一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗菌药物的方法
阅读说明：本技术 一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗菌药物的方法 (Method for detecting antibacterial drugs in serum by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry technology ) 是由 成晓亮 李美娟 于 2020-05-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗菌药物的方法,所述的抗菌药物包括：舒巴坦(SBT)、亚胺培南(IPN)、利奈唑胺(LNZ)、美洛培南(MPN)、莫西沙星(MXC)、哌拉西林(PRC)、替加环素(TGC)、头孢哌酮(CFZ)、万古霉素(VCM)、替考拉宁(TCL)；采用超高效液相色谱串联质谱法检测预处理血清中上述抗菌药物的含量,利用质谱同位素内标法定量,以标准品与内标物的浓度比为X轴,标准品与内标物峰面积比为Y轴,建立校准曲线,计算出血清中目标药物的浓度；本发明方法前处理过程简单且灵敏度高、特异性强,5min之内完成抗菌药物的分离和检测,为临床上抗菌药物的治疗浓度监测提供一种可靠的检测方法。(The invention discloses a method for detecting antibacterial drugs in serum by an ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry technology, wherein the antibacterial drugs comprise: sulbactam (SBT), Imipenem (IPN), Linezolid (LNZ), Meropenem (MPN), Moxifloxacin (MXC), Piperacillin (PRC), Tigecycline (TGC), Cefoperazone (CFZ), Vancomycin (VCM), Teicoplanin (TCL); detecting the content of the antibacterial drug in the preprocessed serum by adopting an ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry, quantifying by utilizing a mass spectrometry isotope internal standard method, establishing a calibration curve by taking the concentration ratio of a standard substance to an internal standard substance as an X axis and the peak area ratio of the standard substance to the internal standard substance as a Y axis, and calculating the concentration of the target drug in the serum; the method has simple pretreatment process, high sensitivity and strong specificity, completes the separation and detection of the antibacterial agent within 5min, and provides a reliable detection method for the clinical monitoring of the treatment concentration of the antibacterial agent.)
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，更具体的是涉及一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗菌药物的方法。
背景技术
细菌感染是致病性和死亡率的一个重要来源，使用抗生素治疗成为住院病人管理的一个重要方面，特别是在重症监护病房(ICU)。然而，目前已经证明基于标准给药方案的抗生素治疗的病人，其血药浓度往往不能达到有效治疗浓度，这大大影响了治疗效果，并可能使病人产生多种细菌的耐药性。因为不同的病人药物代谢动力学存在个体间的差异，简单的增加药物剂量可能会引起危险的毒副作用。因此需要进行严格的的体内药物浓度监测，特别是针对治疗浓度狭窄的药物。
舒巴坦(SBT)是一种β-内酰胺酶抑制剂，对革兰阳性及阴性菌(除铜绿假单胞菌外)所产生的β-内酰胺酶均有抑制作用。头孢哌酮(CFZ)是三代头孢菌素，抗菌谱较广，对革兰阴性杆菌尤为有效。舒巴坦、头孢哌酮两者结合具有协同抗菌活性。头孢哌酮/舒巴坦作为为数不多对广泛耐药的鲍曼不动杆菌耐药率较低的抗生素之一，在ICU等重症感染患者中应用广泛。
哌拉西林(PRC)为广谱、半合成酰脲类青霉素，具有抗菌谱广、抗菌作用较强的特点，尤其对铜绿假单胞菌有强大的抗菌作用，目前在国内外广泛应用，并被认为是最有价值的一类青霉素。哌拉西林在临床上主要用于治疗绿脓杆菌及其他敏感的革兰氏阴性杆菌所导致的肺炎、败血症、呼吸道、胆道和***感染、亚急性心内膜炎及化脓性脑膜炎等疾病。
替加环素(TGC)是近年开发上市的一类新甘氨酰四环素类抗生素，通过阻止氨基酸tRNA进入核糖体A位，从而抑制细菌蛋白质的合成起到杀菌作用。替加环素具有广谱抗菌活性，对其敏感的细菌有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌、耐青霉素肺炎链球菌、鲍曼不动杆菌和产超广谱β-内酰胺酶的革兰阴性菌等。
亚胺培南(IPN)是一种碳青霉烯类抗生素，其作用特点是抗菌谱广、抗菌活性强以及对β-内酰胺酶高度稳定，主要用于多重耐药的革兰阴性杆菌感染、严重需氧菌与厌氧菌混合感染的治疗以及病原未查明的严重感染，是治疗重症感染的一线用药。
美洛培南(MPN)是一种人工半合成的碳青霉烯类抗生素，它具有超广谱的抗菌活性，对临床常见的需氧及厌氧菌都显示出极强的活性，由于美洛培南组织穿透力强，分布广泛，在临床上用于治疗呼吸、泌尿道、外科、妇产科、皮肤及软组织感染和细菌性脑膜炎。
利奈唑胺(LNZ)是第一个应用于临床的新型唑烷酮类抗菌药物，该药作用机制独特，与其他药物无交叉耐药性，年龄、性别对药代动力学没有明显影响，对大多数革兰阳性菌包括多重耐药的肠球菌属、葡萄球菌属和肺炎链球菌等具有很好的抗菌作用。
莫西沙星(MXC)属***新型氟喹诺酮类广谱抗菌药物，通过抑制细菌的DNA螺旋酶A亚单位和拓扑异构IV的活性，阻断DNA的复制，发挥杀菌作用。莫西沙星对革兰阳性菌、革兰阴性菌、厌氧菌及非典型病原体(支原体、衣原体、军团菌)均有良好的抗菌活性，具有组织渗透力强、生物利用度高、作用时间长、不良反应少等优点。莫西沙星是临床上常用的抗菌药，主要应用于慢性支气管炎的急性发作、慢性阻塞性肺疾病、社区获得性肺炎以及皮肤和软组织感染。
万古霉素(VCM)是一种糖肽类抗菌药物，杀菌活性强，罕见诱导产生耐药，对革兰阳性菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌等所致感染疗效显著，是临床上治疗严重感染的常见药物。
替考拉宁(TCL)是游动放线菌属发酵产生的一种杀菌性新型糖肽类抗生素，作用机制与万古霉素及其他糖肽类抗生素相似，是继万古霉素后用于治疗多重耐药菌感染的重要抗生素之一，临床用于治疗各种严重的革兰阳性菌感染，特别是耐甲氧西林葡萄球菌感染。适用于治疗重症葡萄球菌(特别是甲氧西林耐药性葡萄球菌)感染，如脓毒症、脓毒性心内膜炎、急性骨髓炎和慢性骨髓炎急性发作、脓毒性关节炎、嗜中性粒细胞减少患者并发感染等。
目前国内外文献报道中测定人血清或血浆中抗菌药物的方法主要有HPLC-UV法和LC-MS/MS法，但是存在灵敏度低、单个样品分析时间长、样本用量大等缺陷，有些甚至采用外标法定量，存在基质干扰，准确性差。中国专利(CN 110361481 A和CN 110361482 A)分别公开了“一种血液中万古霉素药物浓度监测试剂盒及其检测方法”和“一种血液中利奈唑胺药物浓度监测试剂盒及其检测方法”，该两者发明极为相同，均使用多维在线固相萃取液相色谱分析技术测定血液中的万古霉素和利奈唑胺，方法使用的样本量为4mL，采用外标法定量，单个样本分析时间长达17min；中国药物应用与监测2013年4月第10卷第2期，题为“HPLC-MS/MS法测定血浆中莫西沙星浓度”的方法采用左氧氟沙星作为内标检测患者血浆中莫西沙星的浓度，该方法对服用过左氧氟沙星的患者就不再适用了；中国临床药理学杂志第35卷第24期，题为“LC-MS/MS法同时测定人血浆中伏立康唑和替加环素的浓度”的文章中，也采用其他药物作为内标进行定量分析，缺乏普遍适用性和准确性。而同位素内标与待测物有基本相同或一致的物理化学性质、色谱行为和响应特征，是目前最准确的定量方法。再者，临床样本极其珍贵，因此前处理样本用量尽量要少，且进样量太大也会严重污染仪器，增加仪器维护成本。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗菌药物的方法。
所述抗菌药物包括：舒巴坦(Sulbactam，SBT)、亚胺培南(Imipenem，IPN)、利奈唑胺(Linezolid，LNZ)、美洛培南(Meropenem，MPN)、莫西沙星(Moxifloxacin，MXC)、哌拉西林(Pipracil，PRC)、替加环素(Tigecycline，TGC)、头孢哌酮(Cefoperazone，CFZ)、万古霉素(Vancomycin，VCM)、替考拉宁(Teicoplanin，TCL)。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗菌药物的方法，所述抗菌药物包括SBT、IPN、LNZ、MPN、MXC、PRC、TGC、CFZ、VCM和TCL；
采用超高效液相色谱串联质谱法检测预处理血清中抗菌药物的含量，利用同位素内标法定量，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算出血清中10种抗菌药物的浓度；
(1)具体色谱条件：
流动相A：含0.01％～0.2％甲酸的水；
流动相B：乙腈；
色谱柱：ACQUITYUPLC CSH C18(2.1×50mm，1.7μm)；
采用梯度洗脱的方式，见表1；
流速为0.2～0.5mL/min，每个样品采集时间为5.0min，柱温为30～50℃，进样体积为0.2～10μL；
表1流动相梯度洗脱参数
(2)具体质谱条件：在电喷雾电离检测模式下，多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为3.0kV(ESI+)及2.5kV(ESI-)；源温度：120℃；雾化气温度：400℃，雾化气流速：800L/h，锥孔气流速：150L/h；同时监测目标物对应的标准品和内标母离子、子离子、去簇电压和碰撞电压，参数见表2；
表2质谱检测参数
其中，所述的血清为人或动物的血清。
其中，所述的预处理血清按照如下方法制备得到：取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂，高速振荡5min；14000r/min，4℃离心5min后取上清液60μL至塑料内衬管中，待进样。
其中，所述的含内标的蛋白沉淀剂按如下方法制备得到：分别用甲醇将抗菌药物配制成的浓度为1mg/mL的同位素内标母液；将上述各同位素内标母液再用甲醇溶液配制成包含有150000ng/mL SBT-d5、5000ng/mL LNZ-d3、5000ng/mL MPN-d6、5000ng/mL MXC-13CD3、5000ng/mL PRC-d5和10000ng/mL TGC-d9的混合内标溶液；取200μL混合内标溶液，加入19.8mL蛋白沉淀剂，即得含内标的蛋白沉淀剂。
其中，所述的蛋白沉淀剂为甲醇、乙腈与异丙醇的混合溶剂。
其中，所述的标准品按照如下步骤制备得到：分别将抗菌药物配制成的标准品母液，浓度分别为：SBT 100mg/mL、LNZ 20mg/mL、MPN 5mg/mL、MXC 10mg/mL、PRC 10mg/mL、TGC10mg/mL、VCM 50mg/mL、TCL 50mg/mL、IPN 2mg/mL和CFZ 50mg/mL，然后分别移取SBT 20μL、LNZ 10μL、MPN 40μL、MXC 20μL、PRC 20μL、TGC 8μL、VCM 16μL、TCL 40μL、IPN 400μL、CFZ200μL，加入226μL甲醇溶液，充分混匀得到1mL混合标准品储备液。
本发明将混合标准品储备液以空白血清基质配制成七个不同浓度点的校准品溶液，配制过程如下：取10μL混合标准品储备液加入至190μL空白血清基质中作为第一个高值浓度点(S7)；
取第一高值浓度点(S7)用等体积空白血清基质稀释得第二高值浓度点(S6)；取第一高值浓度点(S7)用3倍体积空白血清基质稀释得第三高值浓度点(S5)；取第二高值浓度点(S6)用9倍体积空白血清基质稀释得第四高值浓度点(S4)；取第三高值浓度点(S5)用9倍体积空白血清基质稀释得第五高值浓度点(S3)；取第四高值浓度点(S4)用4倍体积空白血清基质稀释得第六高值浓度点(S2)；取第五高值浓度点(S3)用4倍体积空白血清基质稀释得第七高值浓度点(S1)，具体过程如下表3；
表3标准曲线配制及浓度(单位：ng/mL)
其中，所述的空白血清基质为不含目标药物的空白血清；
七个不同浓度校准品样本每个浓度点取50μL于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂，高速振荡5min；在14000r/min，4℃下离心5min后取上清液60μL至塑料内衬管中，待进样，进样量1μL。
有益效果：本发明方法前处理过程简单，成本低，且灵敏度高、特异性强，5min之内完成10种抗菌药物的分离和检测，准确度与精密度基本满足要求，可用于临床上抗菌药物的定量分析，为临床上抗菌药物的治疗浓度监测提供一种可靠的检测方法。
附图说明
图1为抗菌药物标准品提取离子流谱图；
图2为血清中抗菌药物提取离子流谱图。
具体实施方式
为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例和附图对本发明作进一步详述，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.材料
(1)方法学研究实验的样本来自于武汉亚洲心脏病医院2019年7月份门诊收集的血清样本。
(2)仪器：Xevo TQ-S三重四级杆质谱仪(Waters Corporation)；UPLC I-Class超高效液相色谱系统(配自动进样器，Waters Corporation)；SCILOGEX D2012高速台式离心机(美国)；超纯水仪(ELGA LabWater，英国)；多管涡旋混合仪(Vortex genie2，美国)；可调移液器(Eppendorf 0.5～10μL，10～100μL，100～1000μL)；玻璃仪器、量筒等。
(3)试剂耗材：试剂耗材：MS级甲醇(Fisher，美国)；HPLC级甲醇(Honeywell，美国)；MS级乙腈(Fisher，美国)；HPLC级乙腈(Honeywell，美国)；MS级甲酸(Fisher，美国)；色谱柱ACQUITY UPLC CSH C18(2.1×50mm,1.7μm)。
(4)标准品：替考拉宁(TCL)标准品购自欧洲药典(EP)，美洛培南(MPN)标准品购自TCI，替加环素(TGC)-d9内标购自cayman公司，其余化合物和内标均购自TRC公司。
(5)质控品：含有10种抗菌药物的血清溶液，分低中高三个浓度分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，浓度见表4所示。
表4质控品对应浓度(单位：ng/mL)
2.方法
(1)色谱条件
流动相A：含0.1％甲酸的水；流动相B：乙腈。色谱柱型号：ACQUITY UPLC CSH C18(2.1×50mm,1.7μm)，采用梯度洗脱的方式，详见表1；流速为0.3mL/min，柱温为40℃，进样体积为1μL。
(2)质谱条件
在电喷雾电离检测模式下，多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为3.0kV(ESI+)及2.5kV(ESI-)；源温度：120℃；雾化气温度：400℃，雾化气流速：800L/h，锥孔气流速：150L/h；同时监测目标物对应的标准品和内标母离子、子离子、去簇电压和碰撞电压，参数见表2；
(3)混合标准品储备液的配制
分别将抗菌药物配制成的标准品母液，浓度分别为：SBT 100mg/mL、LNZ 20mg/mL、MPN 5mg/mL、MXC 10mg/mL、PRC 10mg/mL、TGC 10mg/mL、VCM 50mg/mL、TCL 50mg/mL、IPN2mg/mL和CFZ 50mg/mL，然后分别移取一定体积的抗菌药物标准品母液，加入226μL甲醇溶液，充分混匀得到1mL混合标准品储备液，浓度参下表5。
表5混合标准储备液的配制
(4)混合内标溶液的配制
分别准确移取一定体积的抗菌药物同位素内标母液，加入820μL甲醇溶液，混匀得到1mL混合内标溶液，浓度见表6；
取200μL上述混合内标溶液加入至19.8mL蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈，异丙醇的体积比1:1:2)中，即得含内标的蛋白沉淀剂。
表6混合内标溶液的配制
(5)质控品配制
低浓度质控品：将中浓度质控样品用无待测物干扰的空白血清稀释10倍。
中浓度质控品：用无待测物干扰的空白血清稀释混合标准品储备液200倍，得中浓度质控样品。
高浓度质控品：用无待测物干扰的空白血清稀释混合标准品储备液50倍，得高浓度质控样品。
(6)样品处理
1)标准曲线配制
采用梯度稀释法进行标准曲线配制，将混合标准品储备液以空白血清基质配制成七个不同浓度点的校准品溶液，配制过程如下：取10μL混合标准品储备液加入至190μL空白血清基质中作为第一个高值浓度点(S7)；
取第一高值浓度点(S7)用等体积空白血清基质稀释得第二高值浓度点(S6)；取第一高值浓度点(S7)用3倍体积空白血清基质稀释得第三高值浓度点(S5)；取第二高值浓度点(S6)用9倍体积空白血清基质稀释得第四高值浓度点(S4)；取第三高值浓度点(S5)用9倍体积空白血清基质稀释得第五高值浓度点(S3)；取第四高值浓度点(S4)用4倍体积空白血清基质稀释得第六高值浓度点(S2)；取第五高值浓度点(S3)用4倍体积空白血清基质稀释得第七高值浓度点(S1)，具体过程见表3；
2)预处理血清的制备：取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入200μL蛋白沉淀剂(甲醇、乙腈与异丙醇的体积比1:1:2)，高速振荡5min；14000r/min，4℃离心5min后取上清液60μL至塑料内衬管中，待进样。
3)质控品前处理：分别取质控品溶液QC(L)、QC(M)、QC(H)各50μL于1.5mL离心管中，然后跟血清样品前处理方法一致，此处不再赘述。
3.方法验证
1)提取离子流谱图：由图1-2可知，抗菌药物的标准品和血清样品的峰形比较对称，且没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到良好的检测。
2)校准曲线
采用同位素内标定量法，利用TargetLynx软件以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，并计算出血清中待测物的浓度。抗菌药物在各自浓度范围内的线性拟合方程，线性良好，相关系数在0.998以上，满足定量要求，见表7。
表7抗菌药物线性回归方程及线性相关系数
3)准确度考察：采用加标回收率试验评估方法的准确性；准备一混合空白血清样品，分别加入低、中、高3个浓度的混合标准品储备液，以相同步骤重复处理并测定5次，结果经计算如表8所示。结果显示，抗菌药物的加标回收率在87.49％-105.71％之间，5次重复试验的RSD在0.51％-6.17％范围。
表8抗菌药物加标回收率结果
4)精密度试验：取无干扰空白血清样本，加入不同浓度抗菌药物的混合标准品储备液，得到低、中、高三个浓度血清样本，一天内重复处理6批，以同位素内标法定量测定抗菌药物的浓度，批内精密度为2.87～13.64％，三日内分3批处理，计算批间精密度为3.17～11.93％，结果见表9。
表9批内、批间精密度试验结果
4.讨论
本研究建立了一种超高效液相色谱串联质谱技术(UPLC-MS/MS)，同时测定人体血清中10种抗菌药物的方法。血清用量少，仅需50μL，且前处理简单，且一针分析多种物质只需5min，简单快速。
采用同位素内标法定量不仅可以极大消除基质干扰，而且结果不受前处理过程、仪器响应波动等条件的影响，能够达到准确定量。以加标回收率试验评估方法的准确性，结果显示，抗菌药物的加标回收率为87.49％-105.71％之间，5次重复试验的RSD在0.51％-6.17％，准确度良好。
方法的重现性结果表明，抗菌药物批内精密度为2.87～13.64％，批间精密度为3.17～11.93％，方法的重现性良好。实验为了得到更加稳定且灵敏度高的目标物信号，考察了不同流动相及电解质的种类和浓度，并尽可能实现化合物和基质干扰的基线分离，且建立的血清样品前处理过程非常简单，蛋白沉淀一步到位，血清用量仅50μL。
总之，该方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程简单，5min之内完成化合物的分离和检测，准确度及精密度满足要求，可用于临床上血清抗菌药物的定量分析，为相关的药物浓度监测提供一种可靠的检测方法。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。