND1、CCNE1、CD274、CD74、CDA、CDC73、CDH1、CDK10、CDK12、CDK4、CDK6、CDK8、CDKN1A、CDKN1B、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2C、CEBPA、CEP57、 CHD4、CHEK1、CHEK2、CREBBP、CRKL、CSF1R、CTCF、CTLA4、CTNNB1、CUL3、 CUX1、CXCR4、CYLD、CYP19A1、CYP2A13、CYP2A6、CYP2A7、CYP2B6*6、CYP2C19*2、 CYP2C9*3、CYP2D6、CYP3A4*4、CYP3A5、DAXX、DDR2、DENND1A、DHFR、DICER1、 DLL3、DNMT3A、DPYD、DUSP2、EGFR、EML4、EP300、EPAS1、EPCAM、EPHA2、 EPHA3、EPHA5、EPHB2、ERBB2、ERBB2IP、ERBB3、ERBB4、ERCC1、ERCC2、ERCC3、 ERCC4、ERCC5、ESR1、ETV1、ETV4、ETV6、EWSR1、EXT1、EXT2、EZH2、FANCA、 FANCC、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCI、FANCL、FANCM、FAT1、FBXW7、 FGF19、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FH、FLCN、FLT1、FLT3、FLT4、FOXA1、FOXP1、 FRG1、GATA1、GATA2、GATA3、GATA4、GATA6、GNA11、GNAQ、GNAS、GRIN2A、 GRM3、GRM8、GSTM1、GSTM4、GSTM5、GSTP1、GSTT1、HDAC2、HDAC9、HGF、HLA-A、HNF1A、HNF1B、HRAS、HSD3B1、IDH1、IDH2、IFNG、IFNGR1、IGF1R、IGF2、 IKBKE、IKZF1、IL7R、INPP4B、IRF2、JAK1、JAK2、JAK3、JARID2、JUN、KDM5A、 KDM6A、KDR、KEAP1、KIF1B、KIF5B、KIT、KITLG、KLLN、KMT2A、KMT2B、KMT2C、 KMT2D、KRAS、LHCGR、LMO1、LRP1B、LYN、LZTR1、MAP2K1、MAP2K2、MAP2K4、 MAP3K1、MAP3K4、MAP4K3、MAX、MCL1、MDM2、MDM4、MECOM、MED12、MEF2B、 MEN1、MET、MGMT、MITF、MLH1、MLH3、MLLT1、MLLT3、MLLT4、MPL、MRE11A、 MSH2、MSH6、MTHFR、MTOR、MUTYH、MYC、MYCL、MYCN、MYD88、MYH9、NAT1、NBN、NCOR1、NF1、NF2、NFE2L2、NFKBIA、NKX2-1、NKX2-4、NOTCH1、 NOTCH2、NOTCH3、NPM1、NQO1、NRAS、NRG1、NSD1、NTRK1、NTRK2、NTRK3、 PAK3、PALB2、PALLD、PARK2、PARP1、PARP2、PAX5、PBRM1、PDCD1、PDCD1LG2、PDE11A、PDGFRA、PDGFRB、PDK1、PGR、PHOX2B、PIK3C3、PIK3CA、PIK3R1、PIK3R2、 PKHD1、PLAG1、PLK1、PMS1、PMS2、POLD1、POLD3、POLE、POLH、POT1、PPARD、 PPP2R1A、PRDM1、PRF1、PRKACA、PRKACG、PRKAR1A、PRKCI、PRKDC、PRSS1、 PRSS3、PTCH1、PTEN、PTK2、PTPN11、PTPN13、PTPRD、QKI、RAC1、RAC3、RAD50、 RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD54L、RAF1、RARA、RARG、RASGEF1A、 RB1、RECQL4、RELN、RET、RHOA、RICTOR、RNF43、ROS1、RPTOR、RRM1、RUNX1、RUNX1T1、SBDS、SDC4、SDHA、SDHB、SDHC、SDHD、SEPT9、SETBP1、SETD2、SF3B1、 SGK1、SLC34A2、SLC3A2、SLC7A8、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD7、SMARCA4、 SMARCB1、SMO、SOS1、SOX1、SOX14、SOX2、SOX21、SPOP、SPRY4、SRC、SRY、 STAG2、STAT3、STK11、STMN1、STT3A、SUFU、TAP1、TAP2、TEK、TEKT4、TERC、 TERT、TET2、TGFBR2、THADA、TMEM127、TMPRSS2、TNFAIP3、TNFRSF11A、TNFRSF14、 TNFRSF19、TNFSF11、TOP1、TOP2A、TP53、TP63、TPMT、TSC1、TSC2、TSHR、TTF1、TUBB3、TUBB4A、TUBB4B、TUBB6、TYMS、U2AF1、UGT1A1、VAMP2、VEGFA、VHL、 WAS、WISP3、WRN、WT1、XPA、XPC、XRCC1、YAP1、ZNF2、ZNF217、ZNF703；
病人和样本采集
基于一项随机对照试验(Cinclare，NCT02605265)，复旦大学附属上海肿瘤中心放射肿 瘤科从2016年2月7日至2017年10月31日共收治了119例LARC患者(cT3-4/N0-2，M0)。患者接受nCRT(50gy/25组分；卡培他滨联合伊立替康方案)和一个周期的间隔化疗(卡培他滨联合伊立替康方案)，然后进行全直肠系膜切除(TME)和辅助化疗(卡培他滨联合奥沙利铂方案)。血浆样本采集时间为：nCRT治疗前(时间1)、nCRT放疗第15次(时间2)和 第25次(时间3)、术前0-1d(时间4)和术后5-12d(时间5)。根据2010年美国癌症联合 委员会(AJCC)TRG分级标准对手术后直肠癌组织标本进行肿瘤反应评估，包括pCR和肿 瘤回归分级(TRG)。TRG 0为完全缓解(pCR)，无残留肿瘤细胞；TRG 1-3属于non-pCR， TRG 1为反应较好，仅有单个或很少的肿瘤细胞残留；TRG 2为肿瘤反应较小，仍有残存的 肿瘤细胞；TRG 3为肿瘤反应差，极少或没有肿瘤细胞被杀灭。
应用425个癌症相关基因panel对收集的血浆样本进行高深度靶向测序，平均测序深度 约4000X。对基线血浆检出突变且5个时间点样本齐全的患者同时分析突变清除和获得性突 变情况，对基线未检出突变的患者仅分析获得性突变。突变清除同时分析基线血浆最高变异 等位基因频率(VAF)的突变和基线血浆中所有检出突变在2、3、4、5监测点的变化。为了 减少潜在的假阳性，将在基线未检出而2、3、4、5至少2个时间点检测到的突变定义为获得 性突变。本发明中的体细胞突变是包含两种情况，点突变和***缺失突变；“点突变”是指单 个碱基置换引起的突变，导致编码氨基酸发生变化；“***缺失突变”是指一个或多个碱基插 入或缺失导致编码氨基酸的增加或减少，这些类型的突变可能是“蛋白编码框内的”，导致蛋 白质中氨基酸的加入或减少；或可导致“移码”，通常导致蛋白质的过早截短；
统计分析
采用Fisher精确检验和Cochran-Armitage检验比较不同TRG组中具有某些临床或遗传特 征(如基因突变、信号通路的基因突变、基因突变清除、获得性突变状态等)的患者比例。
采用单因素logistic回归分析评价nCRT治疗过程中影响突变清零的危险因素。生存分析 包括Kaplan-Meier方法和单变量或多变量Cox比例风险模型，使用“survival”和“survminer” R包进行分析。用R“caret”软件包构建pCR预测模型。pCR预测结果包括基因特征如TP53、 POLD1、FAT1突变状态和4条KEGG信号通路的突变的状态；获得性突变的状态和基线突 变的清零。
患者特征
119例患者中位年龄为57岁，其中71％为男性。大多数患者的临床分期为IIIB(66％) 或IIIC(31％)。32％和25％患者为外壁静脉侵犯(EVMI)阳性和中膜筋膜侵犯(MRF)阳 性。术后病理检查显示41例患者(34.5％)为pCR，78例(65.5％)为non-pCR。按TRG分 级，0级(pCR)、1级、2级和3级的患者分别有41例(34.5％)、12例(10.1％)、53例(44.5％) 和13例(10.9％)。比较pCR组与non-pCR组，上述临床特征无统计学差异。
LARC患者基线基因组特征与TRG相关性分析
119例患者中有100例(84％)患者在基线血浆(时间1检测的血浆)中检测到体细胞突 变。基线ctDNA中是否检测到突变与nCRT治疗反应或DFS无关(图1)。LARC中最常见 的突变基因是TP53、APC和KRAS，其他突变频率较高的基因包括KMT2B、NOTCH1和 POLD1(图2的A区域)。我们发现pCR组和non-pCR组，或不同的TRG组中基因突变频 率各不相同。POLD1和FAT1基因在pCR组中的突变频率明显高于non-pCR组(均为p＝0.05， 图2的B区域和图3的A区域)。TP53和APC基因突变频率从TRG0到TRG3组呈上升趋 势(TP53为p＝0.08，APC为p＝0.09，图2的B区域)。此外，TP53和APC基因在non-pCR 组中的突变频率高于pCR组，但差异不显著(图3的A区域)。接下来，我们将分析扩展到 信号通路级别。我们发现4条KEGG信号通路的变化，包括粘附连接(AJ)、组蛋白甲基转 移酶(HM)、DNA损伤修复(DR)和破骨细胞分化(OD)，这些都与患者对nCRT的治疗 反应有关(属于4条信号通路的突变基因如表1所示)。所有4条信号通路的基因突变频率从 TRG0到TRG3呈下降趋势，尤其是DR通路差异显著(p＝0.005，图2的C区域)。同样所有 4条信号通路在pCR组中的突变频率均高于non-pCR组(p<0.05，图3的B区域)。
ctDNA动态变化与nCRT治疗反应的相关性
假设nCRT治疗后基线ctDNA突变的清除可能反映了患者对治疗的反应。应用基线检出 最高变异等位基因频率(VAF)的突变和基线检测到的所有突变两种评估方法，分别评估 ctDNA突变清零的患者比例(时间点2或术前3个时间点)，均显示从TRG0组到TRG3组呈下降趋势(p<0.05，图4的A和C区域)。其中，3个时间点的所有突变均清零 (Time234_all_clearance)差异最为显著(p＝0.001)，清零率从TRG0的87％下降到TRG3组 的33％(图4的C区域)。以前的ctDNA研究主要集中在基线突变的清零，而对nCRT治疗 过程中获得性突变知之甚少。我们观察到一些获得性基因突变，如TP53、PARP2、ESR1、 CDK12、CHEK2、RECQL4。有趣的是，获得性突变的患者比例从TRG0组到TRG3组逐渐 增加(p＝0.04，图4的B和C区域)。这些结果表明，non-pCR患者不仅基线突变清零率低， 而且在nCRT治疗过程中获得更多的突变。
ctDNA监测作为预测无疾病进展期(DFS)的早期生物标志物
本发明进一步评估了ctDNA监测早期预测DFS的潜力。在基线血浆中检测到TP53、APC 和KRAS基因突变都是DFS不佳的危险因素(TP53、APC和KRAS分别为p＝0.00053、0.03和0.02；对数秩检验，图5的C区域，图7)。pCR患者比non-pCR患者有更好的DFS(p＝0.0025，图5的A区域)，TRG评分越高，DFS越差(p＝0.018，图8的F区域)。一些病理特征，如 ***转移(p＝0.00049，图5的D区域)、神经周围浸润(p＝0.014，图8的A区域)、肿瘤 沉积(p＝0.0016，图8的B区域)和血管浸润(p＝0.003，图8的C区域)与恶化的DFS相 关。
关于ctDNA动态变化特征，与ctDNA突变未清零患者相比，基线血浆中突变在时间2-5 中清零预测更好的DFS(图5B、图6和图9)。在4个时间点中，时间2_基线最高VAF突变 清零与较好的DFS相关性最为显著(p＝0.02，图5的B区域)。重要的是，时间2_基线最高 VAF突变清零是一个独立于pCR、TP53突变和***转移状态的有利因素(图6的E-G区 域)。
ctDNA中突变清零和获得性突变对治疗敏感性和耐药性的影响
我们还分析了基线中不同信号通路中突变的清零率，总清零率为85.6％。其中一些信号 通路的突变更难清除，例如细胞周期信号通路中的TP53和WNT。相反，所有4条信号通路 (DR、HM、AJ、OD)的未清零率均低于总未清零率。此外，DNA修复(包括DR基因) 和SWI/SNF(染色质重塑)相关突变的不清零率较低。SWI/SNF信号通路与组蛋白甲基转移 酶(HM)相互作用，在染色质重塑中发挥作用。这与我们先前的发现一致，即DR和HM信 号通路在基线的改变与较高比例的pCR相关。这些结果强烈提示LARC中异常的DNA修复 和组蛋白重塑机制可能是nCRT的敏感因素。
对直肠癌新辅助放化疗后获得cCR患者采用W&W策略是临床可行的治疗策略。然而由 于缺乏患者选择的标准和cCR的一致定义，导致涉及W&W策略的各种研究结果不一致。此外，基于cCR的W&W方法被认为不如行外科手术的患者的预后。从理论上讲，如果能够准 确预测pCR并指导W&W患者的选择，可以降低W&W患者的复发风险，改善预后。目前， pCR的预测主要依赖于临床变量和影像学检查。一些单独的分子生物标记物，如H2AX也被 用于pCR的预测。然而，单标记预测pCR的敏感性、特异性和准确性有限，且检测的复杂 性也限制了其临床应用。
在我们的研究中，我们发现了一些新的基因组特征，这些特征在pCR组和non-pCR组中 存在显著差异。如本研究发现基线TP53的基线突变与不良治疗反应和DFS相关。以往的研 究也表明，TP53突变是直肠癌放疗或化疗不良反应的独立预测因子。相反，在治疗反应较好 的组中，FAT1和POLD1突变发生率更高。最近的一项研究发现，在头颈部鳞状细胞癌患者 中，与无应答患者相比，顺铂应答患者中的FAT1突变显著富集。POLD1是DR通路的成员， DR通路突变的患者在pCR组中有显著的富集。大量研究证实，DR缺乏可改善放化疗反应， 并在此基础上制定的治疗策略已在临床应用。除了DR通路外，其他3条KEGG信号通路的改变：HM、AJ和OD也与更好的治疗反应相关。体外和体内研究表明，这些信号通路会影 响放疗和化疗的敏感性。我们还发现这4条信号通路的突变清零率均高于平均水平。所有这 些结果表明，基线上述基因和信号通路的改变内在地提供了肿瘤细胞对放疗或化疗的敏感性。 除了基线基因组特征外，nCRT治疗期间基线突变的清零也反映了对治疗的敏感性。
本研究中未发现基线ctDNA突变检出与否与治疗反应或术后DFS相关，这表明残余肿 瘤而不是原发肿瘤是复发的来源。正如预期的那样，基线检出突变在所有时间点均清零预示 着更好的DFS，其中时间2的突变清零最为显著，这表明患者对nCRT的敏感性在治疗的早 期阶段即表现出来，与其他已发表研究的观察结果一致。未清零提示患者已经有一些恶性病 理特征，如神经周围浸润或肿瘤沉积阻碍ctDNA清零。因此，时间2的ctDNA清零可作为高危患者的早期检测指标，早期更积极的干预可以改善这些患者的预后。我们观察到，基线检测到TP53突变和其他时间点检测到获得性TP53突变预示着进展的高风险。TP53基因突变与结直肠癌患者预后的关系已被广泛报道。我们的分析显示术前可获得的一些特征，包括 检测到的TP53、基线ctDNA中的KRAS和APC突变、基线突变不清零和男性是DFS的危 险因素。结合这些特点可以尽早发现高危人群，从而及时调整治疗方案。
表1本研究入组患者基本特征
MRF:mesorectal fascia.EVMI:extramural vascular invasion.
表2信号通路中的突变基因