阅读说明：本技术 一种HPLC-APCI/MS检测母乳中rac-OPL对映异构体的方法 (Method for detecting rac-OPL enantiomer in breast milk by HPLC-APCI/MS ) 是由 张兰威 陈玉洁 于 2019-03-06 设计创作，主要内容包括：本发明方法属于食品检测领域,涉及一种检测母乳中9种甘油三酯位置异构体(rac-OPO/rac-OOP,rac-PPO/rac-POP,rac-LaOO/rac-OLaO,和rac-OPL/rac-PLO/rac-POL)的方法。本发明主要包括以下步骤：1)母乳中甘油三酯的定性2)一维反相色谱靶向收集目标甘油三酯分子；3)二维银离子HPLC APCI/MS检测九种位置异构体；4)检测方法在母乳中的应用。本发明方法能够同时检测9种母乳中位置异构体,并且具有操作简单、分离度好,稳定性高等优点。(The invention belongs to the field of food detection, and relates to a method for detecting 9 triglyceride positional isomers (rac-OPO/rac-OOP, rac-PPO/rac-POP, rac-LaOO/rac-OLaO, and rac-OPL/rac-PLO/rac-POL) in breast milk. The invention mainly comprises the following steps: 1) characterization of triglycerides in breast milk 2) targeted collection of target triglyceride molecules by one-dimensional reverse phase chromatography; 3) detecting nine position isomers by two-dimensional silver ion HPLC APCI/MS; 4) the use of the detection method in breast milk. The method can simultaneously detect the position isomers in 9 breast milks, and has the advantages of simple operation, good separation degree, high stability and the like.)

一种HPLC-APCI/MS检测母乳中rac-OPL对映异构体的方法

技术领域

本发明属于脂质检测领域，本发明涉及一种HPLC-APCI/MS检测母乳中1-油酸-2-棕榈酸-3-亚油酸甘油酯(rac-OPL)对映异构体的方法。

背景技术

甘油三酯是母乳脂质最主要的成分，约占母乳脂的97-98%。甘油三酯中脂肪酸的位置分布决定其生理功能。母乳中脂肪酸在甘油三酯中的位置分布并不是随机的，例如70%以上的棕榈酸在Sn-2位，而油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸多分布在Sn-1,3位上。棕榈酸在Sn-2位分布时能够避免棕榈酸与钙离子形成难吸收的皂钙，从而促进棕榈酸和钙离子的吸收。与成年人相比，脂肪在婴儿肠道中的消化吸收存在很大的差异。在婴儿肠道中主要水解甘油三酯的酶为胃脂肪酶、由与胰腺相关的蛋白质2脂肪酶、以及胆盐刺激性水解脂肪酶，而非成年人肠道中的胰腺甘油三酯脂肪酶。其中胃脂肪酶可水解母乳中最高达60%的甘油三酯，且GL脂肪酶具有Sn-3位的特异性。研究表明，甘油三酯在胃中水解的长链脂肪酸能够激活婴儿肠道中胰脂肪酶的活性，从而促进甘油三酯在肠道中的消化吸收。

油酸-棕榈酸-亚油酸甘油酯（OPL）是中国母乳中含量最丰富的甘油三酯，其主要位置异构体为rac-OPL（相对含量高于85%）。然而，rac-OPL对映异构体的检测方法尚未报道。这形成了母乳成分更深层次研究的瓶颈，并为婴幼儿乳粉配方组织更深入仿母乳带来了困难。rac-OPL对映异构体检测方法的建立突破了母乳甘油三酯成分检测的瓶颈，并且操作简单有利于婴幼儿配方乳粉生产过程中的成分监控。

发明内容

发明目的：提供一种母乳中rac-OPL对映异构体单柱二维液相色谱-APCI/MS的方法。

技术问题：1）由于母乳中rac-OPL对映异构体的检测尚未报道。2）利用手性色谱技术解决了rac-OPL对映异构体的检测3）二维色谱法和APCI/MS技术有效排除了母乳中除目标TAGs以外的TAGs的干扰。

技术方案：本发明涉及一种检测母乳中rac-OPL对映异构体的方法。该方法能够排除复杂样品中其他甘油三酯分子的干扰，并能够监测rac-OPL1和rac-OPL2对映异构体的相对含量。满足了操作简单，易于定量的要求。本发明采用的技术方案是：

（1）准确检测母乳中rac-OPL的对映异构体

样品预处理：样品用Folch法提取总脂，提取液旋蒸至干，然后用正己烷定容，过膜备用。甘油三酯一维反相色谱分离过程：HPLCC18反相色谱，根据不同的ECN（碳原子当量）分离样品中的甘油三酯分子，将样品中的甘油三酯分子初步分离。液相梯度洗脱条件见表1：

表1C18非水相液相色谱流动相梯度洗脱条件

甘油三酯定性。采用ESI-MS/MS产生的离子碎片推断甘油三酯分子的结构。并且明确目标甘油三酯分子（OPL）的保留时间。质谱条件如下：ESI离子源，fragmentor：70V，扫描范围：350~1200。目标甘油三酯分子的靶向收集。利用自动收集器，以2min/管的速度收集C18反向色谱的组分，将OPL甘油三酯分子相应保留时间的试管收集起来，氮气吹干备用。

（2）rac-OPL分离为rac-OPL1和rac-OPL2检测方法的建立。

标准溶液配制：用正己烷溶解25mg rac-OPL标准品至25mL容量瓶中，配制成1mg/mL的标准储备液，过膜0.22μm的膜备用。手性色谱液相条件的优化。采用手性色谱柱，配合具有蒸发光散射检测器（ELSD）的高效液相色谱，对1mg/mL的混合标准品，进行检测。蒸发光检测器的条件为：漂移管温度恒定为40℃，喷雾气为氮气，压力为3.5bar。采用正己烷-异丙醇体系分别从流速和流动相梯度，色谱柱温度进行优化，进样体积 10μl。最终手性色谱的液相色谱条件为：0-180min 90% A+10%B.流动相为正己烷，B流动相为正己烷：异丙醇(99:1, v/v)；流速为0.5ml/min。手性色谱HPLC-APCI/MS的检测。采用手性色谱结合APCI/MS检测器再次对1mg/L的混合标准品，进行检测。质谱条件为：APCI离子源，fragmentor：70V，扫描范围：350~1200。

技术效果。本发明可以有效分离rac-OPL的对映异构体rac-OPL1和rac-OPL2。突破了母乳及婴幼儿配方奶粉中脂肪检测的瓶颈，并且利用二维液相色谱和APCI/MS技术能够有效快速获得目标甘油三酯组分，排除其他甘油三酯分子的干扰，实现了母乳等复杂样品中对映异构体的检测，见图1，图2和图3。

附图说明：图1是rac-OPL标准品在手性色谱HPLC-ELSD分析，在本发明的洗脱条件下分离为rac-OPL1和rac-OPL2的图谱；图2为实例中母乳样品用手性HPLC APCI/MS分析，在本发明的洗脱条件下的总离子流图。图3为实例中母乳样品用手性HPLC APCI/MS分析，在本发明的洗脱条件下提取的rac-OPL1和rac-OPL2的色谱图。

具体实施方式

。下面结合具体实施方式，进一步阐明本发明。应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

具体实施例：母乳样品，用刻度吸管移取2ml液体样品，加入40ml氯仿/甲醇（v:v，2:1），涡旋1min，2000rpm离心2min，取下层有机相，水相用20ml氯仿/甲醇（v:v，2:1）1次，合并有机相，旋转蒸干，备用。首先用表1中用的色谱条件将母乳样品中的甘油三酯进行一维分离，然后用手性色谱HPLC APCI/MS进行二维检测。结果表明本发明能够有效将母乳样品rac-OPL对映异构体的色谱峰提取出来，并且获得相对含量。母乳中rac-OPL1和rac-OPL2的相对含量为35.28%和64.72%。