阅读说明：本技术 T7EI-like核酸酶反应缓冲体系、DNA错配检测方法及应用 (T7EI-like nuclease reaction buffer system, DNA mismatch detection method and application ) 是由 范三红 单丽伟 胡小平 于 2020-06-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种T7EI-like核酸酶反应缓冲体系、DNA错配检测方法及应用,涉及一种T7EI-like核酸酶的反应缓冲溶液配方,以及利用该缓冲体系增强该类核酸酶错配识别切割能力的应用。常规的反应缓冲体系中,T7EI-like核酸酶对插入缺失(InDel)导致的错配DNA具有较好的识别切割能力,而对单核苷酸多态性(SNP)导致的错配DNA的识别切割能力较差；本发明的反应缓冲体系中,T7EI-like核酸酶对两类错配DNA均有良好的识别切割能力。该反应缓冲体系的核心在于其特定的缓冲溶质配比、去垢剂浓度、二价金属离子及辅助蛋白配比。该发明可应用于基因编辑效率的检测、DNA样品中错误序列的消除、基因编辑个体的筛查、样本中InDel和SNP位点的检测筛选、将InDel和SNP位点转化为分子标记进行分子辅助育种。(The invention discloses a T7EI-like nuclease reaction buffer system, a DNA mismatch detection method and application, and relates to a reaction buffer solution formula of T7EI-like nuclease and application for enhancing the mismatch recognition cutting capability of the nuclease by using the buffer system. In a conventional reaction buffer system, T7EI-like nuclease has better recognition and cutting capabilities on mismatched DNA caused by insertion deletion (InDel), and has poorer recognition and cutting capabilities on mismatched DNA caused by Single Nucleotide Polymorphism (SNP); in the reaction buffer system, T7EI-like nuclease has good recognition and cutting capacity on two types of mismatched DNA. The core of the reaction buffer system is the specific mixture ratio of buffer solute, the concentration of detergent, the mixture ratio of divalent metal ions and auxiliary protein. The invention can be applied to the detection of gene editing efficiency, the elimination of error sequences in DNA samples, the screening of gene editing individuals, the detection and screening of InDel and SNP sites in samples, and the conversion of the InDel and SNP sites into molecular markers for molecular assisted breeding.)

T7EI-like核酸酶反应缓冲体系、DNA错配检测方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及分子生物学、基因工程和生物技术应用，具体涉及一种增强T7EI-like核酸酶错配切割能力的方法及应用。

背景技术

物种和个体之间的差异由其基因组和基因序列中的差异决定，快速筛选判断同源序列之间是否存在差异及差异的实质是分子生物学研究和生物技术领域重要议题，相关研究方法和技术不仅在医学和农业领域具有广泛的应用前景，同时具有巨大的市场价值。

无论是自然进化、人工诱变或者定向编辑产生的同源序列变异，其序列间的差异可分为***缺失(InDel)和单核苷酸多态性(SNP)两大类。如何检测不同个体间同源序列间是否存在差异？目前主流的方法有三种：其一是PCR+电泳法，首先通过PCR扩增获得目标DNA片段，然后通过高分辨率电泳检测序列长度和序列本身是否存在差异，长片段的InDel型差异相对容易检测，如果InDel的长度过短，需要通过极高分辨率的测序胶才能分辨，SNP型的差异需要通过变性电泳分析单链构象多态性(SSCP)，该技术操作难度则更大。其二是PCR+错配切割法，同样先进行PCR扩增，然后将待检测DNA片段和已知DNA片段进行变性退火，如果两序列间存在差异，则会形成错配，然后加入特异识别错配位点的核酸酶进行切割，该方法通过特异酶的切割，将错配信号进行转化。常用于错配识别的核酸酶包括来自T7噬菌体的T7EI(T7 endonuclease I)和芹菜的CEL I核酸酶，前者识别InDel型错配的能力更强，后者识别SNP的能力更好。其三是PCR+测序，通过测序可以最终明确序列之间的差异，但相对成本较前两者要高许多。上述方法各有优缺点，又有各自的应用领域。

T7EI是T7噬菌体基因3的编码产物，是一种多功能结构特异性核酸酶(NP_041972.1)，可以识别并切割Holiday DNA、错配DNA和切刻(nick)DNA。错配DNA包括前面提到的InDel型和SNP型。T7EI识别Holiday DNA的活力最强，其次是InDel型错配，其识别SNP型错配的能力较弱。T7EI还有随机切刻(random nick)活性和切刻位点切割(nick-sitecleavage)活性。P-SSP7EI(P-SSP7 endonuclease I，YP_214193)是由蓝细菌噬菌体P-SSP7基因3编码的T7EI同源蛋白，该蛋白具有T7EI类似的Holiday DNA和错配DNA识别和切割活性，但其nick-site切割活性与T7EI具有很大差异[5]。

T7EI自发现以后便应用于突变检测，随着人们对序列变异检测需求的不断增加，基因编辑技术的兴起，其应用更加广泛。目前市面上既有单独销售的T7EI，也有基于该酶开发的各种试剂盒。如NEB公司基于该酶开发的基因编辑检测试剂盒EnGen MutationDetection Kit，Clonetech公司开发的Guide-it InDel Identification Kit。

T7EI是一种多功能核酸酶，虽然目前该酶广泛应用于突变筛查检测，但该酶的一些特征影响了该酶的应用。首先该酶对不同错配底物的识别效率存在明显差异，其对Holiday DNA识别切割效率最高，其次是InDel型错配，其对SNP型错配的识别效果较差，而且对错配碱基的类别具有一定偏好性[3]。在实际应用中InDel和SNP型错配是同时存在的，使得检测结果容易遗漏SNP型差异，即便检测出部分SNP型差异，结果也具有偏向性。其次T7EI除了能特异识别序列中的特异结构并从该位点对DNA进行切割外，还具有非专一性的随机切刻活性和切刻位点切割活性，这意味着即便序列里不存在错配，DNA也会被该活性缓慢降解，这种活性在错配检测反应中应该被抑制或消除。

发明内容

T7EI-like核酸酶在错配切割反应中对SNP型错配识别能力低，且具有碱基偏好性；同时该酶具有随机降解任意DNA的能力，该能力会影响错配识别切割效果。为了解决T7EI-like核酸酶在错配DNA检测面临的上述问题，本发明提供了一种提高T7EI-like核酸酶识别切割错配DNA的方法和反应缓冲体系，提高和拓展T7EI-like核酸酶在突变检测、筛查、追踪中的应用。

为克服T7EI-like核酸酶应用中的上述问题，本发明采取如下技术方案：

本发明公开了一种T7EI-like核酸酶的反应缓冲体系：

一种T7EI-like(T7 endonuclease I-like)核酸酶反应缓冲体系，包括T7EI-like核酸酶，提供缓冲能力的Tris-HCl和Tris-Ac，增强酶蛋白分散度的去垢剂Triton X-100和Tween-20，参与底物结合和催化的金属离子Mg²⁺、Co²⁺、Mn²⁺等，包括增强酶稳定性的BSA等非特异蛋白，包括抵消非特异性切割活力的DNA ligase等。

上述T7EI-like核酸酶包括T7EI(T7 endonuclease I)及P-SSP7EI(P-SSP7endonuclease I)及其同源蛋白；上述蛋白可以来自商品化产品，可以通过表达纯化获得，可以是酶蛋白本身，也可以是T7EI-like蛋白的融合蛋白，如麦芽糖结合蛋白(MBP)融合的T7EI，应用前需要对其活力进行标定；

所述缓冲能力提供者为Tris-HCl或Tris-Ac或其它缓冲剂，缓冲试剂的终浓度为20～50mM，pH在7.4～9.0之间；

所述增强酶蛋白分散度的去垢剂包括Triton X-100和Tween-20，Triton X-100的浓度为0.1～0.5％，Tween-20的浓度为0.02～0.1％；

所述参与底物结合和催化的金属离子包括Mg²⁺、Co²⁺、Mn²⁺等，其浓度为2～10mM；

所述增强酶稳定性的非特异蛋白为BSA等，浓度为10～100ng/ml；

所述抵消T7EI-like核酸酶非特异性切割活力的蛋白主要为DNA ligase，如T4-ligase，Taq-ligase，Ecoli-ligse等，需要加入各种ligase对应的底物，如ATP或NAD⁺。

应用上述增强的T7EI-like核酸酶错配识别切割反应缓冲体系时，首先需要对检测的DNA样品进行前处理，前处理主要的目标是形成错配DNA，并去除原来缓冲体系中的各种物质。前处理通常涉及变性退火和DNA沉淀两个步骤，第一步用于形成错配DNA，第二步用于去除原来缓冲体系中的各种缓冲试剂、离子和蛋白。随后加入本发明公布的缓冲液和T7EI-like核酸酶，在酶的最适反应温度(如37℃)温浴适当时间(如20～30分钟)，然后利用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，根据电泳结果判断原来的DNA样品中是否存在错配。

上述方法是一种通用的错配DNA检测方法，可应用于各种领域，如基因编辑效率的检测，基因编辑个体的筛选，特定已知变异筛查，DNA中是否存在变异的发现、Tilling中利用T7EI-like核酸酶和该反应体系替代芹菜CEL I核酸酶筛选已知基因的不同变异，分子育种中利用该技术可以将任意的InDel和SNP变异转化为分子标记，在后代中对特定基因型进行追踪，从而实现分子辅助的基因聚合和分子设计。

本发明的突出优点在于：

本发明公开的T7EI-like核酸酶反应缓冲体系，可以显著提高T7EI-like核酸酶识别切割SNP型错配DNA的能力，克服T7EI-like核酸酶在突变检测中的不足，拓展T7EI-like核酸酶的应用。

本发明公开的技术方法可以降低T7EI非特异切割DNA的能力，突显其识别切割错配DNA的能力。

附图说明

图1为增强的T7EI-like核酸酶错配识别切割反应体系的基本应用流程。

图2为普通和增强型反应缓冲中T7EI识别不同错配的电泳分析结果。

具体实施方式

为使本发明的方案具体公开，以下仅以实施例以及附图作为辅助说明，应当理解，其不做为对本发明的进一步限制。

需要说明的是：本发明所述T7EI-like核酸酶，包括目前研究较为透彻、来自于大肠杆菌T7噬菌体的T7 endonuclease I(T7EI)核酸酶，以及与T7EI核酸酶同源且催化特性类同的其它核酸酶，例如；来自耶尔森氏菌噬菌体phiA1122的phiA1122 endonuclease I(phiA1122EI)核酸酶。包括来自蓝细菌P-SSP7噬菌体的P-SSP7 endonuclease I(P-SSP7EI)核酸酶，以及与P-SSP7EI核酸酶同源且催化特性类同的其它核酸酶，例如来源于蓝细菌噬菌体Syn5的Syn5 Endonuclease I(Syn5EI)。之所以将T7EI和P-SSP7EI分别列出，是因为两者虽然同源且催化特性类同，但序列一致度仅有30％左右，容易被归为两类核酸酶。上述蛋白可以来自商品化产品，可以通过表达纯化获得，可以是酶蛋白本身，也可以是T7EI-like蛋白的融合蛋白，如麦芽糖结合蛋白(MBP)融合的T7EI，应用前需要对其活力进行标定。

另外，本发明所述缓冲试剂的终浓度，其中终浓度就是各组分在最后混好之后的最终浓度。

该发明公开技术的基本应用流程如图1所示，具体实施例如下：

实施例1.

本实施例提供一种T7EI-like核酸酶的反应缓冲体系：包括T7EI-like核酸酶，提供缓冲能力的Tris-HCl和Tris-Ac，增强酶蛋白分散度的去垢剂Triton X-100和Tween-20，参与底物结合和催化的金属离子Mg²⁺、Co²⁺、Mn²⁺等，包括增强酶稳定性的BSA等非特异蛋白，包括抵消非特异性切割活力的DNA ligase等。

上述T7EI-like核酸酶包括T7EI(T7 endonuclease I)及P-SSP7EI(P-SSP7endonuclease I)及其同源蛋白；上述蛋白可以来自商品化产品，可以通过表达纯化获得，可以是酶蛋白本身，也可以是T7EI-like蛋白的融合蛋白，如麦芽糖结合蛋白(MBP)融合的T7EI，应用前需要对其活力进行标定；

所述缓冲能力提供者为Tris-HCl或Tris-Ac或其它缓冲剂，缓冲试剂的终浓度为20～50mM，pH在7.4～9.0之间；

所述增强酶蛋白分散度的去垢剂包括Triton X-100和Tween-20，Triton X-100的浓度为0.1～0.5％，Tween-20的浓度为0.02～0.1％；

所述参与底物结合和催化的金属离子包括Mg²⁺、Co²⁺、Mn²⁺等，其浓度为2～10mM；

所述增强酶稳定性的非特异蛋白为BSA等，浓度为10～100ng/ml；

所述抵消T7EI-like核酸酶非特异性切割活力的蛋白主要为DNA ligase，如T4-ligase，Taq-ligase，Ecoli-ligse等，需要加入各种ligase对应的底物，如ATP或NAD⁺。

具体应用时，可以配置成10×或2×的T7EI-like核酸酶反应缓冲液。例如2×反应缓冲液包括：40mM Tris-HCl或Tris-Ac pH 8.0,10mM MnCl₂或MgCl₂或CoCl₂，0.2mg/mlBSA,0.2％Triton X-100和0.04％Tween-20。

实施例2

本实施例提供一种DNA错配识别的方法，用到了实施例1的反应缓冲体系，增强T7EI-like核酸酶切割能力，包括以下步骤：

按照实施例1的方法配制好反应缓冲液后，首先进行样品的预处理：将PCR产物或PCR产物混合物进行变性退火。变性退火的流程如表1所示。然后进行沉淀复溶，加入1/10体积3M醋酸钾溶液(pH 5.2)，加入2倍体积预冷的无水乙醇，冰上放置30min，13000g 4℃离心10min，小心弃上清，加入1ml 70％乙醇洗涤沉淀，13000g 4℃离心10min，小心弃上清，室温晾干，加入TE缓冲溶解沉淀得到错配底物。如果检测的错配的类型为InDel型，沉淀复溶的步骤可以省略。

表1变性退火流程

接着是错配底物的识别切割：在20ul反应缓冲体系中依次加入错配底物、2×反应缓冲液，ddH₂O，最后加入T4 ligase和T7EI。T4 ligase依据具体情况可加，也可不加。

将上述反应体系置于37℃水浴或金属浴，温浴30分钟，具体时间依据错配DNA的量，T7EI-like核酸酶的活性进行调节。图2比较了普通和增强的反应缓冲液中T7EI识别不同错配底物的识别切割效果。图中使用了4种SNP型错配底物(泳道1-4)和4种InDel型错配底物(泳道5-8)，从图中可以明显的看出，普通缓冲液中T7EI能很好地识别切割4种InDel型错配，但仅对C:C或G:G SNP型错配有较好识别，对其余三种SNP型错配不能进行有效切割。而本发明公布的增强型反应缓冲液中T7EI对4种SNP和4种InDel型错配均能进行识别和切割，获得明确的易于判断的分析结果。

实施例3

本实施例公开一种增强反应缓冲体系在各种实际场景中的应用。

场景1：

在基因编辑效率分析时，首先进行PCR扩增、变性退火、沉淀复溶后，按照实施例2中的操作进行酶切，然后利用凝胶电泳进行分离，用凝胶成像软件对电泳条带的亮度进行分析，以其为基础计算出基因编辑的效率。计算公式如下：

编辑效率(％)＝100x[1-(1-可切割DNA比例)^1/2]

由于在本发明公布的反应缓冲体系中T7EI-like核酸酶能更好识别SNP型错配，因而获得的可切割DNA比例更准确，以其为基础的基因编辑效果评价也更精确。

场景2：

基因编辑个体的筛选。候选的基因编辑个体存在三种情况，一种是发生编辑处于纯合态，一种是没有发生编辑处于纯合态，一种是发生编辑但处于杂合态。如果要判断是否编辑，将候选编辑个体目标基因扩增片段和参考个体目标基因扩增片断相混合，进行变性退火、沉淀复溶，然后加入增强反应缓冲液，加入T7EI-like核酸酶进行切割，如果电泳检测发生切割则发生编辑，如果没有切割则编辑不成功。如果要检测编辑是否纯合，直接将候选个体扩增片段进行变性退火和后续流程，如果能被T7EI-like核酸酶切割，则为杂合型基因编辑个体。同样由于增强的反应缓冲液可以避免SNP型的变异被遗漏，因而可以发现更多的基因编辑个体。

场景3：

在自然突变和其它人工变异检测中的应用。理论上任意的InDel和SNP变异均可通过上述流程进行检测，至于这种检测的目的是为了发现特定基因的变异，还是追踪特异基因中的变异则与研究的目的有关。基本的操作流程仍是变性退火、沉淀复溶，加入增强的反应缓冲液和T7EI-like核酸酶进行酶切鉴定。利用上述体系可将所有的InDel和SNP型变异转化为分子标记，用于基因和性状的追踪和整合，应用于分子设计育种。