阅读说明：本技术 头孢拉定中乙酰乙酸甲酯的检测方法 (Method for detecting methyl acetoacetate in cefradine ) 是由 王付荣 吴辉 李丹 于 2020-06-24 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种头孢拉定中杂质乙酰乙酸甲酯的检测方法,采用GC外标法对头孢拉定中的乙酰乙酸甲酯进行定性和定量分析,实验操作简捷,分析检测过程中用水做溶剂,无污染,色谱峰无干扰,峰型对称,方法学验证结果均符合要求,说明本检测方法专属性好,灵敏度高,定量准确；本发明提供的检测方法适用于头孢拉定中的乙酰乙酸甲酯的检测,便于规模化生产和质控过程中产品质量的控制。(The invention provides a method for detecting impurity methyl acetoacetate in cefradine, which adopts a GC external standard method to carry out qualitative and quantitative analysis on methyl acetoacetate in cefradine, has simple and convenient experimental operation, uses water as a solvent in the analysis and detection process, has no pollution, has no interference on chromatographic peaks, has symmetrical peak patterns and meets the requirements of methodological verification results, and shows that the detection method has good specificity, high sensitivity and accurate quantification; the detection method provided by the invention is suitable for detecting the methyl acetoacetate in the cefradine, and is convenient for large-scale production and product quality control in the quality control process.)

头孢拉定中乙酰乙酸甲酯的检测方法

技术领域

本发明属于药物杂质检测领域，具体涉及头孢拉定中有关物质乙酰乙酸甲酯的检测方法。

背景技术

头孢拉定化学名称：(6R,7R)-7-[(R)-2-氨基-2-(1,4-环己二烯-1-基)乙酰氨基]-3-甲基-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸，分子式：C₁₆H₁₉N₃O₄S，分子量：349.40。其结构式为：

头孢拉定为β-内酰胺类抗生素，用于敏感菌所致的急性咽炎、扁桃体炎、中耳炎、支气管炎和肺炎等呼吸道感染、泌尿生殖道感染及皮肤软组织感染等。为保证头孢拉定的质量和药效，对其进行有关物质检测和控制具有很大必要性。

目前，ChP、USP、BP等各国药典对头孢拉定有关物质的检测方法均有收载，有关物质检测方法均采用反相高效液相色谱法。

在实际操作过程中，发现现有方法存在以下不足：

(1)乙酰乙酸甲酯的紫外吸收很弱，采用药典中头孢拉定有关物质的反相高效液相色谱检测方法检测，灵敏度低；

(2)乙酰乙酸甲酯色谱峰拖尾严重，峰形差，含量测定结果不准确，用于大规模生产过程中头孢拉定的质量控制时，反相高效液相色谱法含量测定结果误差较大。

发明内容

在本申请发明人对头孢拉定的相关研究中，发现其中副产物可能有乙酰乙酸甲酯，该物质紫外吸收很弱，而且沸点高，不易气化，检测难度较大，为保证原料药质量，需严格控制该杂质含量。而目前尚无文献报道头孢拉定中乙酰乙酸甲酯的检测方法。为了在原料药研究中明确控制其中杂质含量，并使杂质含量可控，本发明提供检测和控制乙酰乙酸甲酯杂质的方法。

本发明提供了头孢拉定中乙酰乙酸甲酯的检测方法，采用GC进行头孢拉定中杂质的定量和/或定性分析，其中，升温程序为：初始温度35～50℃，维持5～10分钟，以每分钟15～25℃的速率升温至140～180℃，维持10～20分钟。

进一步地，还包括以下色谱条件：

色谱柱：以聚乙二醇为固定液的毛细管柱，或极性相近的色谱柱；

检测器：火焰离子化检测器FID；

载气：氮气；

检测器温度：220～250℃；

进一步地，所述杂质为乙酰乙酸甲酯，其结构式如下：

进一步地，采用将供试品溶液与对照品溶液分别直接进样，进样口温度为180～250℃，优选为200℃，检测器温度优选为250℃。

进一步地，进样量为1.0～5.0μl，流速为1.0～5.0ml/min。

进一步地，色谱柱规格为30m×0.530mm，1.00μm，或等效色谱柱，优选为AgilentHP-INNOWAX

进一步地，升温程序为：

起始温度为40℃，维持6分钟，以每分钟20℃的速率升温至150℃，维持12分钟。

进一步地，检测时配制供试品溶液所用溶剂为水，制备供试品溶液时，先将供试样品用适量水溶解，再用水定量稀释至所需浓度。

进一步地，供试品溶液浓度为1～12mg/ml，优选10mg/ml。

进一步地，H₂流速40ml/min，空气流速400ml/min。

进一步地，进样模式为分流进样，分流比为2～20，优选10。

进一步地，进行定量检测时，采用外标法计算。

本发明具有以下有益效果：本方法采用GC外标法对头孢拉定中的乙酰乙酸甲酯进行定性和定量分析，从系统适用性和专属性、检测限和定量限、线性和范围、精密度、准确度和耐用性等方面对本检测方法进行充分验证，验证结果均符合要求。说明本检测方法灵敏度高，定量准确。适用于头孢拉定中杂质乙酰乙酸甲酯的检测，便于生产和质控过程中产品质量的控制。

附图说明

图1为本发明实施例1中所示GC色谱条件图谱-空白溶液、供试品溶液、对照溶液(12.462分钟)、加标供试品溶液(12.463分钟)；

图2为本发明对比例1中所示HPLC色谱条件色谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明所述头孢拉定中有关物质的检测方法作进一步说明。本发明的实施例仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，因此在本发明的方法基础上对本发明的简单改进或替换均属于本发明要求保护的范围。

实施例1

实验仪器及色谱条件：

仪器：岛津GC-2010Pro气相色谱仪；

色谱柱：Agilent HP-INNOWAX(30m×0.530mm，1.0μm，SN：USP465141H)；

柱温：起始柱温40℃，维持6分钟，以每分钟20℃的速率升温至150℃，维持12分钟；

进样口温度：200℃；

分流比：10；

氢火焰离子化检测器温度：250℃；

载气(氮气)流速：5.0ml/min；

进样量：1μl。

实施步骤：

溶液配制：以水为空白溶液；精密称取乙酰乙酸甲酯适量，用水溶解并稀释制成浓度约为100μg/ml的溶液，作为乙酰乙酸甲酯对照品贮备液，再精密量取1.0ml，置10ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；精密称取头孢拉定约100mg，置10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密称取头孢拉定约100mg，置10ml量瓶中，精密量入乙酰乙酸甲酯贮备液1.0ml，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为加标供试品溶液。

精密量取空白溶液、对照品溶液、供试品溶液、加标供试品溶液各1μl，分别注入气相色谱仪，记录色谱图，结果见表1及附图1所示。

表1试验结果表

溶液名称	名称	保留时间(min)	峰面积	理论板数
					对照品溶液	乙酰乙酸甲酯	12.462	4006	347520
加标供试品溶液	乙酰乙酸甲酯	12.463	4070	352678

结果显示，空白溶液与供试品溶液均不干扰乙酰乙酸甲酯的检测，加标供试品溶液中乙酰乙酸甲酯的含量能够被准确测定。

实施例2

实验仪器及色谱条件：

仪器：岛津GC-2010Pro气相色谱仪；

色谱柱：Agilent HP-INNOWAX(30m×0.530mm，1.0μm，SN：USP465141H)；

柱温：起始柱温40℃，维持6分钟，以每分钟20℃的速率升温至150℃，维持12分钟；

进样口温度：200℃；

分流比：10；

氢火焰离子化检测器温度：250℃；

载气(氮气)流速：4.8ml/min；

进样量：1μl。

实施步骤：

溶液配制：以水为空白溶液；精密称取乙酰乙酸甲酯适量，用水溶解并稀释制成浓度约为100μg/ml的溶液，作为乙酰乙酸甲酯对照品贮备液，再精密量取1.0ml，置10ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；精密称取头孢拉定约100mg，置10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密称取头孢拉定约100mg，置10ml量瓶中，精密量入乙酰乙酸甲酯贮备液1.0ml，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为加标供试品溶液。

精密量取空白溶液、对照品溶液、供试品溶液、加标供试品溶液各1μl，分别注入气相色谱仪，记录色谱图。试验结果见表2。

表2试验结果表

溶液名称	名称	保留时间(min)	峰面积	理论板数
					对照品溶液	乙酰乙酸甲酯	12.586	3750	343666
加标供试品溶液	乙酰乙酸甲酯	12.587	3823	348463

结果显示，空白溶液与供试品溶液均不干扰乙酰乙酸甲酯的检测，加标供试品溶液中乙酰乙酸甲酯的含量能够被准确测定。

实施例3

实验仪器及色谱条件：

仪器：岛津GC-2010Pro气相色谱仪；

色谱柱：Agilent HP-INNOWAX(30m×0.530mm，1.0μm，SN：USP465141H)；

柱温：起始柱温40℃，维持6分钟，以每分钟20℃的速率升温至150℃，维持12分钟；

进样口温度：200℃；

分流比：10；

氢火焰离子化检测器温度：250℃；

载气(氮气)流速：5.2ml/min；

进样量：1μl。

实施步骤：

溶液配制：以水为空白溶液；精密称取乙酰乙酸甲酯适量，用水溶解并稀释制成浓度约为100μg/ml的溶液，作为乙酰乙酸甲酯对照品贮备液，再精密量取1.0ml，置10ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；精密称取头孢拉定约100mg，置10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密称取头孢拉定约100mg，置10ml量瓶中，精密量入乙酰乙酸甲酯贮备液1.0ml，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为加标供试品溶液。

精密量取空白溶液、对照品溶液、供试品溶液、加标供试品溶液各1μl，分别注入气相色谱仪，记录色谱图。试验结果见表3。

表3试验结果表

溶液名称	名称	保留时间(min)	峰面积	理论板数
					对照品溶液	乙酰乙酸甲酯	12.355	3979	346752
加标供试品溶液	乙酰乙酸甲酯	12.355	3982	362691

结果显示，空白溶液与供试品溶液均不干扰乙酰乙酸甲酯的检测，加标供试品溶液中乙酰乙酸甲酯的含量能够被准确测定。

实施例4

实验仪器及色谱条件：

仪器：岛津GC-2010Pro气相色谱仪；

色谱柱：Agilent HP-INNOWAX(30m×0.530mm，1.0μm，SN：USP465141H)；

柱温：起始柱温38℃，维持6分钟，以每分钟20℃的速率升温至150℃，维持12分钟；

进样口温度：200℃；

分流比：10；

氢火焰离子化检测器温度：250℃；

载气(氮气)流速：5.0ml/min；

进样量：1μl。

实施步骤：

溶液配制：以水为空白溶液；精密称取乙酰乙酸甲酯适量，用水溶解并稀释制成浓度约为100μg/ml的溶液，作为乙酰乙酸甲酯对照品贮备液，再精密量取1.0ml，置10ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；精密称取头孢拉定约100mg，置10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密称取头孢拉定约100mg，置10ml量瓶中，精密量入乙酰乙酸甲酯贮备液1.0ml，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为加标供试品溶液。

精密量取空白溶液、对照品溶液、供试品溶液、加标供试品溶液各1μl，分别注入气相色谱仪，记录色谱图。试验结果见表4。

表4试验结果表

溶液名称	名称	保留时间(min)	峰面积	理论板数
					对照品溶液	乙酰乙酸甲酯	12.592	4218	349937
加标供试品溶液	乙酰乙酸甲酯	12.596	4164	351235

结果显示，空白溶液与供试品溶液均不干扰乙酰乙酸甲酯的检测，加标供试品溶液中乙酰乙酸甲酯的含量能够被准确测定。

实施例5

实验仪器及色谱条件：

仪器：岛津GC-2010Pro气相色谱仪；

色谱柱：Agilent HP-INNOWAX(30m×0.530mm，1.0μm，SN：USP465141H)；

柱温：起始柱温42℃，维持6分钟，以每分钟20℃的速率升温至150℃，维持12分钟；

进样口温度：200℃；

分流比：10；

氢火焰离子化检测器温度：250℃；

载气(氮气)流速：5.0ml/min；

进样量：1μl。

实施步骤：

溶液配制：以水为空白溶液；精密称取乙酰乙酸甲酯适量，用水溶解并稀释制成浓度约为100μg/ml的溶液，作为乙酰乙酸甲酯对照品贮备液，再精密量取1.0ml，置10ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；精密称取头孢拉定约100mg，置10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密称取头孢拉定约100mg，置10ml量瓶中，精密量入乙酰乙酸甲酯贮备液1.0ml，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为加标供试品溶液。

精密量取空白溶液、对照品溶液、供试品溶液、加标供试品溶液各1μl，分别注入气相色谱仪，记录色谱图。试验结果见表5。

表5试验结果表

溶液名称	名称	保留时间(min)	峰面积	理论板数
					对照品溶液	乙酰乙酸甲酯	12.338	3967	341386
加标供试品溶液	乙酰乙酸甲酯	12.339	4017	334989

结果显示，空白溶液与供试品溶液均不干扰乙酰乙酸甲酯的检测，加标供试品溶液中乙酰乙酸甲酯的含量能够被准确测定。

实施例6

实验仪器及色谱条件：

仪器：岛津GC-2010Pro气相色谱仪；

色谱柱：Agilent HP-INNOWAX(30m×0.530mm，1.0μm，SN：US9317412H)；

柱温：起始柱温40℃，维持6分钟，以每分钟20℃的速率升温至150℃，维持12分钟；

进样口温度：200℃；

分流比：10；

氢火焰离子化检测器温度：250℃；

载气(氮气)流速：5.0ml/min；

进样量：1μl。

实施步骤：

溶液配制：以水为空白溶液；精密称取乙酰乙酸甲酯适量，用水溶解并稀释制成浓度约为100μg/ml的溶液，作为乙酰乙酸甲酯对照品贮备液，再精密量取1.0ml，置10ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；精密称取头孢拉定约100mg，置10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密称取头孢拉定约100mg，置10ml量瓶中，精密量入乙酰乙酸甲酯贮备液1.0ml，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为加标供试品溶液。

精密量取空白溶液、对照品溶液、供试品溶液、加标供试品溶液各1μl，分别注入气相色谱仪，记录色谱图。试验结果见表6。

表6试验结果表

溶液名称	名称	保留时间(min)	峰面积	理论板数
					对照品溶液	乙酰乙酸甲酯	12.459	4033	345659
加标供试品溶液	乙酰乙酸甲酯	12.464	4004	343775

结果显示，空白溶液与供试品溶液均不干扰乙酰乙酸甲酯的检测，加标供试品溶液中乙酰乙酸甲酯的含量能够被准确测定。

对比例1

参考BP药典中头孢拉定有关物质的检测方法进行如下试验：

实验仪器及色谱条件：

仪器：岛津液相色谱仪LC-20AT配紫外检测器；

色谱柱：Inertsil ODS-35μm 4.6×150mm；

流速：1.0ml/min；

检测波长：220nm；

柱温：30℃；

进样量：25μl

流动相A：2.72g/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH值为3.0)，

流动相B：甲醇。按下表进行梯度洗脱：

梯度洗脱程序

实施步骤：

溶液配制：精密称取乙酰乙酸甲酯约30mg，置100ml量瓶中，加流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置50ml量瓶中，用流动相A稀释至刻度，摇匀。

精密量取25μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见附图2所示。发现乙酰乙酸甲酯灵敏度低，色谱峰拖尾严重，峰形差，含量测定结果不准确，反相高效液相色谱法不适用于头孢拉定中有关物质乙酰乙酸甲酯的含量测定。