一种抑癌基因甲基化联合检测试剂盒及其应用

文档序号：1083470 发布日期：2020-10-20 浏览：4次 >En<

阅读说明：本技术 一种抑癌基因甲基化联合检测试剂盒及其应用 (Cancer suppressor gene methylation joint detection kit and application thereof ) 是由向廷秀彭溦雁唐俊邱祝于 2020-08-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了选自LRRC3B、PENK和RASSF1基因中的至少一个基因的甲基化检测试剂在制备用于诊断受试者是否患有结直肠癌或用于预测受试者是否具有患结直肠癌风险或用于判断结直肠癌预后的试剂盒中的应用,属于生物检测技术领域。本发明通过联合检测LRRC3B、PENK和RASSF1三个抑癌基因的启动子甲基化程度,能够实现对结直肠癌进行预防、早期诊断、临床治疗及预后评价。(The invention discloses application of a methylation detection reagent of at least one gene selected from LRRC3B, PENK and RASSF1 genes in preparing a kit for diagnosing whether a subject has colorectal cancer or predicting whether the subject has the risk of having the colorectal cancer or judging the prognosis of the colorectal cancer, and belongs to the technical field of biological detection. The invention can realize prevention, early diagnosis, clinical treatment and prognosis evaluation of colorectal cancer by jointly detecting the methylation degree of the promoters of three cancer suppressor genes of LRRC3B, PENK and RASSF 1.)

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体地，涉及一种抑癌基因甲基化联合检测试剂盒及其应用。

背景技术

我国结直肠癌(colorectal carcinoma，CRC)发病率居第3位，占癌症死因第4位。结直肠癌是一种可以预防、早诊早治的恶性肿瘤，“三早”(早期发现，早期诊断，早期治疗)是提高结直肠癌治疗效果的最有效方法。临床资料显示：早期癌症病人术后5年存活率高达90％以上。然而，由于结直肠癌早期无特异性临床表现且缺乏高灵敏度和特异性的早期诊断技术，大部分患者确诊时已是癌症晚期，失去了最佳治疗时机，导致术后5年存活率很低(低于20％)。

肿瘤早期诊断通常取决于两个关键因素：检查指标的高度特异敏感和检测方法的无创易行。粪便隐血检测(faecal occult blood testing，FOBT)是当前大肠癌筛查最为广泛的方法，为大肠癌的发现提供了重要诊断价值。但FOBT受饮食和药物影响大，特异性差，不可区分息肉和癌。钡剂灌肠气钡双重造影(double contrast barium enema，DCBE)等影像学检查简便易行，痛苦少，但不能评估大肠癌的浸润深度及外侵范围。电子结肠镜检查(colonoscopy，CS)是大肠癌诊断的金标准，能对犯病的部位切除和活检，但属于侵入性操作，不适宜早期筛查。而现行结直肠癌经典筛查应用的肿瘤标志物如CEA、CA199特异性及敏感性较差。

因此，寻找及开发出经济简便、高灵敏度特异度的生物标志物进行结直肠癌的早期筛查和诊断，意义重大。

发明内容

为了于克服现有技术中的缺陷，发明人前期研究发现，LRRC3B、PENK和RASSF1在多数正常组织中高表达，但在结直肠癌患者中异常低表达，并且与肿瘤分期呈现负相关。进一步研究表明血清游离LRRC3B、PENK和RASSF1三个抑癌基因的启动子的甲基化水平可预测结直肠癌的发病。从而完成本发明。

本发明第一方面提供选自LRRC3B、PENK和RASSF1基因中的至少一个基因的甲基化检测试剂在制备用于诊断受试者是否患有结直肠癌或用于预测受试者是否具有患结直肠癌风险或用于判断结直肠癌预后的试剂盒中的应用。

在本发明的一些实施方案中，所述甲基化检测试剂用于检测所述基因的启动子甲基化状态。

在本发明的一些具体实施方案中，所述甲基化检测试剂包括用于检测所述基因启动子甲基化状态的特异性引物。

在本发明的一些优选实施方案中，用于检测LRRC3B基因启动子甲基化状态的特异性引物包括具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的下游引物；用于检测LRRC3B基因启动子非甲基化状态的特异性引物包括具有SEQ IDNO.3所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的下游引物。

在本发明的一些优选实施方案中，用于检测PENK基因启动子甲基化状态的特异性引物包括具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的下游引物；用于检测PENK基因启动子非甲基化状态的特异性引物包括具有SEQ IDNO.7所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的下游引物。

在本发明的一些优选实施方案中，用于检测RASSF1基因启动子甲基化状态的特异性引物包括具有SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.10所示核苷酸序列的下游引物；用于检测RASSF1基因启动子非甲基化状态的特异性引物包括具有SEQ IDNO.11所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.12所示核苷酸序列的下游引物。

在本发明的一些实施方案中，所述甲基化检测试剂进一步包括用于提取样本DNA的试剂。

在本发明中，所述所述样本为全血或血浆，所述DNA为血浆游离DNA。

本发明的第二方面提供选自LRRC3B、PENK和RASSF1基因中的至少一个基因的启动子甲基化检测试剂在制备适用于以下方法的试剂盒中的应用，所述方法包括：

S1，提取受试者样本DNA，

S2，利用所述检测试剂检测所述基因的启动子甲基化状态，

S3，根据S2检测得到的甲基化状态，诊断受试者是否患有结直肠癌或预测受试者是否具有患结直肠癌风险或判断结直肠癌预后情况。

在本发明的一些实施方案中，当受试者LRRC3B、PENK和RASSF1基因中的至少一个基因甲基化水平高于正常水平时，诊断受试者患有结直肠癌，或预测受试者具有患结直肠癌风险，或判断结直肠癌预后不良。

本发明的第三方面提供一种用于诊断受试者是否患有结直肠癌或用于预测受试者是否具有患结直肠癌风险或用于判断结直肠癌预后的试剂盒，包括选自LRRC3B、PENK和RASSF1基因中的至少一个基因的启动子甲基化状态检测试剂，其中，用于检测LRRC3B基因启动子甲基化状态的特异性引物包括具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的下游引物；用于检测LRRC3B基因启动子非甲基化状态的特异性引物包括具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的下游引物。用于检测PENK基因启动子甲基化状态的特异性引物包括具有SEQ IDNO.5所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的下游引物；用于检测PENK基因启动子非甲基化状态的特异性引物包括具有SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的下游引物。用于检测RASSF1基因启动子甲基化状态的特异性引物包括具有SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ IDNO.10所示核苷酸序列的下游引物；用于检测RASSF1基因启动子非甲基化状态的特异性引物包括具有SEQ ID NO.11所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.12所示核苷酸序列的下游引物。

本发明的有益效果

本发明相对现有技术，具有以下有益效果：

联合检测LRRC3B、PENK和RASSF1可以作为结直肠癌早筛、诊断、疗效评价、预后判断的生物标志物，以其为基础的联合检测试剂盒，可用于结直肠癌的早期筛查、诊断、疗效监测及预后评价。

本发明的检测方法方便快捷、价格低廉，适于推广应用。

本发明采用血浆游离DNA进行检测，与经典的肿瘤标志物相比，ctDNA具有更高的准确性和特异性，是一种无创、临床应用前景广泛的新型肿瘤标志物，可定性、定量、跟踪肿瘤的消失、扩散和复发。

另外，DNA甲基化是肿瘤发生中较频繁的早期事件，作为肿瘤早期诊断和筛查具有RNA、蛋白及基因突变不能比的优势：

1)DNA样本极其稳定，不似RNA及蛋白，受环境影响大；

2)甲基化特异PCR(MSP)的敏感性、方法操作简单，不需要昂贵的仪器设备，比定量检测方法更可行(临床样品中不可避免地存在源于正常细胞的序列会严重干扰肿瘤细胞特征性的遗传学生物标志的检出，造成定量检测方法早期诊断肿瘤的障碍；探讨筛选的抑癌基因甲基化在乳腺癌发生发展中的作用，实验方法简单可行；

3)抑癌基因启动子甲基化多发生于CpG岛，位置相对基因突变来说更局限，易于设计探针和引物；

4)可同时设计多对引物进行联合检测；

5)适合于各种体液检测。

附图说明

图1示出了Methtarget检测LRRC3B、PENK和RASSF1启动子甲基化的状态。

图2示出了MethHC DNA甲基化数据库(http://methhc.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php)获取TCGA数据组中人结肠癌组织样本和配对正常结肠组织样本的LRRC3B、PENK和RASSF1的表达水平及启动子相对甲基化水平。

图3示出了MSP检测临床病理诊断为阳性的结肠癌患者组织中LRRC3B、PENK和RASSF1启动子甲基化状态的代表图。

图4示出了血浆游离DNA甲基化捕获技术检测的血浆游离DNA LRRC3B、PENK和RASSF1启动子甲基化状态的代表图。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1

1.组织、细胞和血浆游离DNA提取

1.1血浆游离DNA提取(磁珠法)

(1)1mL血浆中加入750μl裂解缓冲液，50μl蛋白酶k，10μl RNaseA,混匀，室温孵育20分钟；

(2)加50μl磁珠颠倒混匀，室温孵育10分钟；

(3)磁力架上放置3分钟，弃上清；

(4)洗涤缓冲液500μl洗涤2次，均采用磁力架；

(5)洗脱缓冲液50μl洗脱DNA，测浓度。

1.2组织、细胞DNA提取(QIAamp kit)

(1)样本为组织的，将液氮倒入研钵中，将组织迅速倒至研钵中，用力研磨组织，迅速将研磨的组织粉末移至无酶EP管中；样本为细胞则PBS 1mL清洗细胞，加1ml胰酶消化5min；离心800rpm，5min，弃上清。

(2)加180μL Buffer ATL混匀，吸至EP管中；

(3)加入20μL蛋白酶K，混匀，55℃恒温孵育30min，直至细胞完全裂解；

(4)加入20mg/μL Rnase A 20μL，震荡混匀15s，室温孵育2-5min；

(5)加200μL Buffer AL，混匀15s，70℃恒温孵育10min；

(6)加200μL无水乙醇，混匀15s；

(7)液体吸至套管中，离心8000rpm，1min；

(8)弃下清，加500μL Buffer AW1，离心8000rpm，1min；

(9)弃下清，加500μL Buffer AW2，离心12000rpm，3min；

(10)弃下清，空离12000rpm，1min；

(11)将柱子转移至新的EP管中，加30μL Buffer AE/三蒸水，室温静置3min；

(12)离心8000rpm，1min，EP管中即DNA，测浓度。

2.DNA重亚硫酸盐修饰、甲基化检测

2.1 DNA重亚硫酸盐修饰(EZ DNA methylation-Gold Kit试剂盒)

制备CT Conversion Reagent，按体系依次加入：

室温下溶解并震荡10min。

亚硫酸氢盐处理DNA

(1)在M-Wash Buffer中加入无水乙醇24mL备用；

(2)在130μL CT Conversion Reagent中加入20μL(0.2-0.5ug)DNA；

(3)恒温孵育混合液：98℃，10min；64℃，2.5h；4℃，20h；

(4)将液体吸至套管柱子中，加入M-Binding Buffer 600μL，混匀，12000rpm离心30s，弃液体；

(5)加M-Wash Buffer 200μL，12000rpm离心30s；

(6)加200μL M-Desulphonation Buffer，室温下放置20min，离心12000rpm，30s；

(7)加M-Wash Buffer 200μL，12000rpm离心30s；重复一次；

(8)将柱子移入新的EP管内，加M-Elution Buffer 10μL到柱子中，离心12000rpm，30s；

(9)-20℃保存。

2.2 Methtarget筛选潜在的甲基化位点作为结直肠癌的诊断生物标志物

为明确在结肠癌中有意义的分子标记物，发明人利用TCGA数据集、MethHC在线分析(http://MethHC.mbc.nctu.edu.tw)和kaplan-Meier Plotter(http://kmplot.com/analysis/)预后分析筛选潜在的甲基化位点作为结肠癌的诊断生物标志物。对筛选到的80个基因分析CpG岛，采用多重目的区域甲基化富集测序，根据FDR<0.05而β绝对值差异>0.2筛选出的结肠癌中高甲基化位点基因。结果显示3个基因在结肠癌组织中的启动子甲基化位点明显高于正常结肠组织中的启动子甲基化(如图1所示)。

MethHC DNA甲基化数据库(http://methhc.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php)获取TCGA数据组中人结肠癌组织样本和配对正常结肠组织样本LRRC3B、PENK和RASSF1的表达水平及启动子相对甲基化水平。结果显示，LRRC3B、PENK和RASSF1在结肠癌中的表达水平明显低于癌旁正常组织，而其相应的基因启动子甲基化水平明显增加(结果如图2所示)。

2.3 MSP检测LRRC3B、PENK和RASSF1启动子的甲基化

本发明根据LRRC3B、PENK和RASSF1启动子的基因序列，设计特异性引物，利用MSP技术检测甲基化检测。

用于快速鉴定甲基化状态的特异性引物，包括：

引物1：5’-TCGATTGTATTTTTGGGTAAGC-3’(SEQ ID No.1)；

引物2：5’-TAACGCGACTAACGTCTTCG-3’(SEQ ID No.2)；

引物3：5’-GTTGATTGTATTTTTGGGTAAGT-3’(SEQ ID No.3)；

引物4：5’-ACATAACACAACTAACATCTTCA-3’(SEQ ID No.4)。

引物5：5’-TACGTTAGTTTCGCGTCGAC-3’(SEQ ID No.5)；

引物6：5’-CGTATAAAAAACCACCGAACG-3’(SEQ ID No.6)；

引物7：5’-GTTTTATGTTAGTTTTGTGTTGAT-3’(SEQ ID No.7)；

引物8：5’-ACCATATAAAAAACCACCAAACA-3’(SEQ ID No.8)；

引物9：5’-TAGGATTTAGATTGGGCGGC-3’(SEQ ID No.1)；

引物10：5’-AAAAAAAACTCTACGAAAACGCG-3’(SEQ ID No.2)；

引物11：5’-TTTAGGATTTAGATTGGGTGGT-3’(SEQ ID No.3)；

引物12：5’-CAAAAAAAACTCTACAAAAACACA-3’(SEQ ID No.4)。

2.3.1甲基化特异性PCR(MSP)

(1)配制25μL反应体系：

(2)混匀，瞬离；

(3)PCR仪上机：95℃10min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，循环次数42次；72℃5min。

发明人选取了67例结肠癌组织和22例正常结肠组织(癌旁由病理科医生确认为病理正常)，来检测3个基因启动子的甲基化情况。MSP结果显示，LRRC3B、PENK和RASSF1三个基因在结肠癌组织中呈现高甲基化状态(图3)，甲基化率分别为82.8％、80.6％和64.2％。三者联合检测达98.5％。

2.4血浆游离DNA甲基化捕获技术

游离的DNA(cell-free DNA，cfDNA)认为是由凋亡细胞或者坏死的肿瘤细胞释放以及由巨噬细胞或其他清道夫细胞在远处吞噬后分泌释放DNA进入血液循环，故其携带有与原发肿瘤组织相一致的分子遗传学标志。循环肿瘤DNA来自肿瘤细胞，约占血浆游离DNA的0.01％-1％，半衰期短(约2小时)，能准确反映肿瘤现状。为明确这些基因在游离DNA中的灵敏度，发明人采用叠瓦式甲基化捕获探针甲基化富集测序，根据FDR<0.05而β绝对值差异>0.2，去除游离DNA中甲基化水平高于组织中甲基化的基因，确定出结肠癌中高甲基化位点的基因。

血浆游离DNA甲基化捕获技术检测的血浆游离DNA LRRC3B、PENK和RASSF1启动子甲基化状态如图4所示，结果显示：结肠癌患者血浆游离DNA中三个基因的启动子甲基化水平明显高于正常健康人血浆游离DNA。

本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 重庆医科大学附属第一医院

<120> 一种抑癌基因甲基化联合检测试剂盒及其应用

<130> JIA-2020-1-W-016

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA