阅读说明：本技术 一种吸入用复方异丙托溴铵溶液五种有关物质同步检测法 (Synchronous detection method for five related substances of compound ipratropium bromide solution for inhalation ) 是由 张贵民 郭小为 刘阿利 于 2019-03-20 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种吸入用复方异丙托溴铵溶液五种有关物质同步检测法,属于药物质量测定方法技术领域,本发明采用高效液相色谱法进行检测,采用烷基键合硅胶为填料的色谱柱,以含庚烷磺酸钠的磷酸盐缓冲液为流动相A,以有机相为流动相B,检测波长为205-300nm。本发明的检测方法可以将异丙托溴铵和硫酸沙丁胺醇与其它杂质有效分离,具有操作简单,结果全面、准确可靠,专一性强的特点。(The invention relates to a synchronous detection method for five related substances in a compound ipratropium bromide solution for inhalation, which belongs to the technical field of a medicine quality detection method and adopts high performance liquid chromatography for detection, wherein a chromatographic column with alkyl bonded silica gel as a filler is adopted, a phosphate buffer solution containing sodium heptanesulfonate is taken as a mobile phase A, an organic phase is taken as a mobile phase B, and the detection wavelength is 205-300 nm. The detection method can effectively separate ipratropium bromide, salbutamol sulfate and other impurities, and has the characteristics of simple operation, comprehensive, accurate and reliable result and strong specificity.)

一种吸入用复方异丙托溴铵溶液五种有关物质同步检测法

技术领域

本发明涉及药物质量测定方法技术领域，具体涉及一种吸入用复方异丙托溴铵溶液五种有关物质同步检测法。

背景技术

吸入用复方异丙托溴铵溶液是无色或几乎无色的澄清液体，主要成分为异丙托溴铵和硫酸沙丁胺醇。本品适用于需要多种支气管扩张剂联合应用的病人，用于治疗气道阻塞性疾病有关的可逆性支气管痉挛。其中，异丙托溴铵和沙丁胺醇叠加作用于肺部的毒蕈碱和β2肾上腺素能受体而产生支气管扩张作用，疗效优于单一给药。

在“反相高效液相色谱法测定吸入用异丙托溴铵溶液中的有关物质[J].重庆医学,2007(11):1067-1068”一文中公开了色谱柱为phenomenex-C8(4.6mm×250mm,5μm)和ultim ate XB-C8(4.6mm×250mm,5μm)，流动相A为乙腈-0.25％庚烷磺酸钠溶液(29:71)用磷酸调pH值至3.2，流动相B为乙腈；检测波长为210nm；流速为1.0ml/min；进样量20μl的检测条件，用来检测异丙托溴铵溶液中的有关物质，但是并不能检出硫酸沙丁胺醇及其有关杂质。

文献“HPLC法测定复方异丙托溴铵吸入溶液两组分的含量[J].药物分析，2011(5):1067-1068”该方法建立高效液相色谱法同步测定复方异丙托溴铵吸入溶液中异丙托溴铵和硫酸沙丁胺醇两组分的含量。方法采用Inertsil ODS-3C18(150mm×4.6mm,5μm)色谱柱，流动相为0.01mol.L^-1磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH 2.3)(A)-乙腈(B)，梯度洗脱，流速1.0mL.min^-1，检测波长为220nm(检测异丙托溴铵)和276nm(检测沙丁胺醇)，柱温40℃。结果：异丙托溴铵和沙丁胺醇进样量分别在0.01～0.2mg.mL^-1和0.05～1.0mg.mL^-1范围内线性关系良好(r均为0.9999，n＝5)，回收率(n＝9)分别为100.2％和100.3％。该方法虽然检测出了复方沙丁氨醇两组分的含量，但是并没有进一步测其中有关物质的含量，并且介于其有关物质的成分复杂，采用此方法并不能将有关物质与主成分显著分开，且并不能保证测量的灵敏性和专属性。

由于涉及吸入用复方异丙托溴铵溶液有关物质测定标准存在上述缺点，研究一种专属性强、灵敏度高，一次可以检测多种吸入用复方异丙托溴铵溶液有关物质的检测方法显得至关重要。

发明内容

鉴于现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于通过对梯度洗脱的梯度、流动相、柱温、流速等方面进行改进优化，提供了一种吸入用复方异丙托溴铵溶液五种有关物质同步检测法，可用于吸入用复方异丙托溴铵溶液生产中的质量控制。本发明方法中流动相的配制操作简单，分析方法稳定，灵敏度高，峰型好且一次性可以检测多种有关物质。

为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验，通过付出创造性劳动最终优选出如下技术方案：

一种吸入用复方异丙托溴铵溶液五种有关物质同步检测法，其中所述的吸入用复方异丙托溴铵溶液的五种有关物质为：异丙托溴铵杂质C(2-苯基-3-羟丙酸)、沙丁胺醇杂质B((1RS)-2-[(1,1-二甲基乙基)氨基]-1-(4-羟基苯)乙醇)、沙丁胺醇杂质C(3-脱氧沙丁胺醇)、沙丁胺醇杂质D(5-[(1RS)-2-[(1,1-二甲基乙基)氨基]-1-羟乙基]-2-羟基苯)、沙丁胺醇杂质F(3,3'-[氧双(亚甲基)]双[α-[[(1,1-二甲基乙基)氨基]甲基]-4-羟基苯甲醇)，所述检测法为高效液相色谱法，采用梯度洗脱。

优选的高效液相色谱的色谱条件为：

色谱柱的填充剂为烷基键合硅胶；

检测波长为205-300nm；

流动相包含流动相A和流动相B，流动相A为庚烷磺酸钠磷酸缓冲溶液，流动相B为有机相；

设置流动相流速为0.9～1.1ml/min，控制柱温为30～40℃；

优选的，该方法中梯度洗脱可以设置为：

更优选的梯度洗脱可以设置为：

优选填充剂的烷基键合硅胶为十八烷基硅烷键合硅胶或辛烷基硅烷键合硅胶。

优选流动相中的有机相为甲醇或乙腈；更优选为乙腈。

优选的是，所述流动相为庚烷磺酸钠磷酸缓冲液-乙腈，更优选的是，所述庚烷磺酸钠磷酸缓冲液为0.006mol/L。

所述庚烷磺酸钠磷酸缓冲液的pH值为2.0～3.5，更优选的是，所述庚烷磺酸钠磷酸缓冲液的pH值为2.5。

优选的是，本发明方法中所述流动相流速设为1.0ml/min。

应当说明的是，具体实施例中对本发明的方法进行了详细说明，并对本发明的方法进行了方法验证，结果表明本发明涉及的检测方法，与现有技术相比，具有如下预料不到的效果：

(1)本发明方法可以有效的将吸入用复方异丙托溴铵溶液的五种杂质全部分开，主峰纯度完全符合药典所规定的要求。

(2)本发明方法简单快速，能够在同一个高效液相色谱条件下分离吸入用复方异丙托溴铵溶液中的多种有关物质，避免在检测过程中频繁的更换液相条件，极大提高了工作效率，降低了成本。

(3)本发明分离度高，重复性及耐用性好，分析时间短，操作简单，结果稳定可靠。

因此，本发明可用于吸入用复方异丙托溴铵溶液的质量控制，为最终成品的质量提供有效保障。

附图说明

图1吸入用复方异丙托溴铵溶液混合杂质对照品HPLC图谱

图2吸入用复方异丙托溴铵溶液有关物质HPLC图谱

图3吸入用复方异丙托溴铵溶液热破坏HPLC图谱

图4吸入用复方异丙托溴铵溶液光破坏HPLC图谱

图5吸入用复方异丙托溴铵溶液空白辅料HPLC图谱

图6吸入用复方异丙托溴铵溶液有关物质HPLC图谱

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

实施例1

仪器与条件：Waters液相色谱系统，2998检测器，色谱柱：Waters Xbridge C18(150×4.6mm，3.5μm)；检测波长：210nm；含0.006mol/L庚烷磺酸钠缓冲液磷酸调节pH至2.5为流动相A，以乙腈为流动相B，检测波长为210nm，柱温35℃，流速1.0ml/min。

以体积比计，所述梯度洗脱的设置为：

试验步骤：

其中异丙托溴铵及其有关杂质对照品购自浙江优联医药化工有限公司；硫酸沙丁胺醇及其有关杂质对照品购自北京华威锐科化工有限公司；吸入用异丙托溴铵溶液为山东新时代药业有限公司生产(批号06418003)。

取异丙托溴铵、硫酸沙丁胺醇、异丙托溴铵杂质C(2-苯基-3-羟丙酸)、沙丁胺醇杂质B((1RS)-2-[(1,1-二甲基乙基)氨基]-1-(4-羟基苯)乙醇)、沙丁胺醇杂质C(3-脱氧沙丁胺醇)、沙丁胺醇杂质D(5-[(1RS)-2-[(1,1-二甲基乙基)氨基]-1-羟乙基]-2-羟基苯)、沙丁胺醇杂质F(3,3'-[氧双(亚甲基)]双[α-[[(1,1-二甲基乙基)氨基]甲基]-4-羟基苯甲醇)各对照品适量，用0.006mol/L庚烷磺酸钠磷酸-乙腈缓冲液配制成10μg/ml的溶液，精密量取25μl注入液相色谱仪，记录色谱图，混合溶液的HPLC图谱见附图1。

将25μl流动相混合溶液注入液相色谱仪，得到0-55min的响应值始终大约在0mAU的谱图，所得液相线线与基线基本重合，说明流动相对有关物质的检测无影响。

由图1与异丙托溴铵和硫酸沙丁胺醇的谱图可知：异丙托溴铵主峰的保留时间约为32min，硫酸沙丁胺醇主峰的保留时间约为14min，各杂质分离度较好。

根据图1与各个杂质的定位峰对应可得到如下的出峰时间与对应物质的对应表1。

表1响应时间与对应的物质表

时间(min)	对应物质	相对保留时间
			1.165	溴离子	0.04
10.195	异丙托溴铵C	0.31
			13.820	硫酸沙丁胺醇	0.42
17.301	沙丁胺醇杂质B	0.53
			23.834	沙丁胺醇杂质C	0.73
27.240	沙丁胺醇杂质D	0.84
			32.306	异丙托溴铵	1.00
39.003	沙丁胺醇杂质F	1.20

2、吸入用复方异丙托溴铵溶液有关物质的测定：取吸入用复方异丙托溴铵溶液适量，用庚烷磺酸钠磷酸缓冲溶液-乙腈混合溶液制成约含异丙托溴铵0.2mg/ml的溶液，按照实施例1方法测定，HPLC图谱见附图2。

根据附图2与各个杂质的定位峰对应可得到如下的出峰时间与对应物质的对应表2。

表2响应时间与对应物质

由图2可见：主峰与各杂质峰能很好分离，同步，主峰的峰纯度符合规定。

3、吸入用复方异丙托溴铵溶液热破坏

取吸入用复方异丙托溴铵溶液置于60℃条件下破坏10天，按照实施例1方法测定，HPLC图谱见附图3。

附图3中的出峰时间如表3所示。

表3图3特征峰的出峰时间

由图3及色谱图峰的响应时间可见：吸入用复方异丙托溴铵溶液在热破坏条件下，降解产物较多，主峰与相邻杂质峰均能很好分离，同步，主峰的峰纯度均符合规定。

4、吸入用复方异丙托溴铵溶液光破坏

取吸入用复方异丙托溴铵溶液置于4500Lx光强下破坏10天，按照实施例1方法测定，HPLC图谱见附图4。

附图4中的出峰时间如表4所示。

表4图4中特征峰的出峰时间

由图4及图4特征峰的响应时间可见：吸入用复方异丙托溴铵溶液在光破坏条件下，降解产物较多，主峰与相邻杂质峰均能很好分离，同步，主峰的峰纯度均符合规定。

由上述试验结果可知：利用本发明的检测方法能将异丙托溴铵、硫酸沙丁胺醇与其杂质峰很好分离、主峰的峰纯度符合要求，因此本方法可用于吸入用复方异丙托溴铵溶液的质量控制。

实施例2专属性实验

仪器与条件：Waters液相色谱系统，2998检测器，色谱柱：Waters Xbridge C18(150×4.6mm，3.5μm)；检测波长：210nm；含0.006mol/L庚烷磺酸钠缓冲液磷酸调节pH至2.5为流动相A，以乙腈为流动相B，检测波长为210nm，柱温35℃,流速1.0ml/min。

以体积比计，所述梯度洗脱的设置为：

1、吸入用复方异丙托溴铵溶液空白辅料(来自山东新时代药业有限公司)，依实施例2方法测定，HPLC图谱见附图5。

由图5可见：空白辅料对样品的有关物质测定无干扰。

2、吸入用复方异丙托溴铵溶液有关物质的测定：取吸入用复方异丙托溴铵溶液适量，用庚烷磺酸钠磷酸缓冲溶液-乙腈混合液制成约含异丙托溴铵0.2mg/ml的溶液，依实施例2方法测定，HPLC图谱见附图6。

由图6可见：吸入用复方异丙托溴铵溶液样品有关物质检查符合规定，同步，主峰的峰纯度符合要求。

实施例3方法耐用性试验

仪器与条件：Waters液相色谱系统，2998检测器，色谱柱：Waters Xbridge C18(150×4.6mm，3.5μm)；检测波长：215nm；含0.006mol/L庚烷磺酸钠缓冲液磷酸调节pH至2.5为流动相A，以甲醇为流动相B，柱温30℃，流速为0.9ml/min。

以体积比计，所述梯度洗脱的设置为：

取异丙托溴铵、硫酸沙丁胺醇、异丙托溴铵杂质C、沙丁胺醇杂质B、沙丁胺醇杂质C、沙丁胺醇杂质D、沙丁胺醇杂质F用庚烷磺酸钠磷酸缓冲溶液-甲醇混合溶液配制成各10μg/ml的混合溶液，精密量取25μl注入液相色谱仪，记录色谱图。

在此条件下，异丙托溴铵主峰的保留时间约为33min，硫酸沙丁胺醇主峰的保留时间约为14min，各杂质分离度较好。

实施例4方法耐用性试验

仪器与条件：Waters液相色谱系统，2998检测器，色谱柱：Waters Xbridge C18(150×4.6mm，3.5μm)；检测波长：210nm；含0.006mol/L庚烷磺酸钠缓冲液磷酸调节pH至2.5为流动相A，以乙腈为流动相B，流速1.1ml/min，检测波长为210nm，柱温40℃。

以体积比计，所述梯度洗脱的设置为：

取异丙托溴铵、硫酸沙丁胺醇、异丙托溴铵杂质C、沙丁胺醇杂质B、沙丁胺醇杂质C、沙丁胺醇杂质D、沙丁胺醇杂质F用庚烷磺酸钠磷酸缓冲溶液-乙腈混合溶液配制成各10μg/ml的混合溶液，精密量取25μl注入液相色谱仪，记录色谱图。

在此条件下，异丙托溴铵主峰的保留时间约为31min，硫酸沙丁胺醇主峰的保留时间约为12min，各杂质分离度较好。

实施例5方法耐用性试验

仪器与条件：Waters液相色谱系统，2998检测器，色谱柱：Waters Xbridge C18(150×4.6mm，3.5μm)；检测波长：210nm；含0.006mol/L庚烷磺酸钠缓冲液磷酸调节pH至2.0为流动相A，以乙腈为流动相B，流速1.0ml/min，检测波长为210nm，柱温35℃。

以体积比计，所述梯度洗脱的设置为：

取异丙托溴铵、硫酸沙丁胺醇、异丙托溴铵杂质C、沙丁胺醇杂质B、沙丁胺醇杂质C、沙丁胺醇杂质D、沙丁胺醇杂质F用庚烷磺酸钠磷酸缓冲溶液-乙腈混合溶液配制成各10μg/ml的混合溶液，精密量取25μl注入液相色谱仪，记录色谱图。

在此条件下，异丙托溴铵主峰的保留时间约为32min，硫酸沙丁胺醇主峰的保留时间约为14min，各杂质分离度较好。

实施例6方法耐用性试验

仪器与条件：Waters液相色谱系统，2998检测器，色谱柱：Waters Xbridge C18(150×4.6mm，3.5μm)；检测波长：210nm；含0.006mol/L庚烷磺酸钠缓冲液磷酸调节pH至3.5为流动相A，以乙腈为流动相B，流速1.1ml/min，检测波长为205nm，柱温35℃。

以体积比计，所述梯度洗脱的设置为：

取异丙托溴铵、硫酸沙丁胺醇、异丙托溴铵杂质C、沙丁胺醇杂质B、沙丁胺醇杂质C、沙丁胺醇杂质D、沙丁胺醇杂质F用庚烷磺酸钠磷酸缓冲溶液-乙腈混合溶液配制成各10μg/ml的混合溶液，精密量取25μl注入液相色谱仪，记录色谱图。

在此条件下，异丙托溴铵主峰的保留时间约为32min，硫酸沙丁胺醇主峰的保留时间约为14min，各杂质分离度较好。

实施例7杂质校正因子计算

仪器与条件：Waters液相色谱系统，2998检测器，色谱柱：Waters Xbridge C18(150×4.6mm，3.5μm)；检测波长：210nm；含0.006mol/L庚烷磺酸钠缓冲液磷酸调节pH至3.5为流动相A，以乙腈为流动相B，检测波长为210nm，柱温35℃。

以体积比计，所述梯度洗脱的设置为：

取异丙托溴铵、硫酸沙丁胺醇、异丙托溴铵杂质C、沙丁胺醇杂质B、沙丁胺醇杂质C、沙丁胺醇杂质D、沙丁胺醇杂质F用庚烷磺酸钠磷酸缓冲溶液-乙腈混合溶液配制成各0.5μg/ml的混合溶液，同法配制1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、10μg/ml的混合溶液，各精密量取25μl注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见表3，表4。

表3异丙托溴铵及其杂质

表4沙丁胺醇及其杂质

由表3-4的试验结果可知：利用本发明的检测方法异丙托溴铵和硫酸沙丁胺醇与其杂质均能良好分离，并且主峰的峰纯度均符合规定，本方法可用于吸入用复方异丙托溴铵溶液有关物质的质量控制。

对比实施例1：

采用的液相色谱条件：LC-10AT液相色谱仪。

色谱柱：phenomenex-C8(4.6mm×250mm,5μm)和ultimate XB-C8(4.6mm×250mm,5μm)

流动相：A：0.25％庚烷磺酸钠溶液(29:71)用磷酸调pH值至3.2，B：乙腈

进样量：20μl

检测波长：210nm

流速：1.0ml/min

检测方法：

取吸入用异丙托溴铵溶液，用流动相A溶液稀释一倍制成的溶液作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用流动相A溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。

取对照溶液20μl，注入液相色谱仪，调节仪器灵敏度，使主峰高为满量程的20％，再取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。

根据检测结果，此条件能够检测出异丙托溴铵及其相关部分杂质，但是并不能检测出硫酸沙丁胺醇与其杂质的信息，且采用此方法检测出的异丙托溴铵与其杂质的分离度不好，因此本方法不适用于吸入用复方异丙托溴铵有关物质的检测。

对比实施例2：

供试品配置方法如实施例1一致

色谱条件：

nertsilODS-3C18(150mm×4.6mm，5μm)柱；流动相：0.01mol·L^-1磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH 2.3)(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～10min，5％～20％B；10～15min，20％B；15～16min，20％～5％B；16～25min，5％B)；流速:1.0mL·min^-1；检测波长：220nm(检测异丙托溴铵)和276nm(检测硫酸沙丁胺醇)；柱温：40℃；进样量：20μL。

对照品溶液

精密称取对照品异丙托溴铵10mg和硫酸沙丁胺醇60mg(约相当于沙丁胺醇50mg)，置50mL量瓶中，加水使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品储备液；精密量取2.5mL，置25mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。

供试品溶液

取吸入用异丙托溴铵溶液，精密量取5mL，置25mL量瓶中，加流动相A稀释至刻度，摇匀，即得。

结果，仅能从检测图谱中测得主成分硫酸沙丁胺醇与异丙托溴铵的成分，并不能测得除主成分以外的其他有关物质的含量，因此本检测方法并不适用于吸入用异丙托溴铵中有关物质的检测。

对比实施例3

Waters液相色谱系统，2998检测器，色谱柱：Waters Xbridge C18(150×4.6mm，3.5μm)；检测波长：210nm；含0.006mol/L庚烷磺酸钠缓冲液磷酸调节pH至2.5为流动相A，以乙腈为流动相B，其中流动相A与流动相B的体积比为90:10，检测波长为210nm，柱温35℃，流速1.0ml/min，进样量25μl，等度洗脱。

对照品和供试品均按照实施例1的方法制备

将供试品和对照品进行检测，将得到的谱图对比可以得出，本方法能够检测出异丙托溴铵及其部分杂质，但是不能检测出硫酸沙丁胺醇的杂质。

对比实施例4

Waters液相色谱系统，2998检测器，色谱柱：Waters Xbridge C18(150×4.6mm，3.5μm)；检测波长：210nm；含0.006mol/L庚烷磺酸钠缓冲液磷酸调节pH至2.5为流动相A，以乙腈为流动相B，其中流动相A与流动相B的体积比为90:10，检测波长为210nm，柱温35℃，流速1.0ml/min，进样量25μl，梯度洗脱。

以体积比计，所述梯度洗脱的设置为：

供试品与对照品的制备与实施例1一致

通过采用对比实施例4的方法对供试品和对照品分别检测，图谱分析，采用此检测方法能够检测出部分有关物质和吸入用异丙托溴铵的主成分，但是有关物质与主成分的分离度不高，并不能作为吸入用异丙托溴铵有关物质的质量控制。