阅读说明：本技术 一种基于上转换荧光探针的核酸快速检测方法 (Rapid nucleic acid detection method based on up-conversion fluorescent probe ) 是由 何皓 于 2020-06-24 设计创作，主要内容包括：本发明属于核酸检测技术领域,具体涉及一种基于上转换荧光探针的核酸快速检测方法,用于检测目标样本中核酸分子的数目,将目标样本处理得到DNA单链样品,稀释后滴加到检测基板上进行捕获杂交,完成后,冲洗检测基板,将荧光探针稀释后滴加到前述检测基板,完成后冲洗检测基板；将冲洗后的检测基板置于荧光显微镜下,对荧光探针数目进行计数,所得数目即为目标样本中核酸分子的数目。本发明相比现有技术具有以下优点：根据目标核酸片段设计对应的捕获核酸片段和标记核酸片段,能够实现对含有不同目标核酸片段的目标样本中核酸分子数量进行检测,适用范围广、准确度高,可以通过肉眼观测到核酸分子并进行定量。(The invention belongs to the technical field of nucleic acid detection, and particularly relates to a rapid nucleic acid detection method based on an up-conversion fluorescent probe, which is used for detecting the number of nucleic acid molecules in a target sample, processing the target sample to obtain a DNA single-stranded sample, diluting the DNA single-stranded sample, dropwise adding the diluted DNA single-stranded sample onto a detection substrate for capture hybridization, flushing the detection substrate after the completion, diluting the fluorescent probe, dropwise adding the diluted fluorescent probe onto the detection substrate, and flushing the detection substrate after the completion; and (3) placing the washed detection substrate under a fluorescence microscope, and counting the number of the fluorescence probes, wherein the obtained number is the number of the nucleic acid molecules in the target sample. Compared with the prior art, the invention has the following advantages: the corresponding capture nucleic acid fragment and the corresponding marker nucleic acid fragment are designed according to the target nucleic acid fragment, so that the number of nucleic acid molecules in a target sample containing different target nucleic acid fragments can be detected, the application range is wide, the accuracy is high, and the nucleic acid molecules can be observed by naked eyes and quantified.)

一种基于上转换荧光探针的核酸快速检测方法

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种基于上转换荧光探针的核酸快速检测方法。

背景技术

核酸主要包括脱氧核糖核酸和核糖核酸两大类，是重要的生物大分子，是遗传信息的载体，是分子生物学和生命科学研究的重要内容，核酸的组成、排列顺序、结构特征及其生物学功能是核酸的最重要研究内容，但对于核酸的定量测定，仍是科研工作者关注和研究的课题之一，其测定对研究核酸的生化反应，发展核酸医药制品以及对疾病的诊断和防治具有不可估量的意义；核酸的定量测定方法有很多，如色谱法、分光光度法、荧光光度法、显微光度法、免疫分析法以及共振瑞利散射法等，其中荧光光度法使定量测定核酸的常用方法，但由于核酸的荧光量子产率很低，因此需要借助荧光探针间接测定；在面对疑似感染者时，快速且准确的做出诊断并有效隔离感染者，对疫情防控起到至关重要的作用。在抗疫战斗中，核酸检测成为了确诊病例的金标准，成为了防疫工作中最强有力的武器；但是无论是传统的荧光定量PCR还是高端的数字PCR或恒温PCR技术，这些核酸检测技术都需要对目标核酸片段进行扩增后才能进行检测，这是由于核酸分子小，只能结合有限的信号探针，而现有的荧光探针主要使用的是有机荧光染料，荧光信号弱，而且整个反应体系中其他生物分子带来的背景噪声更加降低了检测信噪比，因此只能通过各种不同功能的酶或者杂交方法设计对目标核酸片段进行扩增，增加其在反应体系中的浓度，进而提高信号，使得仪器科研检测得到目标核酸片段的存在。但是无论是传统PCR扩增技术还是现在出现的恒温扩增等快速扩增方法，都需要繁琐的操作和不短的反应时间，成为快速检测核酸分子最为困难的屏障；因此，一种快速简单的核酸检测技术对未来新型传染病疫情防控以及生化安全等重点工作是具有极大的重要性及必要性。

发明内容

本发明的目的是针对现有核酸分子检测方法操作繁琐、反应时间较长的问题，提供了一种基于上转换荧光探针的核酸快速检测方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种基于上转换荧光探针的核酸快速检测方法，用于检测目标样本中核酸分子的数目，包括由标记核酸片段修饰上转换荧光纳米颗粒所得的荧光探针、由捕获核酸片段修饰的检测基板以及目标样品；所述目标样品中包含目标核酸片段，所述捕获核酸片段可以与目标核酸片段上一部分进行配对杂交，所述标记核酸片段可以与目标核酸片段上不能与捕获核酸片段配对杂交的部分配对杂交；

检测方法包括以下步骤：

（1）将目标样品用0.2mol/L的PB缓冲液进行稀释，得到相应浓度的实验标准品，将实验标准品均匀滴加到检测基板上，目标样品与检测基板上捕获核酸片段结合后，冲洗检测基板，洗去未结合的目标样品；

所述目标样品的制备方法为：将需要检测的目标样本进行核酸抽提得到目标核酸片段，使目标核酸片段解离成DNA单链样品，所述DNA单链样品为目标样品；

（2）将荧光探针用0.2mol/L的PB缓冲液进行稀释， 得到荧光探针稀释液，将荧光探针稀释液均匀滴加到步骤（1）处理后的检测基板表面进行杂交，冲洗检测基板，洗去未结合的荧光探针；

（3）将步骤（2）处理后的检测基板置于荧光显微镜下，使用近红外光作为激发光源，可见光波段作为检测波段，对整个检测基板进行荧光成像，对荧光探针数目进行计数，所得数目即为目标样本中核酸分子的数目。

具体的，所述荧光探针是以NaYF₄、NaGdF₄、CaF₂、LiYF₄、NaLuF₄、LiLuF₄、KMnF₃或Y₂O₃为发光基质，与敏化剂和激活剂共掺杂后得到上转换荧光纳米颗粒UCNPs，然后对UCNPs颗粒表面经羧基化修饰得到羧基化修饰纳米颗粒[email protected]，将标记核酸片段氨基化处理后修饰[email protected]得到荧光探针；

对上述内容的进一步说明，所述荧光探针的制备方法包括：

（1）上转换荧光纳米颗粒制备

取1mmol的RECl3溶液、6mL油酸和15mL十八烯混合加入100mL三颈圆底烧瓶中，在氩气流保护下搅拌加热至160℃并维持20min，得到澄清的一次混合溶液；RECl3溶液中RE³⁺包括Y³⁺、敏化剂、激活剂；

将一次混合溶液冷却至50℃，加入10mL含有4mmol氟化铵和2.5mmol氢氧化钠的甲醇溶液，随后升温至150℃并维持20min去除甲醇，得到二次混合溶液；

然后将二次混合溶液加热至310℃并维持90min，向反应体系中热注射含有三氟乙酸钠和三氟乙酸钇的油酸/十八烯溶液，其中油酸和十八烯的体积比为1:1，310℃下维持60min，反应结束后将液体冷却至室温，用乙醇和环己烷离心洗涤，在温度为52-58℃的条件下干燥得到UCNPs；

（2）羧基化修饰纳米颗粒制备

将1mL浓度为10mM的UCNPs环己烷溶液加入1mL浓度为0.3mol/L的盐酸溶液中，超声10min后搅拌3h，得到混合溶液，然后对混合溶液高速离心后舍去上清液，得到沉淀一，对所得沉淀一水洗5-8次，得到酸洗UCNPs，将酸洗UCNPs分散到1mL去离子水中得到酸洗UCNPs分散液；

将上述所得酸洗UCNPs分散液与适量PEG-COOH混合，在室温条件下搅拌24小时后离心得到沉淀二，对沉淀二水洗3-5次去除多余的PEG-COOH，得到[email protected]；

（3）荧光探针制备

将[email protected]分散到1mL去离子水中得到[email protected]分散液，将将上述所得[email protected]分散液加入pH值为7.2、浓度为0.2mol/L的PB缓冲液中，配制成浓度为1-2mg/mL的悬浊液，然后依次在悬浊液中加入浓度为50mg/mL的NHS和50mg/mL的EDC，使NHS与发光基质质量比为1:2-5、使EDC与UCNPs的质量比为1:2-5，然后在4-30℃的条件下反应20-60min，离心去除多余的NHS和EDC，再加入0.2mol/L的PB缓冲液得到悬浊液二，向悬浊液二中加入氨基化处理的标记核酸片段，在温度为4-30℃的条件下反应1-3小时，标记核酸片段与UCNPs的质量比为1:100-1000，反应完成后加入质量浓度为0.5-2%的BSA溶液封闭1-2小时；结束后在3-5℃的条件下离心洗涤1-2次，得到UCNPs-标记核酸片段结合物即为荧光探针，将UCNPs-标记核酸片段结合物保存于浓度为0.02mol/L的PB缓冲液中，在2-8℃的条件下保存备用。

具体的，所述RECl3溶液RE³⁺中敏化剂的摩尔百分比为15mol%、20mol%、25mol%、30mol%、35mol%、40mol%、45mol%、50mol%、55mol%、60mol%、65mol%、70mol%或75mol%；RECl3溶液RE³⁺中激活剂的摩尔百分比为2.5mol%、3mol%、4mol%、5mol%、6mol%、7mol%或8mol%；所述敏化剂为Yb³⁺、Nd³⁺、Gd³⁺、Ce³⁺其中一种或多种混合；激活剂为Yb³⁺、Er³⁺、Tm³⁺、Sm³⁺、Dy³⁺、Ho³⁺、Eu³⁺、Tb³⁺、Pr³⁺其中一种或多种混合。

具体的，所述上转换纳米颗粒的粒径为25-200nm；PB缓冲液中溶质按质量百分比包括0.1%BSA、2%蔗糖、0.1%Tween。

具体的，所述目标核酸片段为RNA时，对目标核酸片段进行逆转录得到DNA双链，再解离成DNA单链样品；所述目标核酸片段为DNA双链时，解离成DNA单链样品。

具体的，所述基板为玻璃片或硅片；所述激光光源的波长为790nm、980nm或1550nm，所述激光光源通过显微镜光路的能量密度大于1W/cm²。

在检测时，将目标样本处理得到DNA单链样品，利用PB缓冲液稀释实验标准品后均匀滴加到检测基板上进行捕获杂交步骤，捕获核酸片段与目标核酸片段上一部分配对杂交完成后，冲洗检测基板，然后将荧光探针稀释后滴加到前述检测基板，荧光探针上的标记核酸片段与捕获核酸片段配对杂交完成后，冲洗检测基板；将冲洗后的检测基板置于荧光显微镜下，使用近红外光作为激发光源，可见光波段作为检测波段，对整个检测基板进行荧光成像，对荧光探针数目进行计数，所得数目即为目标样本中核酸分子的数目。

本发明相比现有技术具有以下优点：利用掺杂稀土的上转换荧光纳米颗粒UCNPs作为荧光探针的基础，使其能在荧光显微镜下可读；根据目标核酸片段设计对应的捕获核酸片段和标记核酸片段，能够实现对含有不同目标核酸片段的目标样本中核酸分子数量进行检测，适用范围广、准确度高，相比传统稀土上转换荧光材料实现了单分子检测，无需扩增就可以通过肉眼观测到核酸分子并进行定量。

附图说明

图1是荧光探针的结构示意图。

图2是检测基板的结构示意图。

图3是结核反应示意图。

图4是荧光显微镜图像结果例图。

图5是HIV病毒核酸片段检测结果定量图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进一步说明。

下面将结合本发明实施例附图，对本发明实施例技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明最关键的构思在于：利用稀土掺杂的上转换荧光纳米颗粒作为发光材料，所述上转换纳米颗粒因为能连续吸收两个或多个长波长光子，然后发射出一个短波长光子，具有较大的反斯托克斯位移，相比传统使用的有机染料，激发光源和发射波段无重叠，且可有效抑制自发荧光背景噪声，能够显著提高检测信号的信噪比，相比传统稀土掺杂的上转换荧光材料增加了量子效率，发光强度受到很大制约，能够实现单分子检测水平，且发光强度较高，单个上转换发光探针的信号可以被肉眼观测到，实现了无需扩增就能观测到核酸分子并进行定量。

如图1-2所示，一种基于上转换荧光探针的核酸快速检测方法，用于检测目标样本中核酸分子的数目，包括由标记核酸片段2修饰上转换荧光纳米颗粒1所得的荧光探针、由捕获核酸片段4修饰的检测基板3以及目标样品；所述目标样品中包含目标核酸片段5，如图3所示，所述捕获核酸片段4可以与目标核酸片段5上一部分进行配对杂交，所述标记核酸片段2可以与目标核酸片段5上不能与捕获核酸片段4配对杂交的部分配对杂交；

检测方法包括以下步骤：

（1）将目标样品用0.2mol/L的PB缓冲液进行稀释，得到相应浓度的实验标准品，将实验标准品均匀滴加到检测基板上，目标样品与检测基板上捕获核酸片段结合后，冲洗检测基板，洗去未结合的目标样品；

所述目标样品的制备方法为：将需要检测的目标样本进行核酸抽提得到目标核酸片段，使目标核酸片段解离成DNA单链样品，所述DNA单链样品为目标样品；

（2）将荧光探针用0.2mol/L的PB缓冲液进行稀释， 得到荧光探针稀释液，将荧光探针稀释液均匀滴加到步骤（1）处理后的检测基板表面进行杂交，冲洗检测基板，洗去未结合的荧光探针；

（3）将步骤（2）处理后的检测基板置于荧光显微镜下，使用近红外光作为激发光源，可见光波段作为检测波段，对整个检测基板进行荧光成像，对荧光探针数目进行计数，所得数目即为目标样本中核酸分子的数目。

其中，所述荧光探针是以NaYF₄、NaGdF₄、CaF₂、LiYF₄、NaLuF₄、LiLuF₄、KMnF₃或Y₂O₃为发光基质，与敏化剂和激活剂共掺杂后得到上转换荧光纳米颗粒UCNPs，然后对UCNPs颗粒表面经羧基化修饰得到羧基化修饰纳米颗粒[email protected]，将标记核酸片段氨基化处理后修饰[email protected]得到荧光探针；

所述荧光探针的制备方法包括：

（1）上转换荧光纳米颗粒制备

取1mmol的RECl3溶液、6mL油酸和15mL十八烯混合加入100mL三颈圆底烧瓶中，在氩气流保护下搅拌加热至160℃并维持20min，得到澄清的一次混合溶液；RECl3溶液中RE³⁺包括Y³⁺、敏化剂、激活剂；

将一次混合溶液冷却至50℃，加入10mL含有4mmol氟化铵和2.5mmol氢氧化钠的甲醇溶液，随后升温至150℃并维持20min去除甲醇，得到二次混合溶液；

然后将二次混合溶液加热至310℃并维持90min，向反应体系中热注射含有三氟乙酸钠和三氟乙酸钇的油酸/十八烯溶液，其中油酸和十八烯的体积比为1:1，310℃下维持60min，反应结束后将液体冷却至室温，用乙醇和环己烷离心洗涤，在温度为52-58℃的条件下干燥得到UCNPs；

（2）羧基化修饰纳米颗粒制备

将1mL浓度为10mM的UCNPs环己烷溶液加入1mL浓度为0.3mol/L的盐酸溶液中，超声10min后搅拌3h，得到混合溶液，然后对混合溶液高速离心后舍去上清液，得到沉淀一，对所得沉淀一水洗5-8次，得到酸洗UCNPs，将酸洗UCNPs分散到1mL去离子水中得到酸洗UCNPs分散液；

将上述所得酸洗UCNPs分散液与适量PEG-COOH混合，在室温条件下搅拌24小时后离心得到沉淀二，对沉淀二水洗3-5次去除多余的PEG-COOH，得到[email protected]；

（3）荧光探针制备

将[email protected]分散到1mL去离子水中得到[email protected]分散液，将将上述所得[email protected]分散液加入pH值为7.2、浓度为0.2mol/L的PB缓冲液中，配制成浓度为1-2mg/mL的悬浊液，然后依次在悬浊液中加入浓度为50mg/mL的NHS和50mg/mL的EDC，使NHS与发光基质质量比为1:2-5、使EDC与UCNPs的质量比为1:2-5，然后在4-30℃的条件下反应20-60min，离心去除多余的NHS和EDC，再加入0.2mol/L的PB缓冲液得到悬浊液二，向悬浊液二中加入氨基化处理的标记核酸片段，在温度为4-30℃的条件下反应1-3小时，标记核酸片段与UCNPs的质量比为1:100-1000，反应完成后加入质量浓度为0.5-2%的BSA溶液封闭1-2小时；结束后在3-5℃的条件下离心洗涤1-2次，得到UCNPs-标记核酸片段结合物即为荧光探针，将UCNPs-标记核酸片段结合物保存于浓度为0.02mol/L的PB缓冲液中，在2-8℃的条件下保存备用。

其中，所述RECl3溶液RE³⁺中敏化剂的摩尔百分比为15mol%、20mol%、25mol%、30mol%、35mol%、40mol%、45mol%、50mol%、55mol%、60mol%、65mol%、70mol%或75mol%；RECl3溶液RE³⁺中激活剂的摩尔百分比为2.5mol%、3mol%、4mol%、5mol%、6mol%、7mol%或8mol%；所述敏化剂为Yb³⁺、Nd³⁺、Gd³⁺、Ce³⁺其中一种或多种混合；激活剂为Yb³⁺、Er³⁺、Tm³⁺、Sm³⁺、Dy³⁺、Ho³⁺、Eu³⁺、Tb³⁺、Pr³⁺其中一种或多种混合；所述上转换纳米颗粒的粒径为25-200nm；PB缓冲液中溶质按质量百分比包括0.1%BSA、2%蔗糖、0.1%Tween。

其中，所述基板为玻璃片或硅片；所述激光光源的波长为790nm、980nm或1550nm，所述激光光源通过显微镜光路的能量密度大于1W/cm²。

实施例1

HIV病毒核酸片段检测

一、HIV病毒目标核酸片段选择及对应荧光探针修饰核酸片段和捕获核酸片段设计：

HIV病毒目标核酸片段选择：5’-GCT ATA CAT TCT TAC TAT TTT ATT TAA TCC CAG-3’

荧光探针标记核酸片段：5‘-CTG GGA TTA AAT AAA CCC CCC CCC CCC CCC CCC-3’

捕获核酸片段：5‘-CCC CCC CCC CCC CCC CCC ATA GTA AGA ATG TAT AGC-3’

二、定量检测

（1）将目标样品用0.2mol/L的PB缓冲液进行稀释，得到相应浓度的实验标准品，将实验标准品均匀滴加到检测基板上，目标样品与检测基板上捕获核酸片段结合后，冲洗检测基板，洗去未结合的目标样品；

所述目标样品的制备方法为：将需要检测的目标样本进行核酸抽提得到目标核酸片段，使目标核酸片段解离成DNA单链样品，所述DNA单链样品为目标样品；

（2）将荧光探针用0.2mol/L的PB缓冲液进行稀释， 得到荧光探针稀释液，将荧光探针稀释液均匀滴加到步骤（1）处理后的检测基板表面进行杂交，冲洗检测基板，洗去未结合的荧光探针；

（3）将步骤（2）处理后的检测基板置于荧光显微镜下，使用近红外光作为激发光源，可见光波段作为检测波段，对整个检测基板进行荧光成像，对荧光探针数目进行计数，所得数目即为目标样本中核酸分子的数目

将HIV病毒目标核酸片段

1.将HIV病毒目标样本制备得到目标样品，然后利用0.2mol/L的PB缓冲液进行稀释，得到以下浓度的实验标准品：0 copies/mL、10 copies/mL、100 copies/mL、1000 copies/mL、10000 copies/mL；

2.按照前述方法进行检测，每个实验标准品检测3次，3次检测显微镜中成像如图4所示（原图像中亮点处为蓝色），荧光探针计数取平均值绘图如图5中所示，即为HIV病毒目标样本中核酸分子的数目；

以目标核酸片段拷贝数作为X，以荧光探针计数平均值为Y，进行线性拟合：Y=1.01X+4.90，拟合系数平方R2=1；荧光探针计数与目标HIV核酸片段数目线性相关，因此可以使用荧光探针计数绝对定量目标待检测的HIV核酸片段。

其中，荧光探针的制备方法包括：

（1）上转换荧光纳米颗粒制备

取1mmol的RECl3溶液、6mL油酸和15mL十八烯混合加入100mL三颈圆底烧瓶中，在氩气流保护下搅拌加热至160℃并维持20min，得到澄清的一次混合溶液；RECl3溶液中RE³⁺包括Y³⁺、Gd³⁺、Yb³⁺；

将一次混合溶液冷却至50℃，加入10mL含有4mmol氟化铵和2.5mmol氢氧化钠的甲醇溶液，随后升温至150℃并维持20min去除甲醇，得到二次混合溶液；

然后将二次混合溶液加热至310℃并维持90min，向反应体系中热注射含有三氟乙酸钠和三氟乙酸钇的油酸/十八烯溶液，其中油酸和十八烯的体积比为1:1，310℃下维持60min，反应结束后将液体冷却至室温，用乙醇和环己烷离心洗涤，在温度为55℃的条件下干燥得到UCNPs；

（2）羧基化修饰纳米颗粒制备

将1mL浓度为10mM的UCNPs环己烷溶液加入1mL浓度为0.3mol/L的盐酸溶液中，超声10min后搅拌3h，得到混合溶液，然后对混合溶液高速离心后舍去上清液，得到沉淀一，对所得沉淀一水洗6次，得到酸洗UCNPs，将酸洗UCNPs分散到1mL去离子水中得到酸洗UCNPs分散液；

将上述所得酸洗UCNPs分散液与适量PEG-COOH混合，在室温条件下搅拌24小时后离心得到沉淀二，对沉淀二水洗4次去除多余的PEG-COOH，得到[email protected]；

（3）荧光探针制备

将[email protected]分散到1mL去离子水中得到[email protected]分散液，将将上述所得[email protected]分散液加入pH值为7.2、浓度为0.2mol/L的PB缓冲液中，配制成浓度为1.5mg/mL的悬浊液，然后依次在悬浊液中加入浓度为50mg/mL的NHS和50mg/mL的EDC，使NHS与发光基质质量比为1:4、使EDC与UCNPs的质量比为1:3，然后在20℃的条件下反应40min，离心去除多余的NHS和EDC，再加入0.2mol/L的PB缓冲液得到悬浊液二，向悬浊液二中加入氨基化处理的标记核酸片段，在温度为16℃的条件下反应2小时，标记核酸片段与UCNPs的质量比为1:360，反应完成后加入质量浓度为1.4%的BSA溶液封闭1.5小时；结束后在4℃的条件下离心洗涤2次，得到UCNPs-标记核酸片段结合物即为荧光探针，将UCNPs-标记核酸片段结合物保存于浓度为0.02mol/L的PB缓冲液中，在5℃的条件下保存备用。

其中，所述RECl3溶液RE³⁺中敏化剂的摩尔百分比为30mol%，激活剂的摩尔百分比为4mol%；所述上转换纳米颗粒的粒径为25-200nm；PB缓冲液中溶质按质量百分比包括0.1%BSA、2%蔗糖、0.1%Tween；所述基板为玻璃片；所述激光光源的波长为980nm，所述激光光源通过显微镜光路的能量密度大于1W/cm²。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。