一种检测血清中抗病毒药物的试剂盒
阅读说明：本技术 一种检测血清中抗病毒药物的试剂盒 (Kit for detecting antiviral drugs in serum ) 是由 成晓亮 李美娟 于 2020-06-01 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种检测血清中抗病毒药物的试剂盒,可以一次性对3种常用的抗病毒药物进行检测,灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程简单,5.0分钟之内完成血清中抗病毒药物的分离和检测,准确度与精密度基本满足要求,可用于临床上血清中抗病毒药物的定量分析,为临床上抗病毒药物浓度监测提供简单快速的检测方法。(The invention relates to a kit for detecting antiviral drugs in serum, which can detect 3 common antiviral drugs at one time, has high sensitivity, strong specificity, accuracy and simple pretreatment process, completes the separation and detection of the antiviral drugs in the serum within 5.0 minutes, basically meets the requirements on accuracy and precision, can be used for the quantitative analysis of the antiviral drugs in the serum in clinic, and provides a simple and rapid detection method for the concentration monitoring of the antiviral drugs in the serum in clinic.)
技术领域
本发明属于血液检测技术领域，具体涉及一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗病毒药物的试剂盒，具体药物为：更昔洛韦(Ganciclovir，GCC)、替诺福韦(Tenofovir，TNF)和依非韦仑(Efavirenz，EFV)。
背景技术
病毒是由一个核酸分子与蛋白质构成的非细胞形态，靠寄生生活的介于生命体及非生命体之间的有机物种。病毒可以感染几乎所有具有细胞结构的生命体。依非韦仑是一种HIV-1病毒逆转录酶的非竞争性抑制剂，它是一种非核苷类药物，主要与其他抗病毒药物联用，适用于HIV-1病毒感染的人群，它被认为是一种最具兼容性的一线抗结核药物；依非韦仑在体内浓度的高低决定了治疗是否成功和是否产生中枢神经系统毒性，联合用药时血药浓度变化更大，因此需要对其浓度进行监测。核苷酸类抗病毒药物，这是一类临床上治疗艾滋病、肝炎等病毒性疾病的首选药物，他们的作用靶点为抑制DNA病毒的DNA聚合酶或者RNA病毒的逆转录酶。替诺福韦是一种新型核苷类逆转录酶抑制剂，是治疗HIV和乙肝病毒感染的一线抗病毒药物，其在安全性、有效性、耐受性方面具有很大的优势，但是其生物利用度很差，需要对其浓度进行实时的监测。更昔洛韦也是一种核苷酸类似物，口服更昔洛韦可用于治疗肝炎病毒、人巨细胞病毒(CMV)，单纯疱疹病毒(HSV)等感染。随着抗病毒药物引起的耐药和毒副作用等药物性疾病的不断增加，在使用药物时需要对病人的需要浓度进行监测，从而保证疗效、降低毒副作用、实现个性化给药和治疗。
目前针对抗病毒药物体内浓度检测的方法主要有高效液相色谱法、超高效液相-串联质谱法，也有专利报道(专利号CN 110361483 A)公开了“一种UPLC/MS-MS联用检测人血清中替诺福韦的方法”，该方法样本量需要大，只针对一种药物替诺福韦进行检测，存在单个样品分析时间长、线性范围不适宜等缺点。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种检测血清中抗病毒药物的试剂盒。
本发明的另一个目的是提供上述试剂盒在利用超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗病毒药物的应用。
本发明的技术方案如下：
一种检测血清中抗病毒药物的试剂盒，
所述抗病毒药物分别为：更昔洛韦(GCC)、替诺福韦(TNF)和依非韦仑(EFV)；
所述抗病毒药物对应的内标物分别为：更昔洛韦-d5(GCC-d5)、替诺福韦-d6(TNF-d6)和依非韦仑-d5(EFV-d5)；
所述的试剂盒包含如下试剂：
(1)洗脱液：
洗脱液A：0.01％～0.2％甲酸-1～5mM乙酸铵水溶液；洗脱液B：乙腈；
(2)校准品溶液：
将包含有更昔洛韦(GCC)200000ng/mL、替诺福韦(TNF)40000ng/mL和依非韦仑(EFV)200000ng/mL的混合标准储备溶液以空白血清基质配制成七个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的七个浓度点为：
更昔洛韦(GCC)和依非韦仑(EFV)的浓度相同，其七个浓度点为依次为：50ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、2500ng/mL、5000ng/mL、10000ng/mL；
替诺福韦(TNF)的七个浓度点为依次为：10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL；
(3)混合内标溶液：
包含有更昔洛韦-d5 5000ng/mL、替诺福韦-d6 10000ng/mL和依非韦仑-d515000ng/mL的甲醇溶液；
(4)蛋白沉淀剂：
甲醇、乙腈与异丙醇混合溶液；
(5)质控品：
含有抗病毒药物的空白血清基质，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，其中，
QC(L)为上述混合标准储备溶液以空白血清基质稀释至2000倍；
QC(M)为上述混合标准储备溶液以空白血清基质稀释至200倍；
QC(H)为上述混合标准储备溶液以空白血清基质稀释至50倍。
在一种优选方案中，上述洗脱液A为0.1％～0.15％甲酸-1～2.5mM乙酸铵水溶液，优选为0.1％甲酸-2mM乙酸铵水溶液。
在一种方案中，蛋白质沉淀剂中甲醇、乙腈与异丙醇的体积比1～5:1:1～2；优选地，蛋白质沉淀剂中甲醇、乙腈与异丙醇的体积比1:1:1。
在一种方案中，空白血清基质为不含抗病毒目标药物的空白血清。
本发明提及的混合标准储备溶液按照如下方法制备：
将上述抗病毒药物配制成如下浓度的标准品母液：更昔洛韦20mg/mL、替诺福韦10mg/mL和依非韦仑20mg/mL；
分别移取各标准品母液：更昔洛韦10μL、替诺福韦4μL和依非韦仑10μL；再加入至976μL甲醇中得到1mL混合标准储备溶液。
本发明提及的混合内标溶液按照如下方法制备：
以甲醇配制如下同位素内标母液：更昔洛韦-d5 1mg/mL、替诺福韦-d6 0.5mg/mL和依非韦仑-d5 1mg/mL；
分别移取各同位素内标母液：更昔洛韦-d5 5μL、替诺福韦-d6 20μL和依非韦仑-d5 15μL；再加入至960μL甲醇中得到1mL混合内标溶液；其中，更昔洛韦-d5 5000ng/mL、替诺福韦-d6 10000ng/mL和依非韦仑-d5 15000ng/mL；
本发明提及的血清为人或动物的血清。
在一种优选方案中，一种检测血清中抗病毒药物的试剂盒包含如下试剂：
(1)洗脱液：
洗脱液A：0.1％甲酸-2mM乙酸铵水溶液；洗脱液B：乙腈；
(2)校准品溶液：
将上述抗病毒药物配制成如下浓度的标准品母液：更昔洛韦20mg/mL、替诺福韦10mg/mL和依非韦仑20mg/mL；
分别移取各标准品母液：更昔洛韦10μL、替诺福韦4μL和依非韦仑10μL；再加入至976μL甲醇中得到1mL混合标准储备溶液；浓度参下表1。
表1混合标准品储备溶液
本发明将混合标准品储备液以空白血清基质(不含抗病毒目标药物的空白血清)配制成七个不同浓度点的校准品溶液，配制过程如下：
取10μL混合标准品储备液加入至190μL空白血清基质中作为第一个高值浓度点；取第一高值浓度点用等体积空白血清基质稀释得第二高值浓度点；取第一高值浓度点用3倍体积空白血清基质稀释得第三高值浓度点；取第二高值浓度点用9倍体积空白血清基质稀释得第四高值浓度点；取第三高值浓度点用9倍体积空白血清基质稀释得第五高值浓度点；取第四高值浓度点用4倍体积空白血清基质稀释得第六高值浓度点；取第五高值浓度点用4倍体积空白血清基质稀释得第七高值浓度点。
本发明采用梯度稀释法进行标曲配制，从-20℃冰箱取出标准溶液后，涡旋10s，2min内使用标准溶液配制标曲最高浓度点，配制好后-80℃保存，具体过程如下表2(单位：ng/mL)。
表2标曲配制
(3)混合内标溶液：
以甲醇配制如下同位素内标母液：更昔洛韦-d5 1mg/mL、替诺福韦-d6 0.5mg/mL和依非韦仑-d5 1mg/mL；
分别移取各同位素内标母液：更昔洛韦-d5 5μL、替诺福韦-d6 20μL和依非韦仑-d5 15μL；再加入至960μL甲醇中得到1mL混合内标溶液；浓度参考下表3。
表3混合内标溶液配制
(4)蛋白沉淀剂：
甲醇、乙腈与异丙醇混合溶液，其中甲醇、乙腈与异丙醇的体积比为1:1:1；
(5)质控品：
取上述混合标准储备溶液以不含抗病毒目标药物的空白血清配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，其中，具体如表4所示。
表4抗病毒药物质控品对应浓度(单位ng/mL)
QC(L)中包含：更昔洛韦(GCC)100ng/mL、替诺福韦(TNF)20ng/mL和依非韦仑(EFV)100ng/mL。
QC(M)中包含：更昔洛韦(GCC)1000ng/mL、替诺福韦(TNF)200ng/mL和依非韦仑(EFV)1000ng/mL。
QC(H)中包含：更昔洛韦(GCC)4000ng/mL、替诺福韦(TNF)800ng/mL和依非韦仑(EFV)4000ng/mL。
采用本发明的试剂盒，检测血清中抗病毒药物时，将混合内标溶液与蛋白质沉淀剂进行混合制备含内标的蛋白质沉淀剂。在一种优选方案中，混合内标溶液与蛋白沉淀剂的体积比为0.1～0.3:19.9～19.7。在一种更优选方案中，混合内标溶液与蛋白沉淀剂的体积比为0.2:19.8(1:99)。例如，含内标的蛋白沉淀剂是由混合内标溶液与蛋白沉淀剂(甲醇、乙腈与异丙醇的体积比为1:1:1)以体积比为1:99混合配制而成。
上述试剂盒在利用超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗病毒药物的应用也在本发明的保护范围之内。
具体检测方法如下：
一种检测检测血清中抗病毒药物浓度的方法，
所述抗病毒药物分别为：更昔洛韦(GCC)、替诺福韦(TNF)和依非韦仑(EFV)；
所述抗病毒药物对应的内标物分别为：更昔洛韦-d5(GCC-d5)、替诺福韦-d6(TNF-d6)和依非韦仑-d5(EFV-d5)；
血清样本通过蛋白沉淀后，振荡、离心取上清进样，采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血清中的上述抗病毒药物，先利用超高效液相色谱将待测物与血清基质分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算上述抗病毒药物的含量，具体色谱条件为：
(1)超高效液相色谱条件：
流动相A：0.01％～0.2％甲酸-1～5mM乙酸铵水溶液；流动相B：乙腈；
色谱柱型号：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×100mm,1.7μm)；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱的方式，所述流动相A和流动相B的初始比例为90～100:10～0；所述梯度洗脱过程如下：在0-1.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由初始比例匀速渐变至70:30；在1.0-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至10:90；在3.0-5.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由10:90匀速渐变至初始比例；每个样品采集时间为5.0分钟；
(2)质谱条件：
在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，喷雾电压为3.0kV(ESI+)；源温度为150℃；雾化气温度为为500℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测了各目标物及其对应同位素内标。
为了改善色谱分离选择性，可以考虑调节流动相的极性。本发明在流动相A中添加了甲酸和乙酸铵，可有效提高某些目标化合物的离子化效率，在其他条件的配合下，较现有技术中采用LC-MS/MS方法检测血清中抗病毒药物的灵敏度更高，前处理过程简单，成本低，且灵敏度高、特异性强，5分钟之内完成抗病毒药物的分离和检测。在一种优选方案中，流动相A为0.1％～0.15％甲酸-1～2.5mM乙酸铵水溶液，在不影响本发明效果的情况下，优选地，流动相A为0.1％甲酸-2mM乙酸铵水溶液。
在色谱法中，色谱柱的选择十分重要，对色谱柱的要求：柱效高、选择性好，分析速度快等。本发明采用乙腈和0.01％～0.2％甲酸-1～5mM乙酸铵水溶液作为流动相，色谱柱型号为ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×100mm，1.7μm)，在其他条件的配合下，内源性物质不干扰样品的测定，灵敏度高、特异性强，准确度和精密度基本满足要求。
在采用内标法时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中去，和被分析的样品有基本相同或尽可能一致的物理化学性质、色谱行为和响应特征；在色谱分析条件下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。本发明分别采用更昔洛韦-d5(GCC-d5)、替诺福韦-d6(TNF-d6)和依非韦仑-d5(EFV-d5)作为内标，氘代内标和待测物具有相同的保留时间、化学性质和基质效应，测定血清中的抗病毒药物时的重现性、准确度均较好。
在一种优选方案中，流动相A和流动相B的初始比例为95～99:5～1。进一步优选地，流动相A和流动相B的初始比例为97:3。
在一种优选方案中，流速为0.2～0.5mL/min，优选为0.3mL/min。
进一步地，柱温为30～50℃，优选为45℃。
在一种方案中，进样体积为0.2～5μL，优选为1μL。
在一种优选方案中，采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血清中的上述抗病毒药物时，具体色谱条件为：
(1)超高效液相色谱条件：
流动相A：0.1％甲酸-2mM乙酸铵水溶液；流动相B：乙腈；
色谱柱型号：A CQUITY UPLC BEH C18(2.1×100mm,1.7μm)；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱的方式，所述流动相A和流动相B的初始比例为97:3；所述梯度洗脱过程如下：在0-1.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由97:3匀速渐变至70:30；在1.0-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至10:90；在3.0-5.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由10:90匀速渐变至97:3；每个样品采集时间为5.0分钟；梯度洗脱方式具体见表5；流速为0.3mL/min，柱温为45℃，进样体积为1μL。
表5流动相梯度洗脱参数
(2)质谱条件：
在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，喷雾电压为3.0kV(ESI+)；源温度为150℃；雾化气温度为为500℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；质谱源参数如表6所示，同时监测了各目标物及其对应同位素内标，各个目标物的质谱参数见表7。
表6质谱源参数
表7抗病毒药物检测质谱参数
本发明提及的血清为人或动物的血清。
本发明提及的经过预处理的血清按照如下方法制备：向血浆中加入含内标的蛋白沉淀剂，再振荡离心后取上清液；其中，所述蛋白质沉淀剂为甲醇、乙腈与异丙醇混合溶液；优选地，蛋白质沉淀剂中甲醇、乙腈与异丙醇的体积比为1～5:1:1～2。更优选地，蛋白质沉淀剂中甲醇、乙腈与异丙醇的体积比为1:1:1。
在一种优选方案中，本发明提及的经过预处理的血清按照如下方法制备：取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白质沉淀剂(所述蛋白质沉淀剂中甲醇、乙腈与异丙醇的体积比1～5:1:1～2)，振荡3～5min，在12000～15000r/min，1～5℃离心4～10min后，转移离心管中的上清液60μL至塑料内衬管中，待进样；其中含内标的蛋白沉淀剂是由混合内标溶液与蛋白沉淀剂混合配制而成，混合内标溶液与蛋白沉淀剂的体积比为0.1～0.3:19.9～19.7。
在一种更优选方案中，本发明提及的经过预处理的血清按照如下方法制备：取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇、乙腈与异丙醇的体积比为1:1:1),高速振荡5min；在14000r/min，4℃离心5min后；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，待进样，其中含内标的蛋白沉淀剂是由混合内标溶液与蛋白沉淀剂混合配制而成，混合内标溶液与蛋白沉淀剂的体积比为0.2:19.8(即1:99)。
在一种方案中，本发明提及的含内标的蛋白沉淀剂按照如下方法制备：
以甲醇配制如下同位素内标母液：更昔洛韦-d5(GCC-d5)1mg/mL、替诺福韦-d6(TNF-d6)0.5mg/mL和依非韦仑-d5(EFV-d5)1mg/mL；
分别移取各同位素内标母液：更昔洛韦-d5(GCC-d5)5μL、替诺福韦-d6(TNF-d6)20μL和依非韦仑-d5(EFV-d5)15μL；再加入至960μL甲醇中得到1mL混合内标溶液；其中，更昔洛韦-d5 5000ng/mL、替诺福韦-d6 10000ng/mL和依非韦仑-d5 15000ng/mL。
取200uL上述混合内标溶液加入至19.8mL蛋白沉淀剂中，即得含内标的蛋白沉淀剂。
在一种方案中，上述蛋白质沉淀剂为甲醇、乙腈与异丙醇混合溶液；优选地，蛋白质沉淀剂中甲醇、乙腈与异丙醇的体积比为1～5:1:1～2。更优选地，蛋白质沉淀剂中甲醇、乙腈与异丙醇的体积比为1:1:1。
在一种方案中，标准品溶液按照如下方法制备：
将上述抗病毒药物配制成如下浓度的标准品母液：更昔洛韦(GCC)20mg/mL、替诺福韦(TNF)10mg/mL和依非韦仑(EFV)20mg/mL；
分别移取各标准品母液：更昔洛韦(GCC)10μL、替诺福韦(TNF)4μL和依非韦仑(EFV)10μL；再加入至976μL甲醇中得到1mL混合标准储备溶液。在混合标准品储备液中包含：更昔洛韦(GCC)200000ng/mL、替诺福韦(TNF)40000ng/mL和依非韦仑(EFV)200000ng/mL。
将上述混合标准储备溶液以空白血清基质(不含抗病毒目标药物的空白血清)配制成七个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的七个浓度点为：
更昔洛韦(GCC)和依非韦仑(EFV)的浓度相同，其七个浓度点为依次为：50ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、2500ng/mL、5000ng/mL、10000ng/mL；
替诺福韦(TNF)的七个浓度点为依次为：10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL。
每个浓度点样品取50μL于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白质沉淀剂(所述蛋白质沉淀剂中甲醇、乙腈与异丙醇的体积比1:1:1)，振荡5min，在14000r/min，4℃离心5min后，转移离心管中的上清液60μL至塑料内衬管中，待进样，进样量1μL。
本发明还包括制备质控品，质控品按照如下方法制备：取上述混合标准储备溶液以不含抗病毒目标药物的空白血清配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，其中，
QC(L)为上述混合标准储备溶液以空白血清基质稀释至2000倍。
QC(M)为上述混合标准储备溶液以空白血清基质稀释至200倍。
QC(H)为上述混合标准储备溶液以空白血清基质稀释至50倍。
QC(L)中包含：更昔洛韦(GCC)100ng/mL、替诺福韦(TNF)20ng/mL和依非韦仑(EFV)100ng/mL。
QC(M)中包含：更昔洛韦(GCC)1000ng/mL、替诺福韦(TNF)200ng/mL和依非韦仑(EFV)1000ng/mL。
QC(H)中包含：更昔洛韦(GCC)4000ng/mL、替诺福韦(TNF)800ng/mL和依非韦仑(EFV)4000ng/mL。
采用本发明的技术方案，优势如下:
本发明提供的试剂盒检测血清中抗病毒药物时，可以一次性对3种常用的抗病毒药物进行检测，灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程简单，5.0分钟之内完成血清中抗病毒药物的分离和检测，准确度与精密度基本满足要求，可用于临床上血清中抗病毒药物的定量分析，为临床上抗病毒药物浓度监测提供简单快速的检测方法。
附图说明
图1为抗病毒药物标准品的提取离子流谱图；
图2为血清中抗病毒药物的提取离子流谱图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：
一、实验材料与仪器
1.材料
样本来自于北京301医院2019年10月份门诊收集的血清样本。
(1)仪器：Xevo TQ-S三重四级杆质谱仪(Waters Corporation)；UPLC I-Class超高效液相色谱系统(配自动进样器，Waters Corporation)；SCILOGEX D2012高速台式离心机(美国)；超纯水仪(ELGA LabWater，英国)；多管涡旋混合仪(Vortex genie2，美国)；可调移液器(Eppendorf 0.5～10μL，10～100μL，100～1000μL)；玻璃仪器、量筒等。
(2)试剂耗材：MS级甲醇(Fisher，美国)；HPLC级甲醇(Honeywell，美国)；MS级乙腈(Fisher，美国)；HPLC级乙腈(Honeywell，美国)；HPLC级异丙醇(Honeywell，美国)；MS级甲酸(Fisher，美国)；MS级乙酸铵(Sigma，美国)；色谱柱型号：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×100mm,1.7μm)(Waters Corporation)。
(3)标准品：标准品及其对应的内标物，见下表8。
表8标准品和内标
(4)质控品：含有抗病毒药物质的空白血清，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，如表4所示。
二、液质条件
(1)色谱条件：色谱条件：流动相A：0.1％甲酸-2mM乙酸铵水溶液；流动相B：乙腈。色谱柱型号：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×100mm,1.7μm)，采用梯度洗脱的方式，详见表5。流速为0.3mL/min，柱温为45℃，进样体积为1μL。
(2)质谱条件：在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，喷雾电压为3.0kV(ESI+)；源温度为150℃；雾化气温度为500℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；质谱源参数如表6所示，同时监测了各目标物及其对应同位素内标，各个目标物的质谱参数见表7。
二、实验过程
(1)标准品配制：
将上述抗病毒药物配制成如下浓度的标准品母液：更昔洛韦(GCC)20mg/mL、替诺福韦(TNF)10mg/mL和依非韦仑(EFV)20mg/mL。
分别移取各标准品母液：更昔洛韦(GCC)10μL、替诺福韦(TNF)4μL和依非韦仑(EFV)10μL；再加入至976μL甲醇中得到1mL混合标准储备溶液。在混合标准品储备液中包含：更昔洛韦(GCC)200000ng/mL、替诺福韦(TNF)40000ng/mL和依非韦仑(EFV)200000ng/mL。详见表1。
将上述混合标准储备溶液以空白血清基质(不含抗病毒目标药物的空白血清)配制成七个不同浓度点的校准品溶液，详见表2，所述校准品溶液的七个浓度点为：
更昔洛韦(GCC)和依非韦仑(EFV)的浓度相同，其七个浓度点为依次为：50ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、2500ng/mL、5000ng/mL、10000ng/mL。
替诺福韦(TNF)的七个浓度点为依次为：10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL。
(2)混合内标溶液配制
以甲醇配制如下同位素内标母液：更昔洛韦-d5(GCC-d5)1mg/mL、替诺福韦-d6(TNF-d6)0.5mg/mL和依非韦仑-d5(EFV-d5)1mg/mL。
分别移取各同位素内标母液：更昔洛韦-d5(GCC-d5)5μL、替诺福韦-d6(TNF-d6)20μL和依非韦仑-d5(EFV-d5)15μL；再加入至960μL甲醇中得到1mL混合内标溶液。其中，混合内标溶液中包含：更昔洛韦-d5(GCC-d5)5000ng/mL、替诺福韦-d6(TNF-d6)10000ng/mL和依非韦仑-d5(EFV-d5)15000ng/mL。详见表3。
(3)质控品配制：
取上述混合标准储备溶液以不含抗病毒目标药物的空白血清配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，具体如表4所示。
QC(L)中包含：更昔洛韦(GCC)100ng/mL、替诺福韦(TNF)20ng/mL和依非韦仑(EFV)100ng/mL。
QC(M)中包含：更昔洛韦(GCC)1000ng/mL、替诺福韦(TNF)200ng/mL和依非韦仑(EFV)1000ng/mL。
QC(H)中包含：更昔洛韦(GCC)4000ng/mL、替诺福韦(TNF)800ng/mL和依非韦仑(EFV)4000ng/mL。
(4)样品处理
1)标准品前处理：七个不同校准品样本每个浓度点取50μL于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇、乙腈与异丙醇的体积比为1:1:1)，高速振荡5min；在14000r/min，4℃离心5min后；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，待进样。
2)血清样品前处理：取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇、乙腈与异丙醇的体积比为1:1:1),高速振荡5min；在14000r/min，4℃离心5min后；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，待进样。
3)质控品前处理：分别取质控品溶液QC(L)、QC(M)、QC(H)各50μL于1.5mL离心管中，然后与血清样品前处理一致，此处不再赘述。
分析试剂盒中各组分见表9。
表9抗病毒药物浓度分析试剂盒组分的制备
备注：所述含内标的蛋白沉淀剂按照如下方法制备，取200μL上述混合内标溶液加入至19.8mL蛋白沉淀剂中，即得含内标的蛋白沉淀剂。
四、方法验证
1.提取离子流色谱图：抗病毒药物的标准品和血清样品的峰形比较对称，且没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到良好的检测，图1为抗病毒药物标准品的提取离子流谱图；图2为血清样本中抗病毒药物的提取离子流谱图。
2.校准曲线：采用同位素内标定量法，利用TargetLynx软件以标准物与内标物的浓度比为X轴，标准物与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，并计算出血清中待测物的浓度。抗病毒药物在各自浓度范围内的线性拟合方程，线性良好，相关系数在0.99以上，满足定量要求，见表10。
表10抗病毒药物线性回归方程及线性相关系数
序号
化合物
保留时间(min)
线性范围(ng/mL)
线性方程
相关系数(r)
1
GCC
1.08
50-10000
y＝0.00247089*x-0.0129057
0.9981
2
TNF
1.07
10-2000
y＝0.000936988*x+0.0015083
0.9993
3
EFV
2.16
50-10000
y＝0.0153918*x+0.0249297
0.9995
3.准确度考察：采用加标回收率试验评估方法的准确性。准备一混合空白血清样品，分别加入低、中、高3个浓度的标准品，以相同步骤重复处理并测定5次，结果显示，抗病毒药物的加标回收率在86.85％-97.09％之间，5次重复试验的RSD在2.07％-5.74％范围，统计结果见表11。
表11抗病毒药物添加回收率结果
4.精密度试验：取无干扰空白血清样本，加入不同浓度抗病毒药物标准品，得到低、中、高三个浓度血清样本，一天内重复处理6批，连续处理三天，以同位素内标法定量测定抗病毒药物的浓度，批内精密度为1.47～10.50％，三日内分3批处理，计算批间精密度为3.09～7.51％，结果见表12。
表12批内及批间精密度测试结果
五、讨论
本发明建立了ID-UPLC-MS/MS一同测定人体血清中抗病毒药物的方法。血清用量少(仅需50μL)且前处理简单，且一针分析多种物质只需5分钟，简单快速。
采用同位素内标法定量不仅可以极大消除基质干扰，而且结果不受前处理过程、仪器响应波动等条件的影响，能够达到准确定量。以加标回收率试验评估方法的准确性，结果显示，抗病毒药物的加标回收率为86.85％-97.09％之间，5次重复试验的RSD为2.07％-5.74，准确度良好。
方法的重现性结果表明，抗病毒药物批内精密度为1.47～10.50％，批间精密度为3.09～7.51％，方法的重现性良好。且建立的血清样品前处理过程非常简单，蛋白沉淀一步到位，血清用量仅50μL。
总之，本发明检测方法的灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程简单，5分钟之内完成化合物的分离和检测，准确度及精密度满足要求，可用于临床上血清抗病毒药物的定量分析，为相关的药物浓度监测提供一种可靠的检测方法。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。